Abstraktní

Cíl: Zkoumat účinky vzorce obsahujícího Cistanche (nahrazující původní krev vyživující a ledviny tonizující byliny) na expresi transformujícího růstového faktoru- 2 (TGF- 2), remodelaci sklery a transport vody u krys s form-deprivační krátkozrakostí (FDM) regulací kaveolin-1 (CAQPAV1) (CAQPAV1)/aquaporin1 )

Metody: Bylo vybráno 40 samců SD potkanů ​​stupně SPF, z nichž 30 bylo použito k vytvoření modelu FDM. Po úspěšném modelování byly krysy rozděleny do skupiny FDM, skupiny pirenzepinu (PIR) a skupiny vzorce Cistanche, přičemž v každé skupině bylo 10 krys. Zbývajících 10 nemodelovaných krys sloužilo jako normální skupina. Normální skupina a skupina FDM nedostaly žádnou intervenci. Skupina PIR byla léčena očními kapkami PIR dvakrát denně (ráno a večer), zatímco skupině s přípravkem Cistanche byla intragastricky podáván přípravek obsahující přípravek Cistanche. Refrakční vada a axiální délka krys byly detekovány pomocí retinoskopu a diagnostického přístroje. K pozorování morfologických změn sklerální tkáně bylo použito barvení HE. Imunohistochemické barvení bylo použito k detekci exprese TGF- 2 ve sklerální tkáni. Western blot byl použit ke stanovení relativních hladin exprese proteinů AQP1 a CAV1 ve sklerální tkáni. RT-PCR byla provedena za účelem měření relativních úrovní exprese mRNA glutamát-aspartátového transportéru (GLAST) a glutamátového transportéru 1 (GLT-1) ve sklerální tkáni. Výsledky: Ve srovnání s normální skupinou byla refrakční chyba, hladina exprese TGF- 2 a relativní hladiny exprese proteinů AQP1 a CAV1 ve skupině FDM, skupině vzorce Cistanche a skupině PIR významně sníženy, zatímco axiální délka a relativní hladiny exprese mRNA GLAST a GLT-1 mRNA byly významně zvýšeny (všechny P < 0.05). Ve srovnání se skupinou FDM byla refrakční chyba, hladina exprese TGF- 2 a relativní hladiny exprese proteinů AQP1 a CAV1 ve skupině vzorce Cistanche a skupině PIR významně zvýšeny, zatímco axiální délka a relativní hladiny exprese mRNA GLAST a GLT-1 mRNA byly významně sníženy (vše P < 0,05). Ve srovnání se skupinou vzorce Cistanche byla refrakční chyba, hladina exprese TGF- 2 a relativní hladiny exprese proteinů AQP1 a CAV1 ve skupině PIR významně sníženy, zatímco axiální délka a relativní hladiny exprese mRNA GLAST a GLT-1 mRNA byly významně zvýšeny (všechny P < 0,05). Výsledky barvení HE ukázaly, že v normální skupině nebyly žádné abnormální změny ve struktuře každé vrstvy sítnice; sítnice skupiny FDM byla ztenčena a ve vrstvě gangliových buněk se objevily závažné vakuolární změny; tloušťka sítnice u skupiny vzorce Cistanche a skupiny PIR byla zvýšena, uspořádání buněk bylo v zásadě pravidelné, počet gangliových buněk byl zvýšen a buňky v každé vrstvě byly hustě uspořádány, s nejvýznamnějším výkonem ve skupině vzorce Cistanche. Závěr: Vzorec obsahující Cistanche má určitý pozitivní vliv na léčbu FDM a jeho mechanismus může souviset s regulací exprese CAV1, AQP1 a TGF- 2 a také s vyrovnáváním a zlepšováním remodelace skler a funkcí transportu vody.

