Model Drosophila pro studium střevní mikroflóry v chování a neurodegenerativních onemocněních, část 1

Abstraktní:

Rostoucí důkazy naznačují, že střevní mikroflóra je spojena s několika fyziologickými procesy a vývojem onemocnění u savců; základní mechanismy však zůstaly neprozkoumané, většinou kvůli složitosti savčího střevního mikrobiomu. Ovocná muška, Drosophila melanogaster, je cenným zvířecím modelem pro studium interakcí hostitele a střevní mikroflóry v translačních aspektech.

Zvířata a paměť jsou velmi zajímavý vztah. Od věrnosti psů po inteligenci myší byly vzpomínky zvířat již dlouho předmětem údivu a zvědavosti. I když se zvířata liší v tom, jak dobře si pamatují, jejich paměť propůjčuje důvěryhodnost závěru, že zvířata mají nejen silný pud sebezáchovy, ale jsou také schopna se učit ze zkušeností, což naznačuje, že paměť je důležitá.

Za prvé, psi a kočky jsou dva nejvhodnější domácí mazlíčci, které lidé chovají. Všichni jsou velmi chytří a mají velmi dobré vzpomínky. Dokážou si zapamatovat vůni a zvuk majitele a prostředí a mohou také vyjádřit emoce prostřednictvím určitého chování. Síla této paměti se odráží ve schopnosti psů a koček najít své ztracené majitele. I když je to už dávno, co majitel odešel, pokud jsou místa a pachy, které lze identifikovat, budou hledat dál.

Za druhé, myši patří také mezi zvířata s obzvlášť vysokým IQ. Paměť myší je mnohem lepší, než si představovali. Dokážou si zapamatovat, kam jdou, kde je jejich jídlo a jejich území, a také dokážou rozpoznat a zapamatovat si lidi nebo zvířata, která pro ně představovala nebezpečí. Experimenty některých výzkumníků zjistily, že myši také rozpoznávají a reagují na prostředí prostřednictvím hudby a tónů, což ukazuje, že paměť zvířat zahrnuje smyslovou, emocionální a logickou inteligenci.

Obecně vzpomínka na zvířata přinesla lidem mnoho překvapení a objevů. Nejen, že se dokážou chránit, ale také si mohou budovat bližší důvěru a vztahy s lidmi. Zvířata navíc inspirovala řadu experimentů a studií, které vědcům pomohly lépe porozumět podstatě a mechanismům paměti. Pojďme tedy obdivovat inteligenci a paměť zvířat a žasnout nad jejich chytrým a flexibilním mozkem. Je vidět, že ať už se jedná o člověka nebo zvíře, paměť je velmi důležitá. Cistanche může výrazně zlepšit naši paměť, protože Cistanche je tradiční čínský léčivý materiál s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinnost mletého masa vychází z různých účinných látek, které obsahuje, včetně karboxylové kyseliny, polysacharidů, flavonoidů atd. Tyto složky mohou různými kanály podporovat zdraví mozku.

Klikněte na krátkodobou paměť, jak se zlepšit

Dostupnost výkonných genetických nástrojů a zdrojů v Drosophila umožnila vědcům odhalit mechanismy, kterými střevní mikrobi ovlivňují kondici, zdraví a chování svých hostitelů.

Modely Drosophila byly v minulosti široce používány nejen ke studiu chování zvířat (tj. námluv, agrese, spánku a učení a paměti), ale také některých neurodegenerativních onemocnění souvisejících s lidmi (tj. Alzheimerovy choroby a Parkinsonovy choroby). Tento přehled komplexně shrnuje současné chápání střevní mikroflóry Drosophila a její dopad na chování much, fyziologii a neurodegenerativní onemocnění.
Klíčová slova:

Drosophila melanogaster; mikrobiota; osa střeva – mozek; chování; učení a paměť; neurodegenerativních onemocnění.

1. Úvod
Ovocná muška, Drosophila melanogaster, je důležitým experimentálním zvířetem používaným v biomedicínských studiích. Ovocnou mušku poprvé použili jako experimentální organismus Castle v roce 1901 a Morgan v roce 1909 pro genetické studie. Vzhledem k tomu, že Drosophila byla používána jako modelový organismus již více než století, bylo vyvinuto několik technik pro řešení specifických vědeckých otázek.

