Echinakosid potlačuje inhibici růstu a apoptózu indukovanou dexametazonem u osteoblastických buněk MC3T3‑E1

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktní.

Glukokortikoidy (GC) jsou široce používány k léčbě chronických onemocnění. Dlouhodobé podávání a/nebo předávkování GC má mnoho vedlejších účinků na lidské zdraví včetně GC-indukované osteoporózy (GIOP). V tomto šetření bylo cílem posoudit vliv, žeechinakosid z cistanche(ECH) působí na myší osteoblastické buňky MC3T3-E1 ošetřené dexametazonem. Zjistili jsme, že ECH(echinakosid z cistanche) (5, 10, 20, and 40 mg/l) inhibited dexamethasone (1,000 nM)-suppressed cell viability as demonstrated by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The dose of 10 mg/l was selected for the following experiments because this dose had a better effect than the dose of 5 mg/l, and the doses >10 mg/l mělo podobný účinek jako tato dávka. ECH(echinakosid z cistanche)(10 mg/l) nebo pifithrin‑ (PFT-) (inhibitor p53, 20 µM) potlačil apoptózu MC3T3-E1 indukovanou dexametazonem, jak je ilustrováno analýzou dvojitě značenou průtokovou cytometrií Annexin V/propidium jodid (PI) . ECH(echinakosid z cistanche)nebo léčba PFT také zmírnila účinek dexametazonu při inhibici exprese Bcl-2 a také účinek dexametazonu při stimulaci exprese p53 a Bax. Nadměrná exprese p53 zprostředkovaná lentivirem navíc zvrátila účinky ECH(echinakosid z cistanche)v buňkách MC3T3-E1 ošetřených dexametazonem, což naznačuje, že ECH(echinakosid z cistanche)indukované antiapoptotické účinky v osteoblastech ošetřených dexametazonem prostřednictvím ap53-závislé dráhy. Stručně řečeno, ECH(echinakosid z cistanche)má ochranný účinek proti apoptóze osteoblastických buněk indukované dexamethasonem, což naznačuje, že ECH(echinakosid z cistanche)může mít potenciál pro klinickou aplikaci při léčbě GIOP.

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

Úvod

Glukokortikoidy(GC) se často používají k léčbě širokého spektra chronických onemocnění, včetně zánětů, rakoviny a autoimunitních poruch (1). Dlouhodobé podávání a/nebo předávkování GC má však mnoho vedlejších účinků, jako je hypertenze, hyperglykémie, glaukom, osteonekróza a osteoporóza (2-4). Je zřejmé, že užívání GC zvyšuje ztrátu kostní hmoty a riziko zlomenin (3-6). GC mohou indukovat apoptózu osteoblastů a zhoršit funkci těchto buněk. Například dexamethason, hormon GC, může upregulovat expresi p53 v osteoblastických buňkách MC3T3-E1, a tak způsobit buněčnou apoptózu (7,8). Apoptóza osteoblastů vede ke snížení tvorby kostí. K léčbě osteoporózy vyvolané GC (GIOP) bylo zavedeno perorální podávání bisfosfonátů (alendronát a risedronát) (9,10). Nízká míra adherence však omezuje účinnost perorálních bisfosfonátů. Další léky mají také omezení, jako je nepohodlné podávání [kyselina zoledronová (11)] a vysoká cena [PTH 1-34 (teriparatid) [12,13)]. V důsledku toho existuje potřeba vývoje nových možností léčby GIOP.

Echinakosid z cistanche (ECH)je fenylethanoidní glykosid izolovaný z tradiční čínské medicínyHerbaCistanches(14). ECH(echinakosid z cistanche)má ochranné účinky na neuronový systém (15-20), játra (21,22) a plíce (23) prostřednictvím podpory buněčné proliferace a inhibice zánětlivé reakce, produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) a buněčné apoptózy. Přestože ECH(echinakosid z cistanche)může také podporovat osteoblastickou kostní regeneraci a má mimořádnou antiosteoporotickou aktivitu u potkaních modelů (24,25), neexistují žádné záznamy popisující účinky ECH(echinakosid z cistanche)na GC-indukovanou apoptózu osteoblastických buněk. Zkoumali jsme tedy vliv ECH(echinakosid z cistanche)působí na apoptózu osteoblastických buněk indukovanou dexametazonem a objasnil předběžný mechanismus v buňkách MC3T3-E1.

