ČÁST Ⅰ: Infekce SARS-CoV-2 postihuje tkáně včetně srdce a ledvin

další informace:ali.ma@wecistanche.com

ČÁST Ⅰ: Infekce SARS-CoV-2 na modelu syrského křečka způsobuje zánět a dysregulaci interferonu typu I v dýchacích i nerespiračních tkáních včetně srdce a ledvin

Magen Ellen Francis, Una Goncin a kol.

Úvod

SARS-CoV-2(těžká akutnírespiračníkoronavirus 2), který způsobuje COVID-19 (koronavirus 2019), se objevil na konci roku 2019 s následnými masivními dopady na veřejné zdraví a ekonomiku[1,2].SARS-CoV-2je jednovláknový RNA virus s pozitivním smyslem z čeledi Coronoviridae, rodu Betacoronavirus[3], a od svého vzniku vedl k 1. červnu 2021 k více než 170 milionům potvrzených případů a 3,5 milionům úmrtí po celém světě [4]. Ačkoli se dříve předpokládalo, že koronavirové infekce u lidí způsobují pouze mírné příznaky podobné nachlazení, objevují se novější koronaviry, SARS-CoV (těžká akutnírespiračníkoronavirus) a MERS-CoV (Střední východrespiračnísyndrom koronaviru), jsou spojeny s širokou řadourespiračnía nerespirační symptomy [5,6], v rozsahu od mírných po těžké, vedoucí k orgánovému selhání a smrti [Z. Byly hlášeny i asymptomatické případy[8]. Vzhledem k zátěži pro veřejné zdraví, stejně jako k rozsahu závažnosti onemocnění, vývoj zvířecích modelů za účelem studiaSARS-CoV-2patogeneze a identifikovat protiopatření je velmi důležité. Hodnocení reakce hostitele na virovou infekci in vivo je zásadní pro identifikaci faktorů hostitele regulujících závažné onemocnění a také biomarkerů, které mohou pomoci informovat o opatřeních podpůrné péče o pacienty.

Posouzení reakce hostitele naSARS-CoV-2vedl k cennému náhledu na progresi onemocnění a možné imunitní mechanismy vedoucí k závažným onemocněním. Nyní bylo široce prokázáno, že závažné případy COVID-19 u lidí jsou často doprovázeny zvýšenou expresí zánětlivých genů, včetně interleukinu-6(IL-6), interleukinu-1 beta(IL-1beta) a tumor nekrotizující faktor (TNF) [9-11]. PředSARS-CoV-2bylo známo, že koronaviry jsou schopny regulovat odpověď na interferon typu I[12,13]. Několik studií zjistilo, že odezvy interferonu typu I jsou v průběhu významně otupenySARS-CoV-2infekce, což naznačuje, že to může také přispět ke špatným výsledkům COVID{0}}[14,15]. Tato klinická data naznačují potenciální markery patogeneze pro další experimentální výzkumy.

Syrští křečci byli jedním z mála živočišných druhů identifikovaných na počátku pandemie jako produktivně infikovaníSARS-CoV-2a potenciálního použití pro preklinický vývoj a analýzu in vivo[16]. Křečci byli původně určeni jako náchylní k SARS-CoV [17] a od té doby se ukázalo, že jsou vzorem proSARS-CoV-2[18]. Křečci jsou schopni podporovatSARS-CoV-2replikace v rámci nižšírespiračnítrakt[18-20] s určitými podobnostmi s infekcí a dynamikou onemocnění jako u lidí, ačkoli se doba infekce zdá být kratší u křečků[21]. U fretek nebylo prokázáno, že podporují infekci v plicích, protože virus byl detekován pouze v horní části plicrespiračnítrakt naznačuje, že tento model může být užitečný pro studie přenosu [22]. Navíc nebylo prokázáno, že myši jsou citlivé na původní WuhanSARS-CoV-2virus. Bylo také prokázáno, že křečci vytvářejí účinnou protilátkovou odpověď a byli využíváni jak pro vakcíny COVID{0}}, tak pro studie léčby[19,20,23]. Stejně jako u jiných netradičních zvířecích modelů chybí pro křečka specifická biologická činidla pro charakterizaci imunitních odpovědí a mechanismů patogeneze[24].