Drosophila má relativně krátkou životnost a složité chování. Dostupnost výkonných nástrojů pro genetickou manipulaci ve specifických tkáních nebo orgánech umožnila vědcům studovat molekulární mechanismy regulující chování drozofil, jako je adaptivní reakce na okolní prostředí, ale i vrozené (dvoření, agrese, spánek atd.) [1] –3] a naučené chování (čichová paměť a paměť námluv) [4–6].

Během posledních 20 let byla Drosophila používána jako ideální in vivo model pro studium neurodegenerativních onemocnění, jako je Alzheimerova choroba (AD) a Parkinsonova choroba (PD) [7,8]. Významné signální dráhy, které regulují růst a funkce neuronů u lidí, jsou u Drosophila zachovány, což umožňuje použití tohoto modelového organismu pro studium lidských neurodegenerativních onemocnění.

Například model AD Drosophila vyvinutý ektopickou expresí lidského proteinu A 42 v mozku mouchy vykazuje klinické příznaky spojené s pacienty s AD, jako je zhoršení krátkodobé paměti závislé na věku, poruchy učení, zvýšená bdělost a narušení spánku [8] ,9]. To naznačuje, že Drosophila může být použita jako ideální in vivo model pro screening nových léků pro léčbu AD.

Přibývající důkazy podporují názor, že dobře vyvážená střevní mikroflóra je nezbytná pro lidské zdraví [10,11]. Zásahy do složení střevní mikroflóry mohou nepříznivě ovlivnit zdraví a fyziologii hostitele, což vede k různým neurologickým onemocněním, jako jsou abnormality chování, neurodegenerativní onemocnění a neuropsychiatrické poruchy [12–14].

Studie ukázaly, že střevní bakterie mohou produkovat několik neurotransmiterů, včetně dopaminu, kyseliny gama-aminomáselné (GABA) a serotoninu [15]. Navíc je obousměrný přeslech mezi střevem a centrálním nervovým systémem (CNS) zprostředkován střevní mikroflórou [16,17]. Nedávné studie ukázaly, že změny ve složení střevní mikroflóry souvisí s určitými neurologickými onemocněními [18–20].

Podrobný mechanismus, jak střevní bakterie regulují progresi onemocnění ovlivňováním komunikace podél osy střevo-mozek, však vyžaduje další zkoumání.

Za posledních 20 let většina studií střevní mikroflóry využívala modely hlodavců ke zkoumání role osy mikrobiota-střevo-mozek. Všestranný organismus Drosophila je však výkonným výzkumným modelem, který umožňuje vědcům zkoumat mechanismy, kterými střevní mikrobi ovlivňují mozkové funkce (obrázek 1a,b). Mikroby mohou být geneticky označeny fluorescenčním proteinem, takže lze vizualizovat jejich distribuci v trávicím traktu Drosophila (obrázek 1c) [21,22].

Obrázek 1. Srovnání trávicího traktu člověka a Drosophila. (a) Trávicí trakt lidí a Drosophila. Funkční oblasti trávicího traktu u Drosophila a lidí jsou podobné a zahrnují jícen, přední a zadní střední střevo (tenké střevo), tlusté střevo (zadní střevo) a žaludek (plodina). (b) Subregiony trávicího traktu Drosophila zobrazující přední, střední a zadní střevo.

Předžaludky obsahují plodinu a proventrikulus. Střední střevo se dále dělí na oblasti R1-R5. (c) GFP-značený Lactobacillus byl krmen dospělým Drosophila a konfokální snímky ukazují distribuci Lactobacillus (zelená) v různých oblastech trávicího traktu. Zvětšené obrázky oříznutí, oblastí R2, R4 a R5 jsou zobrazeny v c1 až c4. Vzorek byl imunobarven protilátkou anti-integrin-PS (červená). Měřítko, 500 µm.

2. Vrozené chování drozofily
Předpokládá se, že vrozené chování je pevně zakódováno v mozku zvířat a geneticky zakódováno a nevyžaduje žádné předchozí zkušenosti pro správné provedení. Vrozené chování je vysoce adaptabilní na vnitřní stav zvířat a vnější prostředí, což umožňuje zvířatům modifikovat své chování podle různých podmínek prostředí [23].

Drosophila je vynikající zvířecí model pro studium molekulárních mechanismů lidského vrozeného chování, protože existují určité podobnosti v behaviorálních fenotypech mezi mouchami a lidmi. U Drosophila byla studována různá vrozená chování, jako je páření, agresivní chování, spánek/lokomotorická aktivita a chování související s teplotou [3,24–28].