Materiály a metody

Pěstování z buňky. Buněčná banka Čínské akademie věd (Shanghai, Čína) poskytla myší osteoblastické buňky MC3T3-E1. Růst buněk probíhal v -minimálním základním médiu (-MEM) (Hyclone; GE Healthcare, Logan, UT, USA) obsahujícím 10 procent fetálního bovinního séra (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Grand Island, NY, USA ) a penicilin/streptomycin (Beijing Solar Science and Technology Co., Ltd., Peking, Čína). Údržba článků byla prováděna v prostředí s 95 procenty vzduchu a 5 procenty oxidu uhličitého při teplotě 37˚C.

TheVýrobazlentivirusnadměrná exprese p53. Pro vytvoření expresního konstruktu p53 byla syntetizována oblast kódující protein (CDS) myšího genu p53 a vložena doEcoRI/BamHI restrikční místa lentivirového expresního vektoru pLVX-puro (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA) od Genewiz, Inc. (Peking, Čína). Konstrukce byla ověřena sekvenováním DNA. Buňky 293T (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, Čína) byly transfekovány směsí plazmidů, včetně virových balicích plazmidů a expresního plazmidu p53 (pLVX-p53) nebo kontrolního plazmidu (pLVX) prostřednictvím Lipofectamine 2000 (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA, USA) na základě pokynů výrobce. Virový supernatant byl odebrán 48 hodin po transfekci a použit k infekci buněk MC3T3-E1. Hodnocení exprese p53 bylo provedeno 48 hodin po virové infekci.

Kvantitativnípolymerázařetězreakce(qPCR). K separaci celkové RNA a buněk MC3T3-E1 jsme použili činidlo TRIzol (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc.) a soupravu pro syntézu cDNA RevertAid™ First Strand (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA) podle pokynů výrobce pro reverzní transkripci celkové RNA. Hladina p53 mRNA byla detekována pomocí qPCR na ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems: Thermo Fisher Scientific, Inc., Foster City, CA, USA). Primery byly následující: 5'-CCC CTGTCATCTTTTGTCCCT-3' a 5'-AGCTGGCAGAAT AGCTTATTGAG-3' pro p53, 5'-CTGCCCAGAACATCA TCC-3' a 5'-CTCAGATGCCTGCTTCAC{{{{ 18}}' pro GAPDH.

Poté jsme hodnotili hladiny p53 mRNA prostřednictvím 2^-Metoda ΔΔCT (26) s GAPDH jako vnitřní kontrolou.

Western blotting. Lýza buněk MC3T3-E1 probíhala v radioimunoprecipitačním testovacím pufru s inhibitory proteázy (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) a centrifugace lyzátů pokračovala 15 minut při teplotě 4˚C při 9 600 xg aby bylo možné odstranit srážky. Následně jsme hodnotili množství proteinu pomocí BCA testovací soupravy (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Stejné množství proteinu bylo přidáno na 10 nebo 15% SDS-PAGE a přeneseno na nitrocelulózovou membránu (EMD Millipore, Bradford, MA, USA). Membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem a sondovány primárními protilátkami. Po trojnásobném promytí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) byla provedena inkubace membrán sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (1:1,000; kat. č. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China). . Provedli jsme testy westernovým přenosem pomocí soupravy pro zvýšenou chemiluminiscenci (ECL) (EMD Millipore). Jako vnitřní standard byl použit GAPDH. Zdroje primárních protilátek byly následující: Bax (Sc-493) a Bcl-2 (Sc{20}}), oba od Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA); p53 (č. 2524) a GAPDH (č. 5174), oba od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Experimentální seskupení. Pro stanovení vhodné dávky dexametazonu bylo ošetření buněk MC3T3-E1 prováděno sérií množství dexametazonu (0, 1, 10, 100 a 1,000 nM; Sigma -Aldrich; Merck KGaA, St. Louis, MO, USA). 48 hodin po inkubaci buněk byly provedeny testy Cell Counting Kit-8 (CCK-8) k detekci buněčné proliferace.

