Receptory podobné dopaminu D1- a D2-opačné regulují délku života prostřednictvím mechanismu dietního omezení v Cistanche

Abstraktní

Pozadí: Navzdory nedávnému pokroku v chápání molekulárních mechanismů regulujících stárnutí a délku života a souvisejících cest, které jsou u různých druhů zachovány, nebylo dosaženo úplného pochopení procesu stárnutí. Zejména přibývající důkazy naznačují aktivní roli nervového systému v regulaci délky života, přičemž se ukázalo, že senzorické neurony, stejně jako signalizace serotoninu a GABA, regulují délku života vCistanche. Nicméně příspěvek dalších nervových faktorů a široké pochopení role nervového systému vregulující stárnutízbývá stanovit. Zde zkoumáme dopad dopaminového systému vregulace stárnutí v Cistanche.

Výsledky: Uvádíme, že mutace DOP-4, receptoru podobného dopaminu D1- (D1R), a DOP-2, receptoru podobného dopaminu D2- (D2R) ovlivněná délka života, délka rychlého pohybu těla, délka reprodukčního života a rychlost vývoje v Cistanche. Aktivace D2R pomocí aripiprazolu, antipsychotického léku, výrazně prodloužila jak životnost, tak délku zdraví. Naopak inhibice D2R pomocí kvetiapinu zkrátila životnost červů, což dále podpořilo roli dopaminových receptorů v regulaci délky života. Mechanicky signalizace D2R reguluje délku života prostřednictvím mechanismu dietního omezení zprostředkovaného cestou AAK-2-DAF-16.

Dráha DAG-PKC/PKD spojuje signalizaci mezi dopaminovými receptory a následnou dráhou AAK-2-DAF-16 k přenosu signálů dlouhověkosti. Závěry: Tyto údaje prokázaly novou roli dopaminových receptorů v regulaci délky života a dietních omezení . Klinicky schválené antipsychotikum aripiprazol má potenciál jako nový lék proti stárnutí.

Klíčová slova: dopamin, životnost,Cistanche, Aripiprazol, Dietní omezení

Kliknutím sem zakoupíte extrakt z Cistanche proti stárnutí

Pozadí Cistanche naproces stárnutí:

Biologické mechanismy stárnutí nejsou stále dobře pochopeny, a to i přes několik konzervovaných procesů regulace stárnutí, které byly identifikovány od kvasinek po člověka [1]. Stále více důkazů naznačuje, že nervový systém hraje aktivní roli vproces stárnutí. Studie například ukázaly, že senzorické neurony hrají zásadní roli v regulaci délky života [2, 3].

Bylo popsáno, že serotoninový signál antagonisticky moduluje dlouhověkost prostřednictvím různých serotoninových receptorů [4]. Nedávno bylo také zjištěno, že signalizace inhibiční neuronové gama-aminomáselné kyseliny (GABA) reguluje délku života u Cistanche [5]. O úloze nervového systému v regulaci procesu stárnutí se však musíme ještě hodně naučit.

Ať už dopaminový systémreguluje proces stárnutía životnost je nejasná. Dopamin je biogenní aminový neurotransmiter, který primárně moduluje behaviorální výstupy v reakci na podmínky prostředí [6, 7]. Například dopaminový systém funguje při chování, jako je hledání odměny a fyzické chování

mobility a je známo, že je zranitelný vůčiúčinky stárnutí. Jakmile se dopamin uvolní z presynaptických zakončení, aktivuje dvě třídy receptorů spřažených s G proteinem: třídy dopaminových receptorů D1 a D2 [8]. V Cistanche: DOP-1 a DOP-4 patří k D1-jako dopaminové receptory (D1R), zatímco DOP-2 a DOP-3 patří k D{{ 10}}jako dopaminové receptory (D2R) [9–11].