Kromě toho je genom Drosophila přibližně z 60 % homologní s lidským a přibližně 75 % genů souvisejících s lidskými nemocemi má homology také u much [29]. Například při spánkovém chování reguluje dopaminová signalizace bdělost nejen u Drosophila, ale také u lidí [30]. Zde představujeme některé zásadní vrozené chování drozofily a diskutujeme o jejich vztahu se střevní mikroflórou (tabulka 1).

2.1. Střevní mikrobiota a chování při páření

Chování při páření u samců drozofily zahrnuje řadu kroků: postup směrem k samici (orientace), pronásledování samice (sledování), dotýkání se břicha samice (klepání), jednostranné natahování křídel a vibrace (zpěv), olizování genitálií samice, uchopení na záda samice (pokus o kopulaci) a konečnou kopulaci [3,26]. Jeden muší samec se pokusí pářit se s jednou panenskou samicí a měření sexuálního nadšení samce vůči samici se nazývá index námluv (CI).

CI je čas strávený samcem Drosophila námluvami dělený celkovou dobou experimentu. Známý nervový okruh, který reguluje chování při páření, se skládá z neuronů exprimujících plod (fru). Neurony exprimující fru, včetně primárních senzorických aferentů a centrálních interneuronů, jako jsou neurony shluku P1, které spouštějí námluvy, mohou tvořit jádro mužského okruhu námluv [50].

Nejméně tři studie uvádějí, že střevní mikroflóra neovlivňuje chování námluv u Drosophila [33,35,51]; je však třeba poznamenat, že každá studie používala různé mouchy divokého typu a používala různé metody k vytvoření bezmikrobních much.

Na rozdíl od těchto studií Heys et al. ukázaly, že střevní mikroflóra působí proti samčí strategii outbreedingu tím, že mění samičí sexuální signalizaci, což vede ke snížení přenosu spermií od samců much [31]. Outbreeding u Drosophila zvyšuje genetickou diverzitu u potomků, zvyšuje imunitní obranu a může být ovlivněn hostitelskou mikrobiotou [31,52].

Předchozí studie ukázala, že 1- a 3-den po páření se vzorec genové exprese v tkáni hlavy mouchy změní, což ovlivňuje chování mouchy, včetně chování při krmení, metabolismu a produkci vajec (po -páření) [53]. Delbare a kol. provedli rozsáhlou analýzu RNA-seq panenských a spářených axenických/konvenčních much a uvedli, že u spářených samic jsou transkripty podílející se na regulaci reprodukce a neuronálních funkcí různě bohaté v závislosti na mikrobiotě samic [32].

Navíc stav mikroflóry samce ovlivnil plodnost jak u konvenčních, tak u axenických samic; ovlivnilo to však transkripční profily pouze u axenických, nikoli však u konvenčních samic.

2.2. Střevní mikrobiota a agresivní chování

Agresivní chování, které je široce pozorováno v živočišné říši, je rozhodující pro přežití a reprodukci [54]. U Drosophila agresivní chování zahrnuje ohrožení křídly, box, poklepávání přední nohou, výpady a narážení hlavy [2,33]. Jia a kol. popsal protokol pro analýzu agresivního chování u much.

V tomto testu se dva samci nebo samice mouchy (stáří 5–7 dní) umístí do bojové komory, která se pak rychle přikryje krycím sklem o rozměrech 20 mm × 20 mm. Boj během 30 minut je natáčen kamerou. Agresivní chování se analyzuje počítáním počtu výpadů u mužů a narážení hlavy u žen a vyhodnocením frekvence výpadů/latence boje. Frekvence výpadů je definována jako počet výpadů za minutu po zahájení výpadu, zatímco latence boje je definována jako doba mezi začátkem záznamu a prvním výpadem [33].

Studie naznačují, že agresivní chování se koordinuje s vizuálními, čichovými, chuťovými, mechanickosenzorickými a sluchovými vstupy. Tyto vstupy se integrují do těla mozkové houby (MB), laterálního rohu a centrálních komplexních oblastí a nakonec řídí výstupy motoru přes svaly křídel a nohou.

Studie také naznačují, že neurotransmitery a neuropeptidy, jako je oktopamin, serotonin, dopamin, acetylcholin a neuropeptid F (NPF), také hrají důležitou roli v agresivním chování [54].

Nedávné studie ukázaly, že specifická střevní mikroflóra je u much spojena s agresivitou. Jia a kol. použili chlornan sodný a řadu promývacích protokolů k vytvoření axenických mušek [33].