 

 

BYLINKOVÝ DOPLNĚK CISTANCHE PRO ZLEPŠENÍ FUNKCE LEDVIN

 

 

Klíčová slova

Form-deprivační krátkozrakost; Formule obsahující Cistanche; Transformující růstový faktor- 2; aquaporin 1; Caveolin-1; Sklerální remodelace; Vodní doprava

 

V posledních letech, se změnami v životním stylu lidí a neustálým vývojem elektronických zařízení, výskyt krátkozrakosti stoupá. Jako běžné onemocnění se stalo celosvětovým zdravotním problémem. Form-deprivační myopie (FDM) je zvláštním typem myopie, která je obvykle způsobena deprivací nebo omezením zrakové stimulace očí. FDM nejenže zasahuje do procesu remodelace skléry, ale také vede k abnormálním změnám tvaru oční bulvy a poruchám funkce transportu vody, což může dále zhoršit poškození a deformaci sklerální tkáně. Aquaporin 1 (AQP1) je široce existující protein, jehož hlavní funkcí je podporovat rychlý transport molekul vody přes buněčné membrány. V oku souvisí distribuce a funkce AQP1 s dynamickou rovnováhou nitrooční tekutiny. Caveolin-1 (CAV1) je protein, který se podílí na tvorbě mikrostruktur buněčné membrány a přenosu signálu. V oku je CAV1 přítomen především v buňkách pigmentového epitelu sítnice a fotoreceptorových buňkách a souvisí s přenosem zrakových signálů a stabilitou nitroočního prostředí. Transformující růstový faktor- 2 (TGF- 2) je pleiotropní cytokin s mnoha biologickými účinky, jako je podpora buněčné proliferace, diferenciace a migrace. V nitroočním prostředí hraje TGF- 2 důležitou roli ve vývoji a udržování rohovky a skléry. V současnosti je hlavní léčbou FDM medikamentózní terapie.

V tradiční čínské medicíně (TCM) se předpokládá, že vznik krátkozrakosti souvisí s faktory, jako je nedostatečná čchi a krev a nedostatek ledvinové esence. Ledviny jsou považovány za „vrozený základ“ a úzce souvisí s funkcí očí. TCM tvrdí, že „ledviny řídí esenci a esence vyživuje oči; játra se otevírají do očí a dostatek jaterní krve zajišťuje jasné vidění“. Proto tonizace ledvin a výživa krve byla vždy důležitým terapeutickým principem u očních onemocnění způsobených syndromy nedostatku u TCM.

Cistanche, známý jako „pouštní ženšen“ a jeden z „devíti nesmrtelných léků“ v TCM, má jako léčivá složka více než 2000 letou historii. Cistanche, zaznamenaný jako prvotřídní výživný léčivý materiál ve starověkých klasikách TCM, je vysoce ceněn pro své účinky tonizace ledvin, doplňování esence, vyživování krve a zvlhčující sucho. Na rozdíl od mnoha jiných bylin TCM roste Cistanche výhradně v pouštích, hlavně parazituje na kořenech Tamarix ramosissima v oblastech jako Xinjiang, Vnitřní Mongolsko a Gansu v Číně. Jedinečné pouštní prostředí mu dodává bohaté aktivní složky, včetně echinakosidu, verbascosidu a flavonoidů, u kterých bylo vědecky prokázáno, že mají silné antioxidační vlastnosti, snižují apoptózu buněk a podporují buněčnou proliferaci.

Moderní výzkumy ukázaly, že Cistanche má významné účinky na výživu ledvin. Může snižovat apoptózu ledvinových buněk, podporovat proliferaci ledvinových buněk, opravovat poškozené ledvinové buňky a rozšiřovat ledvinové krevní cévy, čímž zlepšuje funkci ledvin. Kromě toho může Cistanche posilovat imunitu podporou proliferace lymfocytů, odolávat únavě zvýšením produkce jaterního glykogenu a vykazovat účinky proti stárnutí prostřednictvím vychytávání volných radikálů. Tyto biologické aktivity jsou vysoce v souladu s teorií TCM o „tonifikaci ledvin a vyživující esenci“ a také poskytují vědecký základ pro její aplikaci při léčbě očních onemocnění. Na základě terapeutického principu TCM tonizace ledvin a výživy krve a spojení moderních farmakologických charakteristik Cistanche, tato studie nahradila původní krev vyživující a ledviny tonizující byliny Cistanche, aby vytvořila novou formuli obsahující Cistanche, a prozkoumala její účinnost a mechanismus při léčbě FDM s cílem poskytnout nový nápad pro rozvoj myopie založené na herbalerapii.