Pro výběr vhodné dávky ECH(echinakosid z cistanche)ošetření buněk MC3T3-E1 bylo provedeno s 1,000 nM dexamethasonu a různými dávkami ECH (0, 2,5, 5, 10, 20 a 40 mg/l; Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Šanghaj, Čína). Buňky pěstované za normálních podmínek (falešné) sloužily jako kontrola. Test CCK-8 byl proveden po 48 hodinách kultivace.

Pro všechny ostatní experimenty byly buňky MC3T3-E1 rozděleny do pěti skupin: skupina 1 (falešná), buňky byly kultivovány za normálních podmínek; skupina 2, buňky byly transdukovány pLVX lentivirem; skupina 3, buňky kultivované s 10 mg/l ECH(echinakosid z cistanche); skupina 4, buňky s 20 uM pifithrinu- (PFT-; Selleck Chemicals, Houston, TX, USA); skupina 5, buňky transdukované lentivirem pLVX-p53 a ošetřené 10 mg/l ECH(echinakosid z cistanche). Buňky ve skupinách 2-5 byly ošetřeny 1,000 nM dexamethasonem. Buněčná apoptóza a exprese proteinu byly měřeny po 48 hodinách kultivace.

Buňkatest proliferace.Nasadili jsme buňky MC3T3-E1 do 96-jamkových destiček v množství 3x10³buňky/jamku a kultivovaly je za normálních podmínek přes noc. Buňky byly ošetřeny, jak je uvedeno. Po 48 hodinách kultivace byl poté proveden test CCK8 (Signalway Antibody LLC, College Park, MD, USA) podle pokynů výrobce. Stručně, kultivační médium v ​​každé jamce bylo nahrazeno 100 ul 10% roztoku CCK{4}} v médiu. Po inkubaci buněk po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C jsme hodnotili absorbanci při vlnové délce 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Byla vypočtena relativní životaschopnost buněk (procenta) s připojením ke kontrolním jamkám.

Buňkahodnocení apoptózy. Použili jsme soupravu pro apoptózu buněk Annexin V-FITC (Beyotime Institute of Biotechnology) pro kvantifikaci buněk, které procházejí časnou apoptózou podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, odběr ošetřených buněk byl proveden trypsinizací. Buňky byly promyty pomocí PBS a resuspendovány v pufru vázajícím annexin. Inkubace buněk byla prováděna prostřednictvím Annexin V-FITC po dobu 15 minut při teplotě 4 °C, poté následovala inkubace s propidium jodidem (PI) po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Buňky v pravém dolním kvadrantu (Annexin V-FITC pozitivní a PI negativní) byly považovány za aktivně procházející časnou apoptózou.

Statistickýanalýza. Data jsou průměry ± SD pro všechny tři nezávislé experimenty. Tukeyův test vícenásobného srovnání a jednosměrná analýza rozptylu byly provedeny za účelem analýzy rozdílů mezi skupinami pomocí softwaru GraphPad Prism (verze 6.0; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Výsledek

Zřízeníza vhodná dávkazdexamethason.Pro stanovení vhodné dávky dexametazonu byly buňky MC3T3-E1 vystaveny rostoucímu množství dexametazonu (0, 1, 10, 100 a 1,000 nM) po dobu 48 hodin . Jak je znázorněno na obr. 1, relativní životaschopnost buněk byla stanovena pomocí testu CCK-8 byla zvýšena u buněk ošetřených nízkými koncentracemi dexametazonu (1 a 10 nM) a významně snížena u buněk vystavených vysokým koncentracím dexametazonu (100 a 1,000 nM).

Nejvýznamnější snížení bylo pozorováno u buněk s 1,000 nM dexamethasonu. V následných testech tedy bylo vybráno 1,000 nM dexamethasonu.