Ve srovnání s konvenčními mouchami (Canton-S) vykazovaly axenické mouchy méně agresivní chování mezi samci, což naznačuje, že bezmikrobní mouchy mají sníženou agresivitu mezi samci. Kromě toho komenzální bakterie, jako je Acetobacter, Lactobacilli a Enterococci, podporovaly agresivní chování u axenických mušek pomocí mikrobiální rekolonizace. Autoři také zaznamenali 73% snížení hladin oktopaminu u bezmikrobních mušek a genetická manipulace s oktopaminergní neuronální aktivitou obnovila agresivní chování u axenických mušek.

Stejná studie také uvádí dva klíčové faktory, které se podílejí na regulaci agrese prostřednictvím exprese oktopaminu. Jedním z nich bylo kritické vývojové období během larválního stádia (48–98 h po snesení vajíček), ve kterém suplementace stravou bohatou na kvasinky obnovila agresivní chování axenických mušek. Dalším faktorem byla výživa, protože je také důležitá pro expresi oktopaminu, a poskytování správné výživy axenickým mouchám normalizovalo agresivní chování.

Tato zjištění ukazují, že střevní mikroflóra a výživa během kritického vývojového období ovlivňují expresi oktopaminu, který reguluje agresi u dospělých mužů [33].
2.3. Střevní mikrobiota a spánek a pohybová aktivita
Systém Drosophila Activity Monitor (DAM) se používá ke studiu spánku a lokomočního chování u much [55]. V tomto testu jsou mouchy umístěny v podmínkách cyklu 12 h světlo/12 h tma [56,57].

Přístroj DAM má tři hlavní součásti: (1) skleněnou trubici, ve které se může volně pohybovat jedna moucha, (2) infračervený paprsek, který je nasměrován středem skleněné trubice, a (3) počítač pro záznam chování. výsledky [55]. V testu chování spánku/lokomoce systém DAM zaznamenává přerušení infračerveného paprsku způsobené mouchami procházejícími se ve skleněných zkumavkách, aby detekoval spánek nebo lokomoci [58].

Dobře známý okruh související se spánkovým chováním v mozku Drosophila se skládá z cirkadiánních neuronů. Světlo stimuluje skupinu velkých ventrálně-laterálních neuronů (l-vLNs), které uvolňují pigment dispergující faktory (PDF), aby stimulovaly skupinu malých ventrálně-laterálních neuronů (s-vLNs). Konečně, s-vLN regulují lokomoční řídicí centrum mozku, elipsoidní tělíska, aby inhibovaly spánkové chování.

Jak l-vLN, tak s-vLN exprimují receptory GABAA, které mohou inhibovat bdělost prostřednictvím GABAergních neuronů podporujících spánek. MB je také důležitá oblast mozku, která reguluje spánek prostřednictvím katalytické podjednotky proteinkinázy A, enzymu aktivovaného spánkovou cAMP dráhou [59]. Pohybová aktivita je důležitá pro přežití Drosophila a je řízena hormony, které lze také analyzovat pomocí systému DAM. King a spol.

nedávno oznámili přítomnost peptidergního okruhu, který spojuje cirkadiánní hodiny s lokomotorickou aktivitou. s-vLN uvolňují PDF, které stimulují DN1 hodinové neurony, které naopak stimulují DH44 pozitivní neurony pars intercerebralis (PI). DH44-pozitivní PI neurony stimulují hugin-pozitivní SEZ neurony, které nakonec uvolňují huginový neuropeptid do motorického okruhu ve ventrálním nervovém provazci, který reguluje lokomotorickou aktivitu u Drosophila [60].

Účinek střevní mikroflóry na spánkové chování u Drosophila zůstává nejasný. Selkrig a kol. použili isogenní kmen D. melanogaster Canton-S bez Wolbachie jako mouchy divokého typu a provedli testy spánku a lokomotorického chování. Autoři vytvořili bezmikrobní mušky Canton-S bez Wolbachie promytím vajec NaClO a nazvali první generaci jako F1 a další generaci jako F2.

Jejich data odhalila, že ani bezmikrobní F1 ani bezmikrobní F2 mouchy nevykazují žádnou významnou změnu ve spánkovém chování. Navíc, i když bezmikrobní mouchy F1 nevykazovaly žádnou změnu v lokomotorickém chování, bezmikrobní mouchy F2 vykazovaly mírné zvýšení lokomotorické aktivity ve srovnání s konvenčními mouchami [35].