1 Materiály a metody

1.1 Pokusná zvířata

Čtyřicet samců SD potkanů ​​třídy SPF o hmotnosti 180-200 g a stáří 6-8 týdnů bylo zakoupeno od Beijing Keyu Animal Breeding Center [Licenční číslo: SCXK (Jing) 2022-0004] a rutinně chováno ve Animal Laboratory of Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences. Tento experiment byl v souladu s příslušnými ustanoveními „Předpisů o správě pokusných zvířat“ a byl schválen Lékařskou etickou komisí Oční nemocnice Čínské akademie čínských lékařských věd (číslo šarže: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Hlavní činidla a přístroje

Jako základní léčivý materiál byl použit Cistanche tubulosa (zakoupený od Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., s aktivními složkami včetně echinakosidu vyšším nebo rovným 30,0 %, verbascoside větším nebo rovným 12,0 % a celkovými glykosidy fenethylalkoholu větším nebo rovným 75,0 %). Pirenzepin (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); oční kapky se sloučeninou tropikamidu (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., specifikace 5 ml); 4 g.L-1 očních kapek s oxybuprokainhydrochloridem (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1 protilátka (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); protilátka CAV1 (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -aktinová protilátka (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); kozí anti-králičí IgG (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); HE Barvicí sada (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Metoda modelování a seskupování

K vytvoření modelu FDM bylo použito třicet krys. Krysy byly anestetizovány intraperitoneální injekcí pentobarbitalu sodného (30 mg.kg-1). Po vyčištění a dezinfekci pravého oka povidon-jodem byla na pravé oko nalepena neprůhledná oční maska. Oční maska ​​byla denně kontrolována na oddělení nebo únik světla, a pokud se uvolnila, znovu se přilepila. Levé oko bylo ponecháno bez léčby. Po 4 týdnech deprivace monokulární formy byla na krysách provedena binokulární retinoskopie a měření axiální délky. Kritéria úspěšnosti pro modelování: po cykloplegii byla refrakční vada měřena retinoskopem nebo automatickým refraktometrem a deprivované oko vykazovalo významný myopický posun v refrakčním stavu [tj. rozdíl v binokulární refrakční chybě Větší než nebo rovný 2 D byl považován za úspěšné modelování a průměrný myopický posun deprivovaného oka byl přibližně)] (4.1 ± .5) ve srovnání s kontrolním okem Všech 30 krys bylo úspěšně modelováno a rozděleno do skupiny FDM, skupiny PIR a skupiny vzorce Cistanche, s 10 krysami v každé skupině. Zbývajících 10 nemodelovaných krys sloužilo jako normální skupina.

1.4 Intervenční metody

Normální skupina a skupina FDM nedostaly žádnou intervenci. Skupině PIR bylo podáváno 5 kapek PIR očních kapek do pravého oka dvakrát denně (ráno a večer) s intervalem 2 minut po dobu 15 dnů. Skupina vzorce Cistanche byla intervenována vzorcem obsahujícím Cistanche. Cistanche tubulosa (50 g, hlavní složka) byla odvařena vodou a zakoncentrována na léčivý roztok o koncentraci 1000 g·L⁻1. Krysám byla podávána intragastrická dávka 12,70 g.kg⁻1 jednou denně po dobu 15 dnů. Dávkování Cistanche bylo stanoveno na základě jeho zkušeností z klinické aplikace a moderního farmakologického výzkumu, zajišťujícího účinné koncentrace účinných látek, jako je echinacosid a verbascosid.

1.5 Metody detekce

1.5.1 Hodnocení změn lomu a axiální délky

Detekce morfologické a refrakční vady: Dvacet čtyři hodin po ukončení formální deprivace byly z každé skupiny náhodně vybrány 3 krysy pro detekci. Před experimentem byly krysy umístěny na 30 minut do tmavého prostředí, poté byly anestetizovány inhalací isofluranu a fixovány na speciální zvířecí držák. Pro panoramatické snímání oční bulvy byl použit zobrazovací systém OCT s vysokým rozlišením. Během skenování byla sonda nastavena tak, aby byla kolmá k rohovce, aby se získaly jasné obrazy příčného řezu sítnice a čočky. Každé oko bylo skenováno 3krát po sobě a axiální vzdálenost od předního povrchu rohovky k vrstvě pigmentového epitelu sítnice (tj. axiální délka) byla automaticky měřena pomocí vestavěného softwaru systému pro výpočet sférického ekvivalentu refrakční chyby. Aby byla zajištěna přesnost dat, dva profesionálně vyškolení výzkumníci nezávisle analyzovali snímky slepým způsobem. Pokud byl rozdíl mezi oběma výsledky měření větší než 0,50 D, data byla vyřazena a znovu změřena. Konfirmační detekce axiální délky: K ověření výsledků OCT měření byl také použit ultrazvukový diagnostický přístroj A-scan. Nejprve byly do obou očí krys nakapány oční kapky oxybuprokain hydrochloridu pro topickou anestezii a poté byla sonda A-scan jemně umístěna do kontaktu s rohovkou. Přístroj byl nastaven na manuální režim a přesná rychlost šíření ultrazvuku byla nastavena podle nitroočního média: 1540 m·s⁻1 pro přední komoru a sklivec. Během provozu bylo každé rozhraní lokalizováno ručním značením a každé oko bylo měřeno 3krát opakovaně, aby se získala průměrná hodnota. Tento experiment byl proveden naslepo a všichni operátoři absolvovali jednotné školení, aby byla zajištěna konzistentní technika měření. Přístroj byl před měřením kalibrován a některé vzorky byly náhodně vybrány pro testování opakovatelnosti, aby se vyhodnotily korelační koeficienty uvnitř třídy a mezitřídy (ICC). Během experimentu byly dodržovány přísné standardizované operační postupy, aby byla zajištěna vědeckost a spolehlivost dat.