Předchozí studie ukázala, že červi nesoucí mutaci v genu pro biosyntézu dopaminu kočka-2 měli normální délku života, což naznačuje, že pouhé snížení produkce dopaminu neovlivňuje dlouhověkost [4]. Protože však D1R a D2R opačně regulují řadu chování u Cistanche, včetně rozhodování, bazálního zpomalení a reakce na jídlo [12–14], je důležité určit konkrétní role každého z dopaminových receptorů při regulaci délky života. z Cistanche. Pro svou krátkou životnost, pozorovatelné fenotypy související s věkem a konzervované biologické dráhy související se stárnutím [15, 16] je Cistanche jedním z nejrozšířenějších modelových organismů pro studium stárnutí. Navzdory svému jednoduchému nervovému systému má Cistanche konzervovaný dopaminový systém ve srovnání s nervovým systémem savců, včetně biosyntetických enzymů odpovědných za syntézu dopaminu, mechanismy pro synaptické uvolňování a expresi dopaminových receptorů [17]. Tyto vlastnosti udělaly z Cistanche vhodný genetický modelový systém pro zkoumání role dopaminového systému v dlouhověkosti.

In the present study, we demonstrate that dopamine D1- and D2-like receptors oppositely regulate worm lifespan through a dietary restriction (DR) mechanism. Using molecular genetics approach and pharmacological tools, we teased out how dopamine receptors send longevity signals through their G-protein-coupled signaling transduction pathways to downstream DR-related pathways. Our findings uncover a novel mechanism of dopamine signaling in DR and lifespan regulation. Notably, aripiprazole, a clinically widely used antipsychotic drug, robustly extends both the lifespan (>50%) and healthspan (>80 procent) Cistanche aktivací dráhy zprostředkované dopaminovým receptorem. Překvapivé zjištění aripiprazolu je příslibem pro další vývoj jako potenciálně bezpečného nového léku proti stárnutí.

Výsledky Cistanche na Anti-aging

Receptory podobné dopaminu D1 a D2 mají opačné účinky na životnost Cistanche. Abychom určili roli každého dopaminového receptoru v životnosti červa, kmeny červů nesoucí mutace na každém ze čtyř genů dopaminových receptorů, včetně dop-1, dop-2, dop-3 a dop-4 byly použity pro test životnosti. Je zajímavé, že mutant dop-2 vykazoval významně kratší životnost (-11,8 procenta, P < 0.0001) než N2

zvířata, zatímco dop{{0}} mutant byl významně dlouhověký (plus 29,4 procenta, P < 0,0001) ve srovnání se zvířaty N2. Mutanti Te dop-1 a dop{8}} také vykázali změny v délce života (plus 5,9 procenta a -8,8 procenta v tomto pořadí) ve srovnání se zvířaty N2, které nebyly statisticky významné (P=0. 0765, P=0.2468, respektive obr. 1A). Tyto údaje ukázaly, že signalizace přes D2R (DOP-2) prodlužuje životnost, zatímco signál přes D1R (DOP-4) ji zkracuje. Nedostatek statistické významnosti u změn délky života vyvolaných mutanty dop-1 a dop{24}} ukázal, že DOP-4 a DOP-2 jsou hlavními podtypy D1R a D2R při regulaci životnost, resp.

Prodloužení délky života bylo spojeno se zpomaleným pohybovým a reprodukčním stárnutím a také opožděným vývojem [18–20]. Abychom dále porozuměli úloze dopaminových receptorů v procesu stárnutí, dále jsme zkoumali rychlost pohybu těla, délku reprodukčního života a rychlost vývoje těchto mutantů.

Ve srovnání se zvířaty N2 vykazoval mutant dop-2 kratší reprodukční životnost a rychlý pohyb těla než zvířata N2, zatímco mutant dop-4 měl prodlouženou reprodukční životnost a rychlý pohyb těla (obr. 1B –D). Dop-2 mutant se vyvinul

rychleji, zatímco dop-4 mutant vykazoval pomalejší vývojovou rychlost (obr. 1D). Tese data dále podpořila myšlenku, že specifické dopaminové receptory hrají selektivní a jedinečnou roli v regulaci délky života.

Farmakologická aktivace nebo inhibice D2R má opačné účinky na délku života Cistanche. K dalšímu potvrzení role D2R při prodlužování délky života u Cistanche byl ke stanovení hodnoty použit farmakologický přístup využívající aripiprazol, agonistu D2R, a kvetiapin, antagonistu D2R. vliv na životnost červa [21, 22]. Červi divokého typu N2 byli léčeni aripiprazolem a kvetiapinem v koncentracích v rozmezí od 3 do 100 μM. U červů léčených aripiprazolem bylo pozorováno robustní prodloužení životnosti. Aripiprazol v koncentraci 3 μM významně prodloužil střední délku života červů N2 o 21,1 procenta (P < 0,0001).