Zde jsme zkoumali imunitní odpověď a patogeneziSARS-CoV-2infekce u křečků k určení mechanismů onemocnění a postižení specifických orgánů, jako jsou plíce,srdce, aledvinaprotože COVID-19 je multisystémové onemocnění.SARS-CoV-2inokulovaným syrským křečkům byly odebírány vzorky během 15-denního časového průběhu pro virologickou a imunologickou analýzu pomocí qRT-PCR, analýzu transkriptomu, testy titrace viru a imunohistochemii (IHC). Therespiračnítrakt měl vysokou zátěž replikací viru jak v horní, tak v dolní oblasti se specifickým oslabením odpovědi na interferon typu I. Zatímco jsme našli jen málo důkazů o infekčním viru mimorespiračnítraktu byla virová RNA přítomna v několika orgánech včetněledviny, srdce, lymfatické uzliny a játra se současnou expresí zánětlivých mediátorů, jako je IL-6, TNF a IL-1beta. Plíce, stejně jako mimoplicní orgány, vykazovaly známky infiltrace zánětlivých buněk vedoucí k poškození tkáně. Dohromady jsme definovali křeččí model imunopatogeneze v kontextu COVID-19, který lze použít k identifikaci korelátů ochrany a nemoci, pro hodnocení lékařských protiopatření.

Klikněte pro cistanche účinky na onemocnění ledvin

Výsledek

SARS-CoV-2-naočkovaní křečci mají ztrátu hmotnosti, která koreluje s virovou zátěží, infekčním virem vrespiračnítraktu a virové RNA v nerespiračních tkáních

Syrští křečci jsou náchylní k infekciSARS-CoV-2což naznačuje, že mohou být cenné pro výzkum imunopatologie a mechanismů onemocnění[20]. Křečci ve věku 6-8 týdnů byli naočkováni intranazálněSARS-CoV-2 at 10° TCIDs0. The animals were monitored for temperature and weight throughout the course of the infection. As typical during viral infection in small animals, hamsters began showing a decrease in temperature by day 1 post-inoculation(pi)(S1A Fig)which returned to baseline between day 3 and 7 (S1B Fig). Inoculated hamsters began losing weight on day 2 pi, with weights being significantly different from baseline on days 3 to 7. Weight loss was most severe on day 6 pi where the average body weight of the inoculated animals was 88.26% of the original weight (Fig 1A). After day 6, there was a steady increase in weight over the remaining time course on average recovering to baseline by day 12. Individual animals showed two different trajectories of weight loss: mild (~4%weight loss) and severe(>15% ztráta hmotnosti) (obr. 1B). Žádné zvíře neztratilo více než 20 procent své původní hmotnosti a také dosáhlo dalších kritérií pro humánní koncový bod, jak je definováno v metodách během studie. Zvířata byla vyjmuta ze studie v předem stanovených koncových dnech pro odběr vzorků, proto individuální hmotnosti pro všechna zvířata nejsou zobrazeny.