Účinek ECH(echinakosid z cistanche)na dexamethasonem indukovanou inhibici růstu buněk. Poté jsme zkoumali účinek ECH(echinakosid z cistanche)na dexamethasonem indukovanou inhibici růstu buněk. Ošetření buněk MC3T3-E1 bylo provedeno pomocí 1,000 nM dexamethasonu a různých dávek ECH(echinakosid z cistanche)(0, 2,5, 5, 10, 20 a 40 mg/l; obr. 2). 48 hodin po léčbě přidání ECH(echinakosid z cistanche)v dávkách 5, 10, 20 a 40 mg/l výrazně snížilo poškození buněk vyvolané dexametazonem. ECH(echinakosid z cistanche)v dávce 10 mg/l má zjevnější účinek než při dávce 5 mg/l. Životaschopnost buněk byla podobná u buněk ošetřených 10, 20 a 40 mg/l ECH(echinakosid z cistanche). Tedy 10 mg/l ECH(echinakosid z cistanche)byl použit v následujících experimentech.

Nadměrná exprese p53 konstrukcí lentiviru. Dexamethason může upregulovat p53, a tím indukovat apoptózu osteoblastů (8). Studovat účinky ECH(echinakosid z cistanche) on dexamethasone-induced p53 expression, we constructed a lentivirus encoding p53 (pLVX-p53) and transduced the virus into MC3T3-E1 cells. The expression of p53 was analyzed at 48 h after transduction. Fig. 3 shows that p53 mRNA and protein levels were increased to >2krát v buňkách transdukovaných pLVX-p{2}} ve srovnání s buňkami s kontrolním virem (pLVX). p53 se podílel na účinku ECH (echinakosid z cistanche) na dexamethasonem indukovanou apoptózu. Buňky MC3T3-E1 byly ošetřeny Plavixem nebo pLVX-p53, 10 mg/l ECH(echinakosid z cistanche), 20 uM PFT- (inhibitor p53) a 1,000 nM dexamethasonu, a poté byla měřena apoptóza buněk pomocí soupravy pro apoptózu Annexin V-FITC. Jak je znázorněno na obr. 4A, léčba dexametazonem výrazně indukovala buněčnou apoptózu ve srovnání s buňkami kultivovanými za normálních podmínek (falešné). ECH(echinakosid z cistanche) a léčba PFT významně chránila buňky MC3T3‑E1 proti apoptóze vyvolané dexametazonem. Nadměrná exprese p53 navíc zvrátila ochranné účinky ECH (echinakosid z cistanche).

Je známo, že Bcl-2 a Bax jako důležité regulátory apoptózy jsou regulovány p53 (27). Western blotting ukázal, že změny exprese proteinu p53 a Bax byly konzistentní se změnami buněčné apoptózy, zatímco exprese Bcl-2 se změnila v opačném směru (obr. 4B a C). Je pozoruhodné, že hladiny proteinu p53 byly významně potlačeny ECH(echinakosid z cistanche)a ošetření PFT v buňkách nadměrně exprimujících p53 a ošetřených dexamethasonem (obr. 4C). Tyto údaje naznačují, že ECH(echinakosid z cistanche)může vykazovat ochranné účinky na apoptózu indukovanou dexametazonem prostřednictvím inhibice exprese p53.

Účinky cistanche echinacosidu

Diskuse

Antiapoptózní funkce ECH(echinakosid z cistanche)byl popsán v modelu akutního poškození jater vyvolaném D-galaktosaminem (D-GalN) a lipopolysacharidem (LPS) a v buňkách lidského neuroblastomu (SH-SY5Y) indukovaném tumor nekrotizujícím faktorem- nebo 1-methyl{{6 }}fenylpyridiniumion (MPP plus) (17,22,28). Bylo hlášeno, že léčba dexametazonem může inhibovat proliferaci a indukovat apoptózu buněk MC3T3-E1 (8,29). V současné studii byla relativní životaschopnost buněk významně snížena u buněk vystavených vysokým koncentracím dexamethasonu (100 a 1,000 nM), což bylo v souladu s předchozí studií (8). Další léčba ECH (5-40 mg/l) pozoruhodně inhibovala životaschopnost buněk potlačenou dexametazonem. Kromě toho expozice dexametazonu (1,000nM) stimulovala apoptózu buněk MC3T3-E1, kterou léčba ECH do značné míry omezila. Zpráva poskytla první zobrazení toho, jak je ECH chráněna proti dexametazonem indukované apoptóze osteoblastových buněk, a navrhla, že ECH může mít potenciál pro klinickou aplikaci v GIOP.