Červi vystavení 100 μM aripiprazolu dosáhli maximálního prodloužení života až o 52,6 procenta (P < 0,0001) (obr. 2A). Naproti tomu léčba kvetiapinem v závislosti na dávce zkrátila životnost červů (obr. 2B). Křivky dávka-odpověď jsou ukázány na obr. 2C. Tato zjištění dále podporují klíčovou roli D2R při regulaci životnosti červů.

Obr. 1 Dopamin D1- a D2-podobné receptory opačně regulují délku života v Cistanche. A Křivky přežití různých kmenů červů kultivovaných při 20 stupních (mutantní kmeny byly porovnány s divokým typem N2: ns=nevýznamné; **** označeno P<0.0001, log-rank test). B Fast body movement spans of different worm strain cultured at 20 °C (mutant strains were compared with the N2: **, P <0.01, log-rank test). C Progeny produced per day by different worm strains. D The number of worms with different reproductive lifespans. E The developmental stage of different worm strains reached 2.5 days post-hatching. (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

Aripiprazol prodlužuje životnost přípravku Cistanche

přes DOP‑2 Abychom určili, zda prodloužení životnosti zprostředkované aripiprazolem závisí na D2R, nejprve jsme testovali lék na mutantní kočce s deficitem syntézy dopaminu-2. Aripiprazol nedokázal prodloužit životnost u mutanta cat-2 (obr. 3A), což naznačuje, že účinek aripiprazolu na prodloužení životnosti vyžaduje dopaminovou signalizaci. Dále jsme zaměstnali dop-2; dop-3 dvojitou mutantou a zjistili, že nebyl citlivý na léčbu aripiprazolem (obr. 3B).

Abychom zjistili, který z těchto dvou receptorů přispívá k efektu prodloužení životnosti, testovali jsme každý jednotlivý mutant. Výsledky ukázaly, že aripiprazol neprodloužil životnost dop-2 mutantu (obr. 3C), zatímco dop-3 mutant vykazoval robustní prodloužení životnosti po léčbě aripiprazolem (obr. 3D). Tyto nálezy ukázaly, že prodloužení životnosti aripiprazolem bylo uděleno jeho působením na DOP-2.

Aripiprazol zprostředkovává prodloužení životnosti prostřednictvím D2R signalizace

DOP-2 signály prostřednictvím cest Go [8, 23]. Abychom identifikovali DOP-2 downstream efektory zprostředkovávající aripiprazolem indukovaný efekt prodlouhověkosti, nejprve jsme testovali mutant postrádající GOA-1, Cistanche ortolog proteinu Go [24]. Jak se očekávalo, GOA-1 je vyžadována pro prodloužení životnosti vyvolané aripiprazolem (obr. 4A). D2R inhibuje adenylylcyklázu a tím potlačuje produkci intracelulárního cyklického AMP (cAMP) a aktivitu proteinkinázy A (PKA) [25]. Bylo prokázáno, že dráha cAMP-PKA zprostředkovává délku života a odpovědi DR [26–28]. acy-1 kóduje adenylylcyklázu a reguluje produkci cAMP v Cistanche [29]. Genom Te Cistanche kóduje katalytickou podjednotku PKA (KIN-1) a regulační podjednotku PKA (KIN-2) [30–32]. Vazba cAMP na KIN-2 má za následek uvolnění aktivního KIN-1 [29]. Výsledky ukázaly, že prodloužení životnosti při léčbě aripiprazolem bylo pouze částečně závislé na ACY-1 a KIN-1 (obr. 4B, C).

Obr. 2 Farmakologická aktivace nebo inhibice D2R má opačné účinky na životnost Cistanche. A Křivky přežití divokých (N2) červů kultivovaných při 20 stupních na NGM miskách obsahujících různé koncentrace aripiprazolu (Ari). Jako kontrola bylo použito ošetření DMSO. B Křivky přežití červů N2 ošetřených uvedenými koncentracemi kvetiapinu (Que) nebo DMSO při 20 stupních. (léčba aripiprazolem a kvetiapinem byla porovnána s léčbou DMSO: **indikováno P<0.01. ***, P <0.001. ****, P <0.0001, log-rank test). C Dose-response curve of aripiprazole (Ari) and quetiapine (Que) treatment. (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