COVID-19 postihuje několik orgánových systémů u lidí, včetněsrdce, ledvinyjátra, slezina a tlusté střevo[25,26]. Proto jsme se zajímali o stanovení tropismu viru a související imunopatologie v celém těle infikovaných křečků, abychom získali vhled do onemocnění. Zvířata byla vyjmuta ze studie ve dnech 0, 2, 5, 8, 12 a 15 pi, aby se vyhodnotily tkáňově specifické reakce na nekropsii a analýzu imunopatologie. Krev, nosní výplachy a tkáně (respiračnía nerespirační) byly shromážděny. Virový tropismus byl hodnocen pomocí qRT-PCR proSARS-CoV-2titrace genu obalu (E) a viru pomocí testů infekční dávky 50 (TCIDs0) v tkáňové kultuře (obr. 2). Analýza exprese genu E je na grafech znázorněna hnědými kroužky. Analýzarespiračnítraktu odhalila vRNA přítomnou v nosních skořepinách, průdušnici a všech čtyřech testovaných plicních lalocích (pravý kraniální, pravý střední, pravý kaudální a přídatný) ve dnech 2, 5 a 8 pi. Virová RNA byla stále detekována v pravém středním plicním laloku a v přídatném plicním laloku jednoho zvířete v den 12 pi. Analýza živého virového titru, znázorněná šedými kroužky, ukázala, že infekční virus byl přítomen v nosních skořepinách ve dnech 2 (7,5 TCID0/ml(Logl0)) a 5 (6 TCID{{ 11}}/mL(Logl0))pi. Infekční virus dosáhl vrcholu v plicích 2. den při~9 TCID/ml (Log10) v pravé střední plíci a byl přítomen až do 5. dne. Průdušnice měla nejnižší hladiny viru ze všechrespiračnítkáně, která byla přítomna pouze 2. den (~3 TCIDso/ml(Logl0)).vRNA byla také detekována v nerespiračních tkáních včetněsrdce, ledvina, tlustého střeva a mediastinální lymfatické uzliny na nízkých až středních úrovních. Mediastinální lymfatická uzlina měla nejvyšší hladinu vRNA,~5 TCID (Log10), a byla jedinou nerespirační tkání, která byla pozitivní na infekční virus.

Obr. 1. Intranazální infekce SARS-CoV-2 u křečků vede k významné ztrátě hmotnosti.Syrští křečci byli intranazálně inokulováni těžkou akutnírespiračnísyndrom koronaviru 2 (SARS-CoV-2) při 105 TCID50. Hmotnost (A a B) byla zaznamenávána 15 dní po inokulaci. Průměrné výsledky (A) ukazují průměr. Jednotlivé výsledky představují každé zvíře (B). označuje p-hodnotu<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" standard="" error="">

Abychom určili, zda bylo rozlišení viru způsobeno vyvoláním neutralizačních protilátek, dále jsme kvantifikovali titry neutralizačních protilátek u infikovaných křečků v průběhu časového průběhu (Eig 3A). Plazma byla izolována z krve odebrané při pitvě, aby byla použita pro neutralizační testy při 100 TCID na reakciSARS-CoV-2. Neutralizační protilátky byly detekovány již 8. den pi, v koncovém titru přibližně 63 (geometrický průměr). Toto se zvýšilo na geometrický průměr 160 v den 12 a vyvrcholilo v den 15 při geometrickém průměru 587. Tato pozorování naznačila, že křečci jsou schopni vyvolat vysoké titry neutralizačních protilátek poSARS-CoV-2infekce. Během studie byly shromažďovány nosní výplachy, aby se určilo vylučování viru ze svrškurespiračnítract.vRNA byla detekována v nosních výplachech až do 12 dnů po inokulaci živým virem pozorovaným ve dnech 2 a 5, přičemž vrchol v den 2 dosáhl těsně nad 6 TCID5o/ml (Log10). Porovnali jsme titr živých virů nalezený v nosních výplachech všech zvířat v den 5 s jejich příslušným úbytkem hmotnosti v tento den (obr. 3B). Pro tuto analýzu byla použita Pearsonova korelace pro normálně distribuovaná data, aby se určilo, zda existuje lineární vztah mezi hmotností infikovaných zvířat a titrem viru v nosních výplachech v den 5 po inokulaci, přičemž den 5 je dnem, kdy některá zvířata začnou vylučovat virus. Zjistili jsme Pear-sonovu korelaci -0.68 tak, že jak se titr viru v nosních výplachech zvyšoval, měla zvířata zvýšenou pravděpodobnost závažnějšího úbytku hmotnosti (p-hodnota =0.00242). Kromě toho jsme hodnotili vztah mezi titrem plicního viru a ztrátou hmotnosti v den 5 pi. Protože každý den byla shromážděna pouze 3 zvířata, soubory dat pro posouzení korelace jsou omezeny velikostí našeho vzorku. Přestože tento počet datových souborů nesplňuje požadovaný počet měření, provedli jsme Pearsonovu korelaci a zjistili jsme negativní, i když nevýznamnou korelaci mezi plicním virovým titrem a ztrátou hmotnosti 5. den po inokulaci. Na základě virového titru z příslušných plicních laloků hodnoceného ve srovnání s hmotností zvířete měla pravá kraniální plíce R-hodnotu -0.91(p-hodnota=0.27), pravá střední plíce měla hodnotu R -0,92(hodnota p=0,25) a pravá ocasní plíce měla hodnotu R -0,58 (hodnota p{{39 }}.61)(S2 obr.). Dodatečné posouzení by mělo být provedeno na více zvířatech, aby se získala důvěra ve vztah mezi nimiSARS-CoV-2titr viru v plicích a ztráta hmotnosti celého zvířete.