Další studie Silvy et al. použili Canton-S a W1118 jako mouchy divokého typu a použili NaClO k mytí vajíček much po dobu 3–5 minut, aby se vytvořily axenické mouchy [61]. Jejich výsledky odhalily, že ve srovnání s konvenčními mouchami měly axenické mouchy tendenci spát déle a vykazovaly snížený návrat spánku po spánkové deprivaci [34]. Stav střevní mikroflóry much však měl malý vliv na cirkadiánní rytmus lokomotorické aktivity.

Silva a kol. a Selkrig a kol. zaměřené na pochopení role střevní mikroflóry při regulaci spánku a pohybu Drosophila. Schretter a kol. navrhl možný mechanismus k vysvětlení vztahu mezi střevní mikrobiotou a pohybem/spánkem. V této studii byl kmen Oregon-R použit jako divoký typ a mouchy dostávaly dietu doplněnou antibiotiky, aby vytvořily mouchy ošetřené antibiotiky (ABX).

Výsledky ukázaly, že mušky ABX zvýšily rychlost chůze, zlepšily denní aktivity a snížily spánek během dne. Autoři také uvedli, že enzym xylózaizomeráza, který katalyzuje reverzibilní izomerizaci určitých cukrů přítomných v Lactobacillus brevis, snižuje lokomotorickou aktivitu modulací metabolismu cukrů prostřednictvím stimulace oktopaminergních neuronů; tento enzym však neovlivňuje spánek [36].

2.4. Střevní mikrobiota a chování související s teplotou

Teplota prostředí silně ovlivňuje fyziologii ektoterm, jako je Drosophila. Chování preference teploty (mouchy se vyhýbají horkému nebo chladnému prostředí) a tolerance vůči vysokým nebo nízkým teplotám jsou důležité pro přežití u Drosophila. Test teplotního gradientu se používá ke studiu preference teploty u much.

Různé studie používaly různá zařízení s teplotním gradientem, ale základní princip je stejný: jedna strana zařízení má nízkou teplotu a druhá strana produkuje vysokou teplotu. Umístěním hliníkového plechu mezi obě strany se vytvoří teplotní gradient. Mouchy jsou umístěny na hliníkovém plechu a mohou si zvolit preferovanou teplotu [62,63].

Existují dva různé způsoby, jak studovat chování při vyhýbání se teplotám: jedním je použití testu teplotního gradientu (popsaný výše) a druhým je použití testovacího stroje se dvěma volbami.

Testovací stroj se dvěma volbami obsahuje čtyři kvadranty, které jsou vyrobeny z termoelektrického chladicího čipu a hliníkového plechu. Při provádění testu vyhýbání se teplotě by testovací stroj se dvěma volbami nastavil konstantní teplotu (25 ◦C) v jedné sadě diagonálních kvadrantů a ostatní diagonální kvadranty byly nastaveny na experimentální teplotu, která závisí na analýze [64] .

Zotavení z chladného kómatu je protokol pro studium teplotní tolerance. V tomto testu jsou mouchy ponořeny do vodní a glykolové lázně nastavené na -3,5 ◦C (v závislosti na experimentálním návrhu) pro chladový stres nebo vystaveny teplotě 38,5 ◦C (v závislosti na experimentálním designu) pro tepelný stres, po kterém následuje mouchy se nechají zotavit a měří se doba zotavení [37,65].

Nedávné studie naznačují, že střevní mikroflóra silně ovlivňuje teplotní toleranci vrtulí. Henry a kol. generovaly axenické mouchy dechlorací, ve které byla vajíčka much ponořena do 2,7% chlornanu na 2 minuty, 70% ethanolu na 2 minuty a nakonec dvakrát promyta v autoklávované vodě [37]. Po dechloraci byly mouchy chovány na autoklávovaném krmivu. Jejich výsledky naznačují, že chladová tolerance axenických mušek je ve srovnání s konvenčními muškami vadná. Tepelná tolerance však nebyla u axenických mušek ovlivněna. To naznačuje, že narušení mikrobioty snižuje schopnost vyrovnat se s chladovým stresem [37]. Studie na jiných druzích Drosophila, jako je D. subobscura, naznačují, že běžné mouchy jsou vystaveny mírným teplotám (<34 ◦C) exhibit higher thermal tolerance than axenic flies [38].

For more information:1950477648nn@gamil.com