Dále jsme se pokusili prozkoumat předběžný mechanismus ochranných účinků ECH(echinakosid z cistanche). Dexamethason může zvýšit transkripci p53, a tím indukovat apoptózu osteoblastů a zástavu buněčného cyklu (8). p53 je downregulován pomocí ECH v buňkách SH-SY5Y (28). Zde měl PFT- (inhibitor p53) podobné ochranné účinky jako ECH, zatímco nadměrná exprese p53 zvrátila ochranné účinky ECH. Změny exprese proteinu p53 za různých podmínek byly v souladu se změnami buněčné apoptózy. Tyto výsledky naznačují, že ECH může mít ochranné účinky na apoptózu osteoblastických buněk indukovanou dexametazonem prostřednictvím inhibice exprese p53. Proteiny rodiny Bcl{12}}, jako jsou Bcl{13}} a Bax, mohou změnit permeabilitu mitochondriální membrány, aktivovat efektorové kaspázy a způsobit buněčnou apoptózu (30). Je dobře známo, že p53 může regulovat Bcl-2 a Bax (27). Zde léčba PFT- nebo ECH(echinakosid z cistanche) zeslabily inhibiční účinky dexametazonu na hladiny antiapoptózového proteinu Bcl-2 a také stimulační účinky dexametazonu na hladiny proapoptózového proteinu Bax, zatímco nadměrná exprese p53 zvrátila účinky ECH. Tyto výsledky dále prokázaly zapojení p53 do ochranné funkce ECH.

V souhrnu jsme prokázali, že ECH(echinakosid z cistanche)má slibný ochranný účinek na apoptózu osteoblastických buněk indukovanou dexamethasonem, což naznačuje, že ECH může mít potenciál pro klinickou aplikaci při léčbě GIOP.

Účinky echinakosidu z cistanche

Reference

1. Buttgereit F, Burmester GR a Lipworth BJ: Optimalizovaná terapie glukokortikoidy: Ostření starého kopí. Lancet 365: 801-803, 2005.

2. Schäcke H, Döcke WD a Asadullah K: Mechanismy podílející se na vedlejších účincích glukokortikoidů. Pharmacol Ther 96: 23-43, 2002.

3. Fukushima W, Fujioka M, Kubo T, Tamakoshi A, Nagai M a Hirota Y: Celostátní epidemiologický průzkum idiopatické osteonekrózy hlavice femuru. Clin Orthop Relat Res 468: 2715-2724, 2010.

4. Civitelli R a Ziambaras K: Epidemiologie glukokortikou nachlazením indukované osteoporózy. J Endocrinol Invest 31 (Suppl): 2-6, 2008.

5. Gudbjornsson B, Juliusson UI a Gudjonsson FV: Prevalence dlouhodobé léčby steroidy a frekvence rozhodování o prevenci osteoporózy vyvolané steroidy v každodenní klinické praxi. Ann Rheum Dis 61: 32-36, 2002.

6. van Staa TP, Geusens P, Pols HA, de Laet C, Leufkens HG a Cooper C: Jednoduché skóre pro odhad dlouhodobého rizika zlomeniny u pacientů užívajících perorální glukokortikoidy. QJM 98: 191-198, 2005.

7. Rickard DJ, Sullivan TA, Shenker BJ, Leboy PS a Kazhdan I: Indukce rychlé diferenciace osteoblastů v kulturách stromálních buněk kostní dřeně potkana dexamethasonem a BMP-2. Dev Biol 161: 218-228, 1994.

8. Li H, Qian W, Weng X, Wu Z, Li H, Zhuang Q, Feng B a Bian Y: Glukokortikoidní receptor a sekvenční aktivace P53 dexamethasonem zprostředkovávají apoptózu a zastavení buněčného cyklu osteoblastických MC3T3-E1 buněk. PLoS One 7: e37030, 2012.

9. Stoch SA, Saag KG, Greenwald M, Sebba AI, Cohen S, Verbruggen N, Giezek H, West J a Schnitzer TJ: Perorální alendronát 70 mg jednou týdně u pacientů s úbytkem kostní hmoty vyvolaným glukokortikoidy: A 12- měsíční randomizovaná, placebem kontrolovaná klinická studie. J Rheumatol 36: 1705-1714, 2009.

10. Wallach S, Cohen S, Reid DM, Hughes RA, Hosking DJ, Laan RF, Doherty SM, Maricic M, Rosen C, Brown J, et al: Účinky léčby risedronátem na hustotu kostí a zlomeniny obratlů u pacientů na terapii kortikosteroidy. Calcif Tissue Int 67: 277-285, 2000.

11. Reid DM, Devogelaer JP, Saag K, Roux C, Lau CS, Reginster JY, Papanastasiou P, Ferreira A, Hartl F, Fashola T a kol; Badatelé společnosti HORIZONT: Kyselina zoledronová a risedronát v prevenci a léčbě osteoporózy vyvolané glukokortikoidy (HORIZON): Multicentrická, dvojitě zaslepená, dvojitě slepá, randomizovaná kontrolovaná studie. Lancet 373: 1253-1263, 2009.

12. Langdale BL, Rajzbaum G, Jakob F, Karras D, Ljunggren O, Lems WF, Fahrleitner-Pammer A, Walsh JB, Barker C, Kutahov A, et al: Snížení četnosti zlomenin a bolesti zad a zvýšení kvality života u žen po menopauze léčených teriparatidem: 18-Měsíční údaje z European Forster Observational Study (EFOS). Calcif Tissue Int 85: 484-493, 2009.

13. Saag KG, Zanchetta JR, Devogelaer JP, Adler RA, Eastell R, Viz K, Krege JH, Krohn K a Warner MR: Účinky teriparatidu versus alendronátu na léčbu osteoporózy vyvolané glukokortikoidy: Třicet šest měsíců randomizované, dvojitě zaslepený, kontrolovaný pokus. Arthritis Rheum 60: 3346-3355, 2009.

14. Jia Y, Guan Q, Guo Y a Du C: Echinakosid stimuluje buněčnou proliferaci a zabraňuje apoptóze buněk ve střevních epiteliálních buňkách MODE-K zvýšením exprese transformujícího růstového faktoru- 1. J Pharmacol Sci 118: 99-108, 2012.

15. Kuang R, Sun Y, Yuan W, Lei L a Zheng X: Ochranné účinky echinakosidu, jednoho z fenylethanoidních glykosidů, na cytotoxicitu indukovanou H(2)O(2) v buňkách PC12. Planta Med 75: 1499-1504, 2009.

16. Kuang R, Sun Y a Zheng X: Potlačení oxidu dusnatého zapojeného do ochranného účinku echinakosidu na poškození buněk PC12 vyvolané H2O2-. Nat Prod Commun 5: 571-574, 2010.

17. Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB a Wang YH: Echinakosid zachraňuje neuronální buňky SHSY5Y před apoptózou vyvolanou TNFalfa. Eur J Pharmacol 505: 11-18, 2004.

18. Geng X, Tian X, Tu P a Pu X: Neuroprotektivní účinky echinakosidu u myšího MPTP modelu Parkinsonovy choroby. Eur J Pharmacol 564: 66-74, 2007.

19. Zhao Q, Gao J, Li W a Cai D: Neurotrofické a neurozáchranné účinky echinakosidu v subakutním MPTP myším modelu Parkinsonovy choroby. Brain Res 1346: 224-236, 2010.

20. Zhu M, Lu C a Li W: Přechodná expozice echinakosidu je dostatečná k aktivaci signalizace Trk a ochraně neuronových buněk před rotenonem. J Neurochem 124: 571-580, 2013.

21. Wu Y, Li L, Wen T a Li YQ: Ochranné účinky echinakosidu na hepatotoxicitu vyvolanou chloridem uhličitým u potkanů. Toxicology 232: 50-56, 2007.

22. Li X, Gou C, Yang H, Qiu J, Gu T a Wen T: Echinacosid zlepšuje akutní poškození jater vyvolané D-galaktosaminem a lipopolysacharidem u myší prostřednictvím inhibice apoptózy a zánětu. Scand J Gastroenterol 49: 993-1000, 2014.

23. Zhang Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L a Zhao J: Ochrana echinakosidu proti akutnímu poškození plic způsobenému kyselinou olejovou u krys. Free Radic Res 41: 798-805, 2007.

    ---