Fig. 3 Aripiprazole extends the lifespan of Cistanche through DOP-2. Survival curves of mutant cat-2 (A); dop-2; dop-3 (B); dop-2 (C); dop-3 (D) treated with 100μM of aripiprazole or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not significant with P >0.05; ****uvedeno P<0.0001, log-rank test) (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

kóduje čtyři homology PKC (tpa-1, pkc-1, pkc-2 a pkc-3) a dva homology PKD (dkf-1 a dkf{{5} }) [5]. Ze čtyř homologů PKC, pkc-1, pkc{8}} a tpa- 1 byly vyžadovány pro aripiprazol k prodloužení životnosti, zatímco pkc-2 byly postradatelné (obr. 4E–H) . U dvou homologů PKD bylo prodloužení životnosti zprostředkované aripiprazolem závislé na dkf-1 spíše než dkf-2 (obr. 4I, J). Tyto poznatky naznačují, že aripiprazol může prodloužit životnost jak prostřednictvím PKC, tak PKD. Abychom dále potvrdili roli dráhy DGK-PKC/PKD, testovali jsme také mutanty egl-30 a egl{18}}, u kterých se předpokládá, že mají narušenou produkci DAG, a tím snižují aktivitu PKC/PKD [34]. Jak se očekávalo, aripiprazol nedokázal prodloužit životnost u obou mutantů (obr. 4K, L), dále podpořil klíčovou roli dráhy DGK PKC/PKD v prodloužení životnosti zprostředkované aripiprazolem. Celkově vzato aripiprazol zprostředkovává prodloužení života prostřednictvím GOA-1-DGK-1-PKC/PKD, ale může být pouze částečně závislý na dráze cAMP-PKA. Aripiprazol prodlužuje životnost červů prostřednictvím mechanismu dietního omezení (DR) DR výrazně oddaluje proces stárnutí u mnoha druhů [38]. Několik fenotypů souvisejících s DR u Cistanche zahrnovalo zvýšené zdraví, snížené chování při krmení, zmenšení velikosti mláďat, prodloužené období rozmnožování a snížené ukládání lipidů [39, 40]. Proto jsme chtěli vědět, zda dopaminová signalizace a léčba aripiprazolem mohou modulovat délku života prostřednictvím mechanismů DR. Nejprve jsme testovali aripiprazol na dlouho žijícím mutantu eat-2, genetickém modelu DR s deficitem pumpování hltanu [41]. Aripiprazol dále neprodloužil životnost mutanty eat-2 (obr. 5A), což naznačuje, že přínosy aripiprazolu na životnost byly skutečně poskytovány mechanismem DR. Bylo také zkoumáno několik fenotypů souvisejících s DR. Kromě prodloužené délky života měla pro zdravé stárnutí velký význam také délka zdraví, která odráží kvalitu prodloužené délky života. Aripiprazol prodlužoval životnost přípravku Cistanche způsobem závislým na dávce, což bylo spojeno s jeho vlivem na délku života. Aripiprazol v koncentraci 100 μM vedl k maximálnímu zvýšení (87,5 procenta) rozpětí zdraví zvířat N2 (obr. 5B). Léčba aripiprazolem také snížila celkové potomstvo produkované na červa, a to i při delší reprodukční periodě (obr. 5C, D). Kromě toho barvení olejovou červení O ukázalo, že červi léčení aripiprazolem měli sníženou akumulaci lipidů (obr. 5E, F). Rychlost pumpování hltanu pozitivně koreluje s příjmem potravy u Cistanche. Jednou přímou příčinou efektu podobného DR je snížený příjem potravy v důsledku snížené rychlosti pumpování hltanu, jako je ta pozorovaná u mutanta eat-2. Jak je znázorněno na obr. 5G, červi N2 léčení aripiprazolem vykazovali sníženou rychlost faryngeálního čerpání, což dále naznačuje, že aripiprazol spustil stav podobný DR v Cistanche.

Obr. 5 Aripiprazol prodlužuje životnost červů prostřednictvím mechanismu dietního omezení. A Křivky přežití mutanty eat-2 ošetřené 100μM

of aripiprazole (Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and Ari treatment: ns=not signifcant, P >0 .05. **, P<0.01. ****, P <0.0001, log-rank test). B Fast body movement spans of wild-type (N2) worms cultured at 20 °C on NGM plates containing indicated concentrations of aripiprazole (Ari) or DMSO. C, D Changes in brood size (C) and reproductive span (D) of N2 animals treated with or without 100μM of aripiprazole (Ari) (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ****, P <0.0001, t-test). E Representative images of ORO staining of worms treated with or without aripiprazole (Ari) for 7days. Scale bar=200μm. F Relative ORO intensity of worms treated with or without aripiprazole for 7days (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ****, P <0.0001, t-test). G Pharyngeal pumping rate of N2 worms treated with 100μM of aripiprazole (Ari) or DMSO for 5days (comparison between DMSO and Ari treatment: **** indicated P <0.0001, t-test). (see Additional fle 2 for supporting data). The brood size assay was performed in two independent biological replicates. Other experiments were performed in three independent biological replicates

Aripiprazol zprostředkovává prodloužení životnosti podobné DR prostřednictvím dráhy AAK-2-DAF-16. Abychom dále rozebrali možné mechanismy prodloužení životnosti podobné DR zprostředkované aripiprazolem, zkoumali jsme DAF-16, homolog Cistanche savčí transkripce FOXO faktor, o kterém je známo, že hraje ústřední roli v délce života a regulaci DR [42]. Je pozoruhodné, že účinek aripiprazolu na prodloužení životnosti byl zcela zrušen u mutanty daf-16 (obr. 6A). DAF-16 se za normálních podmínek nachází v cytosolu. Po aktivaci se DAF-16 přemístí do jádra, aby spustil transkripci různých genů, které regulují odolnost vůči stresu,

metabolismus, reprodukci a dlouhověkost. Červi TJ356 s DAF značeným zeleným fluorescenčním proteinem (GFP)-16 skutečně vykázali zvýšenou akumulaci DAF-16 v jádře po ošetření aripiprazolem (obr. 6B, C), což naznačuje, že aripiprazol zprostředkovává DR - jako životnost

rozšíření prostřednictvím DAF-16. V mechanismu podobném DR signalizace inzulínu/inzulínu podobného růstového faktoru 1 (IGF-1), tichý regulátor informací

Fig. 6 Aripiprazole mediates DR-like lifespan extension through the AAK-2-DAF-16 pathway. A Survival curve of the daf-16 mutant treated with 100μM of aripiprazole (Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not signifcant with P >0.05, log-rank test). B Reprezentativní snímky červů s cytosolickou, intermediární a jadernou lokalizací DAF-16 v transgenních kmenech TJ356. Měřítko=50μm. C Percentil zvířat TJ356 léčených 100uM aripiprazolem (Ari) nebo DMSO vykazující cytosolickou, střední nebo jadernou lokalizaci. D–J Křivky přežití mutanta daf-2 (D), věk-1 (E), akt-1 (F), akt-2 (G), pane{{ 12}}.1 (H), aak-2 (I), par-4 (J) ošetřené 100 μM aripiprazolu

(Ari) or DMSO at 20 °C (comparison between DMSO and aripiprazole (Ari) treatment: ns=not significant with P >0.05. ** označeno str<0.01. ****, p<0.0001, log-rank test) (see Additional fle 2 for supporting data). Experiments were performed in three independent biological replicates

zvířatům N2 (obr. 6H), což ukazuje, že prodloužení životnosti zprostředkované aripiprazolem bylo také nezávislé na SIR-2.1.

Bylo prokázáno, že aripiprazol aktivuje savčí AMPK v buňkách PC12 [43, 44]. Proto jsme předpokládali, že aripiprazol může působit prostřednictvím AAK-2 a zprostředkovávat prodloužení délky života. Jak ukazuje obr. 6I, aripiprazol nedokázal prodloužit životnost aak-2

mutant, což naznačuje, že aak-2 je nezbytný pro účinky ripiprazolu na délku života. Dále jsme testovali mutant nesoucí mutaci v homologu jaterní kinázy B1 (LKB1) Cistanche PAR-4, upstream kinázy AMPK. Mutant par-4 nevykazoval žádné prodloužení životnosti po léčbě aripiprazolem (obr. 6J), což dále podpořilo hypotézu, že prodloužení životnosti zprostředkované aripiprazolem vyžaduje aktivitu AAK-2.

Požádejte o více:E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950