Obr. 2. Živý virus SARS-CoV-2 je omezen na respirační tkáně a mediastinální lymfatické uzliny, zatímco virová RNA je přítomna v mimoplicních orgánech.Zvířata byla ze studie vyřazena v den 0 před infekcí a také ve dnech 2, 5 8, 12 a 15 po inokulaci.respiračníodebrané tkáně zahrnovaly nosní skořepinu, průdušnici a plíce (pravý kraniální lalok, pravý střední lalok, pravý kaudální lalok, akcesorní lalok). Analyzované mimoplicní orgány zahrnovaly mediastinální lymfatické uzliny,srdce, ledvinajátra, slezina a tlusté střevo. Všechny tkáně byly odebrány pro kvantifikaci viru detekcí qPCRSARS-CoV-2E gen v ekvivalentech TCID50/ml na základě standardní křivky virové RNA s použitím RNA extrahované ze zásobySARS-CoV-2se známou koncentrací (TCID50/ml) (hnědá). Infekční virus byl kvantifikován pomocí testu infekční dávky v tkáňové kultuře a vyjádřen v TCID50/ml (šedá). TCID50/ml byla vypočtena pomocí Reedovy a Muenchovy metody. Tečkovaná čára představuje limit detekce v testu živé virové zátěže na základě nejnižšího ředění vzorku. Limit detekce pro qPCR detekci genu E byl 101 TCID50/ml. Datové body představují jednotlivá zvířata a čára představuje průměr.

Pneumonie a plicní patologie jsou často určujícím znakemrespiračnívirové infekce, což má za následek významnou morbiditu a mortalitu. K určení rozsahu poškození plic vSARS-CoV-2infikovaných křečků a schopnost křečků rekapitulovat to těžkérespiračníu lidských pacientů s COVID{0}} jsme zkoumali patogenezi onemocnění v levé plíci křečků v průběhu infekce (obr. 4). Mikroskopická analýza barvení H&E ukázala zvýšení poškození v plicích v průběhu infekce, přičemž nejzávažnější patologie byla zaznamenána v den 8 pi, který částečně vymizel do dne 15 (Eig 4A). Neinfikovaní křečci měli čistý alveolární prostor bez známek infiltrace zánětlivých buněk nebo krvácení. V den 2 pi byla přítomna infiltrace mononukleárními buňkami v alveolárních a peribronchiálních prostorech (žlutá šipka). Infiltrace buněk pokračovala 5. den se zvýšenou infiltrací. 8. den byl peribronchiální prostor charakterizován přítomností zánětlivých mononukleárních buněk. Bylo zaznamenáno odlupování epiteliálních buněk v bronchiolech (černá šipka) a v celé tkáni bylo možné pozorovat krvácení (červená šipka). Krvácení vymizelo do 12. dne, ačkoli hyperplazie byla evidentní (zelená šipka). 15. den byla pozorována tvorba hyalinní membrány (modrá šipka) se současným snížením infiltrace zánětlivých buněk.