1.5.2 Barvení HE

Po detekci refrakční vady a axiální délky byly krysy usmrceny nadměrnou anestezií. Oční víčka a okolní tkáně obou očí byly dezinfikovány a byl označen nazální a temporální limbus kolmý ke středu rohovky. Spojivka byla naříznuta podle značek a oční bulva byla enukleována. Limbus byl naříznut, aby se odstranila tkáň předního segmentu a sklivec, a sklerální tkáň byla zachována. Sklerální tkáň byla fixována 40 g · L⁻1 paraformaldehydu po dobu 24 hodin, dehydratována gradientem ethanolu, rutinně uložena v parafínu, vyčištěna xylenem, upevněna neutrálním balzámem, nařezána na 5 μm, obarvena HE a pozorována na morfologické změny sklerální tkáně pod optickým mikroskopem.

1.5.3 Imunohistochemické barvení na expresi TGF- 2 ve sklerální tkáni

Z každé skupiny byly vybrány dva potkani. Řezy sklerální tkáně byly podrobeny vyhledávání a blokování antigenu, inkubovány s myší anti-TGF- 2 (1:3000) po dobu 24 hodin, promyty, inkubovány se sekundární protilátkou (1:2000) po dobu 1 hodiny, rutinně vyvinuty a kontrastně obarveny, upevněny neutrálním balzámem a byly pořízeny 2-3 snímky pro pozorování změn tkáně pod optickým mikroskopem. Hodnota šedé pozitivní části byla detekována systémem analýzy obrazu.

1.5.4 Western blot detekce hladin exprese proteinu AQP1 a CAV1 ve sklerální tkáni

Z každé skupiny byly vybrány dva potkani. Sklerální tkáň byla vyříznuta, homogenizována a celkový protein byl extrahován přidáním RIPA lyzačního pufru. Byla provedena denaturace proteinů, kvantifikace, elektroforéza, membránový přenos a blokování. Byly přidány primární protilátky AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) a -aktinová protilátka (1:2000) a inkubovány přes noc při 4 stupních. Byla přidána sekundární protilátka (1:2000) a inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Bylo přidáno ECL činidlo a hodnota proteinové šedi byla analyzována pomocí softwaru Image Lab. Poměr šedé hodnoty cílového pruhu k hodnotě -aktinu byla jeho relativní hladina exprese.

1.5.5 Detekce RT-PCR exprese GLAST a GLT-1 mRNA ve sklerální tkáni

Byla odebrána zbývající sklerální tkáň krys a celková RNA byla extrahována podle metody Trizol. Celková RNA byla měřena spektrofotometrem a cDNA byla reverzně transkribována podle instrukcí sady. Reakční systém RT-PCR byl připraven s následujícími reakčními podmínkami: 75 stupňů po dobu 30 s, 85 stupňů po 60 s, 80 stupňů pro žíhání po dobu 30 s, 65 stupňů pro prodloužení po dobu 30 s, celkem 40 cyklů. S -aktinem jako vnitřní referencí byly relativní hladiny exprese glutamát-aspartátového transportéru (GLAST) a glutamátového transportéru 1 (GLT-1) vypočteny metodou 2⁻AACt. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1. Pro srovnání mezi skupinami byla použita jednosměrná analýza rozptylu a pro párové srovnání mezi skupinami byl použit LSD-t test. Úroveň testu:=0.05.