Obr. 3. Virové vylučování SARS-CoV-2 se zvyšuje se závažností klinických výsledků, ale snižuje se, protože neutralizační protilátky jsou detekovatelné ve zvířecí plazmě.Pro kvantifikaci viru pomocí qPCR detekce byly odebrány nosní výplachySARS-CoV-2E gen (hnědý) a vyjádřeno v ekvivalentech TCID50/ml. Pro kvantifikaci infekčních virů byly provedeny testy živé virové zátěže (Grey). Infekční titry nosních výplachů byly stanoveny tkáňovými kultivačními infekčními testy titrace dávky a výsledná TCID50/ml byla vypočtena pomocí Reedovy a Muenchovy metody. LOD=limit detekce pro testy živé virové zátěže. Titry neutralizace viru byly stanoveny standardními neutralizačními testy s použitím plazmy odebrané v průběhu časového průběhu (černá) (A). Titr živého viru v nosních výplachech negativně koreloval se ztrátou hmotnosti 5. den po infekci. R-hodnota=-0,68 (p-hodnota=0,00242) (B).

Abychom ověřili výsledky virové zátěže v plicích a také vizualizovali umístění viru, provedli jsme IHC barvení levého plicního laloku, abychom detekovaliSARS-CoV-2spike protein. U neinfikovaných křečků nebyl detekován žádný virový protein, což naznačuje specifičnost použité protilátky. V den 2 pi měla levá plíce významné zabarvení (černá šipka), což naznačuje akumulaciSARS-CoV-2spike antigen (Eig 4B). Barvení bylo nejvýraznější v epiteliálních buňkách bronchiolu, s difúzním barvením v epiteliálních buňkách alveolární stěny. Pátý den bylo v dýchacích cestách a alveolárních buňkách přítomno světlé barvení (modré šipky). Žádné barvení nebylo detekováno v den 8 pi, kdy se obrazy jevily podobně jako obrazy neinfikovaného bronchiolu.

Obr. 4. Inokulovaní křečci mají významný zánět v plicích, který se shoduje s barvením SARS-CoV-2 Spike antigenem.Každému zvířeti byla při pitvě odebrána levá plíce a před zalitím parafinovým blokem a barvením H&E byla perfundována 10% formalínem. Červené šipky označují krvácení; zelené šipky označují hyperplazii; žluté šipky označují infiltraci mononukleárními buňkami; černé šipky představují odlupování buněk; modrá šipka představuje tvorbu hyalinní membrány (A). Plíce byly obarveny na přítomnostSARS-CoV-2spike protein pomocí IHC s použitím anti-spike králičí monoklonální protilátky. Černé šipky označují vysoké množství barvení virovým antigenem a modré šipky indikují přítomnost malého množství barvení virovým antigenem (B). Celá plíce byla zvážena při nekropsii a celková plicní patologie byla reprezentována jako procento celkové tělesné hmotnosti zvířete (C). V každém časovém bodě byla analyzována alespoň 3 zvířata. označuje p-hodnotu menší<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" se.="" slides="" were="" visualized="" and="" imaged="" using="" the="" leica="" dmi100="" brightfield="" microscope="" and="" dmc5400="" 20="" mp="" color="" cmos="" camera.="" images="" were="" captured="" and="" 10x="" and="" 40x.="" the="" images="" shown="" are="" representative="" of="" 3="" animals="" per="" group,="" per="" time="">

Pro kvantifikaci zánětu a infiltrace zánětlivých buněk, jakož i edému v plicích, byly analyzovány hmotnosti plic při pitvě. Celá plíce byla zvážena při pitvě a byl vypočten poměr k tělesné hmotnosti zvířete a poté vyjádřen jako procento (obr. 4C). Ve dnech 0 a 2 pi byly plíce méně než jedno procento tělesné hmotnosti křečka . To se zvýšilo na významný vrchol v den 5 v průměru těsně pod 4 procenty tělesné hmotnosti. Hmotnost plic se snížila na 1 procento a zůstala statisticky významná od výchozí hodnoty během zbývajícího časového průběhu.

Exprese hostitelského genu a imunopatologické profilování naznačuje výraznou zánětlivou odpověď s otupělou signalizací interferonu typu I vrespiračnítrakt

Vzhledem k tomu, že údaje o lidech zkoumaly systémové hladiny cytokinů v krvi, zajímalo nás stanovení imunitních odpovědí v místě infekce, stejně jako v jiných postižených orgánech. Zkoumali jsme hladiny související s odpovědí na interferon typu I (IFN (interferon)-beta, STAT (převodník signálu a aktivátor transkripce)2, IRF (regulační faktor interferonu)1, IRF3 a TLR (Toll-like receptor)3) ,typ II související s odpovědí na interferon (IFN-gama,IRF2, STAT1, CXCL10) a vrozené/adaptivní markery a mediátory (CD3, CD4,CD8A, CD19,IL-2, TGF (transformující růstový faktor)-beta ,IL-21,IL-10,IL-4,IL-5,IL-5R,IL-13,IL-12 ,CD14,PKR, CCR3, CCL20, CCL22,IL-1beta, IL-6, TNF).

Naznačily to lidské klinické zprávySARS-CoV-2infekce vede k dysregulaci odpovědi na interferon[14]. Zkoumali jsme reakce IFN typu I a I vyhodnocením exprese IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3 a TLR3 pro reakci typu I a IFN-gama, IRF2, STAT1 a CXCL10 pro reakci typu II (obr. . IFN-beta byl signifikantně downregulován jak v nosních skořepinách, tak v pravé lebeční plíci s největší inhibicí v den 2. Downstream regulátory IFN odpovědi typu I byly také sníženy, včetně STAT2 a IRF1, které dosáhly maximální inhibice později v průběhu času, protože stejně jako IRF3 a TLR3, které nevykazovaly žádné zvýšení genové exprese. Zkoumali jsme také odpověď IFN typu II a také geny, jejichž odpovídající proteiny působí v obou IFN drahách. IFN-gama, IFN typu II, vykazoval zvýšenou regulaci v nosních skořepinách a nejvýrazněji v plicích (obr. 5). V obou tkáních došlo ke zvýšení na vrchol, po kterém následovalo vymizení do 15. dne pi. Hladiny IFN-gama v nosních turbinátech dosáhly vrcholu 8. den při 12násobné změně, zatímco hladiny v plicích dosáhly vrcholu 5. den při násobné změně 17.respiračnítkáních, antagonista IFN typu I IRF2 vykazoval signifikantní zvýšení, s vrcholem 8. den v nosní skořepině a 2. den v pravé kraniální plíci, při násobných změnách 24 a 25, v daném pořadí. Molekuly obecné odpovědi na IFN také vykazovaly významné zvýšení. STAT1 vykazoval silnou upregulaci v obou tkáních ve dnech 2 a 5, zatímco CXCL10 dosáhl vrcholu v den 2 v nosních skořepinách při násobné změně téměř 70. V plicích CXCL10 dosáhl vrcholu dne den 8 při násobné změně 30, ale neustoupila zpět na výchozí hodnotu a zůstala významně zvýšená ve srovnání s naivními zvířaty ve dnech 12 a 15 pi. Z těchto údajů se zdá, že zatímco odpověď na IFN typu II zůstává nedotčena, křečci jsou inokulovániSARS-CoV-2vykazují dysregulovanou odpověď typu IIFN vrespiračnípapírové kapesníky.

Obr. 5. Analýza genové exprese v respiračních tkáních křečků infikovaných SARS-Cov{2}} odhaluje významnou dysregulaci interferonu se současným zvýšením zánětlivých a imunitních mediátorů.qRT-PCR byla provedena na RNA extrahované z nosní mušle a pravé kraniální plicní tkáněSARS-CoV-2naočkovaných křečků. Vzorky byly hodnoceny na související reakci na interferon typu I (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), související s reakcí na interferon typu II (IFN-gama, IRF2, STAT1, CXCL10) a vrozenou/ adaptivní mediátory (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL- 10, IL-4, IL-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) pomocí primery specifické pro křeččí geny (tabulka 1). Změna násobku byla vypočtena prostřednictvím ACt proti výchozí hodnotě (den 0) s BACT jako provozním genem. Pro každý časový bod byla analyzována alespoň tři zvířata.

Kromě toho jsme také hodnotili vrozenou a adaptivní genovou regulaci. Celkově byly tyto geny upregulovány jak v nosních skořepinách, tak v pravých kraniálních plicích, přičemž nosní skořepiny typicky vykazovaly vyšší expresi (obr. 5). Nosní mušle měly maximální genovou expresi IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-4, IL-5R, IL-13 a CCR3 v den 5 pi, s nejvyšší expresí pocházející z TGF-betal při násobné změně 97, a IL-13 při 45.IL{14}} exprese dosáhla vrcholu v den 2 při násobné změně 38, ale zůstala v průběhu časového průběhu upregulována, významně 5. a 10. den. IL-5 exprese dosáhla vrcholu 12. den při násobné změně 21. V plicích se nejvyšší exprese na gen lišila: TGF-betal, IL{ {25}} a IL-13 vykázaly nejvyšší upregulaci v den 5; IL-10, IL-4 a IL-5 v den 8; a IL-2 v den 12. Markery specifické pro T lymfocyty byly nejvyšší v nosních skořepinách, s maximální genovou expresí 12. den a zůstaly vysoké 15. den. To naznačuje účast T lymfocytů, která byla dále podporována zvýšenou regulací Th2 cytokinů (IL-4 a TGF-betal), což ukazuje na celkovou odpověď T buněkSARS-CoV-2infekce. Proto jsme provedli IHC, abychom určili přítomnost buněk CD3 plus a CD20 plus vrespiračníCD3 plus barvení bylo koncentrováno do krevních cév (červené šipky) v neinfikované plicní tkáni bez barvení v alveolárních prostorech. Přítomnost buněk CD3 plus (obr. S3A, černé šipky) se v alveolárním prostoru v průběhu času zvyšovala, přičemž maximálního zbarvení dosáhlo 8. den po inokulaci a poté se intenzita snižovala dnes 15. Barvení CD20 nebylo detekováno v neinfikované tkáni. Malé množství buněk CD20 plus bylo detekováno ve dnech 2, 5 a 8 po inokulaci (obr. S3B, označeno černými šipkami), které se zmenšilo ve dnech 12 a 15, jak je naznačeno šedými šipkami.

Analýza zánětlivých markerů v nosních skořepinách ukázala významné přechodné zvýšení všech zánětlivých cílů, které odezněly ve dnech 12 a 15. IL-1beta dosáhl maximálních hladin 2. den pi při násobné změně 4{{7 }} příbuzní dnes 0 neinfikovaná zvířata (obr. 5). Odpovídající význam lze nalézt v tabulce S1. Naproti tomu tyto transkripty dosáhly vrcholu mezi 2. a 5. dnem, ale s nižší násobnou změnou ve srovnání s plícemi. V obou nosních skořepinách a v plicích zůstalo několik zánětlivých cytokinů zvýšeno ve srovnání s výchozí hodnotou až do dne 12 pi. Celkově vzato místa infekce vykazovala jasný nárůst zánětlivých markerů, zejména IL-6 v nosních skořepinách a TNF v plicích.

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅱