Diferenciální exprese enzymů metabolizujících sfingolipidy u spontánně hypertenzních potkanů: Možný substrát pro náchylnost k poškození mozku a ledvin

edmund.chen@wecistanche.com

Abstraktní: Změny v metabolismu sfingolipidů, třídy biologicky aktivních molekul v buněčných membránách s přímým účinkem na vaskulární homeostázu, jsou stále více uznávány jako důležitý determinant u různých vaskulárních poruch. Není však jasné, zda se sfingolipidy podílejí na patogenezi cerebrovaskulárních apoškození ledvin. V této studii jsme hodnotili existenci možných abnormalit souvisejících s metabolismem sfingolipidů v mozku aledvinydvou dobře ověřených kmenů spontánně hypertenzních potkanů, modelů náchylných k mrtvici (SHRSP) a modelů odolných vůči mrtvici (SHRSR), ve srovnání s normotenzním kmenem potkanů ​​Wistar Kyoto (WKY). Naše výsledky ukázaly globální alteraci v metabolismu sfingolipidů jak v cerebrálních, tak ivledvinové tkáně obou hypertenzních kmenů ve srovnání s normotenzní krysou. V SHRSP však bylo výhradně detekováno několik defektů, jako je snížená exprese enzymů zapojených do metabolismu/katabolismu sfingosin{0}}fosfátu a de novo biosyntetických drah. Ačkoli jsou nutné další studie k plnému pochopení významu těchto zjištění, naznačují, že defekty ve specifických lipidových molekulách a/nebo jejich příbuzných metabolických drahách mohou pravděpodobně přispívat k patogenezi hypertenzního poškození cílových orgánů a mohou nakonec sloužit jako budoucí terapeutické cíle pro snížení vaskulární důsledky hypertenze.

klíčová slova:sfingolipidy; mrtvice; mozek; ledviny; SHR; WKY 

ÚvodHypertenze představuje hlavní zdravotní problém, který způsobuje specifické poškození orgánů a dramatické klinické následky, což vede v západních společnostech ke zvýšenému počtu úmrtí a invalidity [1–3]. Aby se snížila zátěž hypertenzních komplikací, je zapotřebí komplexnější pochopení základních etiopatogenetických mechanismů. V této soutěži může být mimořádně užitečná dostupnost zvířecích modelů, které mohou věrně napodobovat lidskou patologii a zároveň zjednodušit složitost, která je vlastní studiu lidských populací. V současné době je spontánně hypertenzní krysa náchylná k mrtvici (SHRSP), která vykazuje hlavní predispozici k mozkovým apoškození ledvin, zvláště když jsou krmeny dietou s vysokým obsahem soli/nízkým obsahem draslíku, představuje ideální model. Hypertenze a dietní faktory se chovají jako predisponující rizikové faktory pro potkany i lidi [4,5]. SHRSP ukazuje vyšší frekvenci cévních mozkových příhod při krmení japonskou dietou (JD) než její přísně příbuzná kontrola, mrtvice odolná (SHRSR), navzdory podobným hodnotám krevního tlaku [6]. za zmínku,poškození ledvin vždy předchází iktu [6]. Ačkoli základní molekulární mechanismy nejsou zcela pochopeny, důkazy naznačují, že výsledná vaskulární dysfunkce a následné strukturální léze podporujípoškození ledvina vývoj mrtvice.

CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL

V posledních letech se některé z mechanistických aspektů a determinant cerebrovaskulárních apoškození ledvinvýskyt byl identifikován v modelu SHRSP [7–12]. Zbývá však ještě mnohé objevit. Sfingolipidy, včetně ceramidů (Cer), sfingosinu a jeho fosforylované formy sfingosin-1-fosfátu (S1P), představují hlavní lipidové složky biologických membrán a modulují několik důležitých funkcí pro neuronální a neneuronální buněčné populace [13]. Neméně důležitá je však jejich klíčová role při tvorbě a funkci cév [13–15] a také v regulaci integrity hematoencefalické bariéry (BBB) ​​prostřednictvím modulace proteinů těsných spojení [16]. V tomto ohledu důkazy naznačují, že de novo syntéza sfingolipidů je zásadní pro zachování funkcí endoteliálních buněk [17,18], což pravděpodobně přispívá k vaskulární integritě a homeostáze. Bylo popsáno, že defektní metabolismus sfingolipidů je základem různých kardiovaskulárních onemocnění [19,20]. Dosud však nebyl předložen žádný přímý důkaz o kauzativní roli sfingolipidů v patogenezi hypertenzního poškození cílových orgánů. Přes nedostatek mechanistických detailů se ukázalo, že dráha S1P, bioaktivního lipidu, je během ischemie neuroprotektivní [21,22] a stimulace jeho receptorů vede k příznivým účinkům na zvířecím modelu mrtvice [23]. Je tedy možné, že existuje těsná interakce mezi mrtvicí a sfingolipidy. V této studii jsme zkoumali cerebrální aledvinovéexprese několika molekul zapojených do sfingolipidových drah u kmenů SHRSP i SHRSR, s ohledem na normotenzní kmen WKY. Naše zjištění poprvé zdůrazňují aberantní metabolismus sfingolipidů buď v mozku nebo v ledvinách u obou hypertenzních zvířecích modelů. Důležité je, že některé defekty byly detekovány výhradně u kmene SHSRP. Tyto důkazy naznačují, že změny ve specifických molekulách lipidů a/nebo jejich specifických drahách mohou potenciálně přispívat k patogenezi hypertenze a hypertenzního poškození cílových orgánů.

Výsledek

Hladiny enzymů metabolizujících S1P jsou v SHRSP narušenyAbychom odhalili, zda byla u kmenů SHRSP a SHRSR detekovatelná jakákoli potenciální porucha v metabolismu sfingolipidů, nejprve jsme zkoumali expresi molekul zapojených do syntézy a degradačních drah S1P (schematizované na obrázku 1). Za tímto účelem jsme hodnotili hladiny SPHK1 a 2 a také SGPL1 v mozkových aledvinovétkáně od obou spontánně hypertenzních potkanů ​​ve srovnání s kmenem WKY. Jak je uvedeno na obrázku 2, potkani SHRSP se vyznačovali významným snížením SPHK2 a také SGPL1 v mozku ve srovnání s WKY i SHRSR. Žádný rozdíl vledvinovéexprese všech enzymů byla detekována mezi třemi kmeny potkanů.

Hladiny receptorů S1P jsou aberantní u spontánně hypertenzních potkanůDůkazy naznačují, že modulace receptorů S1P může být prospěšná u ischemických modelů [23]. Abychom zjistili, zda by nějaká změna v jejich expresi mohla být případně spojena s fenotypy onemocnění, hodnotili jsme hladiny proteinů nejhojnějších receptorů, S1PR1-3 [24], u tří kmenů potkanů. Imunoblotovací analýza odhalila variace v expresi všech tří receptorů v závislosti na tkáni. Je zajímavé, že S1PR1 byl jediným receptorem, jehož exprese SHRSR se zvýšila jak v mozku, tak v ledvinách (obrázek 3A, 3B). Naopak, analýza tkání SHRSP neukázala žádnou změnu v expresi všech receptorů, kromě S1PR3, jehož hladiny se zvýšily v mozku, podobně jako ty detekované v SHRSR (obrázek 3E)

Exprese ceramidových syntáz je defektní ve více tkáních z modelů SHRSP a SHRSRPředchozí důkazy naznačují, že hladiny ceramidu jsou zvýšené v preklinických modelech cévní mozkové příhody i u lidských pacientů [25–27]. Abychom vyhodnotili, zda by metabolismus ceramidu mohl být ovlivněn u spontánně hypertenzních potkanů, což by případně mělo za následek zvýšené hladiny ceramidu, zkoumali jsme expresi ceramidsyntáz, o kterých se uvádí, že jsou nejhojnější v mozku (CerS1 a CerS2). a vledviny(CerS2 a CerS4) [28]. Jak je uvedeno na obrázku 4, analýza qPCR odhalila generalizovanou odchylku v expresi syntáz s určitými rozdíly mezi dvěma spontánně hypertenzními kmeny. SHRSP vykazoval zvýšené hladiny CerS1 mRNA v mozku ve srovnání s WKY nebo SHRSR (obrázek 4A) a snížené hladiny CerS6 v mozku.ledvinypodobně jako u SHRSR (obrázek 4D). Naopak, SHRSR byly charakterizovány sníženou expresí CerS2 mRNA v mozku i ledvinách (obrázek 4B, 4C).

Exprese SPTLC1 je snížena v tkáních SHRSPNedávné studie poukázaly na potenciální zapojení de novo biosyntézy sfingolipidů do hypertenze a vaskulárních onemocnění [29,30]. Abychom prozkoumali jakoukoli možnou souvislost mezi de novo sfingolipidovými cestami a cévní mozkovou příhodou, hodnotili jsme profily proteinové exprese SPTLC1 a 2, dvou podjednotek SPT, enzymů omezujících rychlost v de novo biosyntéze sfingolipidů [13], jak v cerebrálních, tak vledvinovépapírové kapesníky. Jak je uvedeno na obrázku 5A,B, potkani SHRSP se vyznačovali významným snížením SPTLC1 jak v mozku, tak vledviny.Je zajímavé, že SPTCL2 byl také snížen v mozku SHRSP ve srovnání s SHRSR (obrázek 5C).

Exprese 3-keto-dihydrosfingosinreduktázy je snížena u obou spontánně hypertenzních potkanůZměna v de novo biosyntéze sfingolipidů byla dále potvrzena analýzou enzymů 3-keto dihydrosfingosin reduktázy (KDSR) a ceramid desaturázy (DES), které se normálně účastní de novo syntézy sfingolipidů [13]. qPCR analýza ukázala významné snížení hladin exprese mRNA KDSR vledvinyjak SHRSP, tak SHRSR (obrázek 6B). Žádné další změny nebyly pozorovány.

Obrázek 2. Exprese enzymů metabolizujících S1P je defektní v mozkových tkáních z SHRSP. Reprezentativní oříznuté imunobloty a denzitometrická analýza SPHK1 (sfingosinkináza 1) (A,B), SPHK2 (sfingosinkináza 2) (C,D) a SGPL1 (S1P-Lyáza) (E,F) v mozkových a ledvinových tkáních z WKY, SHRSP a SHRSR. Při každém imunoblotu byly všechny vzorky analyzovány na stejném gelu. Nesousedící vzorky jsou odděleny černou čarou. Data jsou uvedena jako průměr ± SD, n {{10}}}/7 pro každou skupinu potkanů. * p < 0.{16}}5;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001="" (jednocestná="" anova,="" tukey="" post-test).="" hrubá="" data="" pro="" generování="" fifigury="" jsou="" uvedena="" v="" tabulce="" doplňkového="" materiálu="">

Diskuse

Navzdory obrovskému výzkumnému úsilí základních a klinických vědců, hypertenzní komplikace, jako je mrtvice aledvinovénemoci stále představují hlavní hlavní příčiny úmrtí na celém světě [1–3]. K zachování cerebrovaskulárního zdraví a zdraví ledvin je tedy zapotřebí znalost alternativních patogenních cest a nových cílů léčiv. Zkoumání metabolismu sfingolipidů, třídy biologicky aktivních molekul v buněčných membránách, které hrají klíčovou roli ve vaskulární homeostáze, může připravit cestu k novému horizontu porozumění. I když nové důkazy naznačují, že změny v metabolismu sfingolipidů, jako je S1P a ceramidy, mohou hrát roli u vaskulárních poruch a hypertenze [31], stále zůstává nejasné, zda se podílejí na patogenezi hypertenzního orgánového poškození. V této studii jsme se pokusili získat určité poznatky o metabolismu sfingolipidů u kmenů potkanů ​​SHRSP a SHRSR, dvou spontánně hypertenzních preklinických modelů s odlišnou náchylností kledvinovéa rozvoj cerebrovaskulárního poškození. Studii jsme provedli konkrétně na 8-týdenních krysách ve věku, kdy se u nich stala hypertenze, ale stále nemají poškození cílových orgánů. Prostřednictvím tohoto přístupu jsme se zaměřili na identifikaci jakéhokoli "sfingobiologického" podpisu, který se potenciálně podílí na odlišném výsledku hypertenzního onemocnění ve dvou modelech potkanů. Jako vhodná kontrola sloužil normotenzní kmen potkana. Naše zjištění poprvé ukázala, že oba modely hypertenzních potkanů ​​byly charakterizovány globální poruchou metabolismu sfingolipidů, ale jen málo změn bylo specifických pro kmen SHRSP nebo SHRSR. Zejména exprese SPHK2 i SGPL1 byla významně snížena pouze v mozku SHRSP. Snížení hladin SPHK2 může mít extrémně škodlivé účinky v mozku, kde je zvláště hojný v mikrovaskulárních endoteliálních buňkách a má protektivní roli proti ischemii vyvolané hypoxickým prekondicionováním [32]. Na druhou stranu může být snížení SGPL1 potenciálně toxické pro funkce neuronálních buněk [33].

Ve světle toho je možné si představit, že nerovnováha enzymů metabolizujících S1P s následnou defektní biologickou dostupností S1P může vést ke zvýšenému poškození cév. Možné zapojení S1P do regulace molekulárních mechanismů potenciálně spojených s mrtvicí vzešlo z důkazů, že hladiny S1PR1, který byl nedávno identifikován jako poziční kandidátní gen pro citlivost na sůl u SHRSP [22], se v tkáních SHRSR zvýšily. . Tyto výsledky naznačují možnou dvojí roli S1P při stanovení vaskulárního poškození a následného iktu. Ve skutečnosti by snížení biologické dostupnosti sfingolipidu S1P a/nebo defektní regulace jeho souvisejících drah mohlo zvýšit náchylnost k mrtvici v SHRSP. Naopak zvýšená exprese S1PR1, jejíž aktivace byla popsána jako prospěšná v experimentálních modelech mozkové ischemie [34–36], by mohla nakonec představovat protektivní faktor u SHRSR. Naše zjištění odhalila další zajímavý rozdíl mezi dvěma spontánně hypertenzními kmeny potkanů. Zvýšená exprese CerS1, detekovaná pouze v SHRSP, může naznačovat zvýšenou biologickou dostupnost cerebrálního ceramidu, která může odhalit toxicitu a potenciálně spojenou se zvýšenou náchylností k mrtvici. To je potvrzeno několika studiemi uvádějícími souvislost mezi zvýšeným obsahem ceramidů, ischemickou chorobou malých cév a hyperintenzitou bílé hmoty [37,38].

CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL

Dalším důležitým pozorováním odvozeným z naší studie je významné snížení SPTLC1 a 2 v SHRSP ve srovnání s SHRSR, ve kterém nebyly zjištěny žádné variace. Přestože oba hypertenzní kmeny sdílely některé defekty v expresi jiných genů zapojených do de novo syntézy sfingolipidů, snížení SPTLC jasně naznačuje klíčovou roli této metabolické cesty v patogenezi cerebrovaskulárního onemocnění. V této souvislosti nedávné důkazy naznačují, že endoteliální de novo syntéza sfingolipidů reguluje krevní tlak a endoteliální homeostázu [30], což zdůrazňuje kritickou roli de novo syntetizovaných sfingolipidů u vaskulárních onemocnění. Současná data mohou naznačovat, že de novo syntéza sfingolipidů by mohla být v SHRSP narušena. Naše studie je první, která se zabývá specifickými aspekty metabolismu sfingolipidů v souvislosti s mrtvicí. Ačkoli jsme neprováděli žádnou kvantitativní analýzu sfingolipidů v potkaních tkáních, naše zjištění naznačovala potenciální změnu v biologické dostupnosti různých sfingolipidů, jako je S1P a ceramid v SHRSP. Protože sfingolipid S1P stimuluje buněčnou proliferaci a dráhy přežití, zatímco ceramidy obvykle vykazují antiproliferativní a apoptotické účinky [39], nerovnováha mezi nimi může ovlivnit mozkovou homeostázu u SHRSP a potenciálně přispívat k patogenezi mrtvice. Vzhledem ke korelační povaze naší studie jsou nezbytné další výzkumy, abychom plně porozuměli potenciální klíčové roli změn sfingolipidů v patogenezi hypertenzního poškození orgánů, aby bylo možné vyvinout účinnější terapeutické strategie na bázi sfingolipidů. Vzhledem k tomu, že několik léků, jejichž molekulární cíle patří do sfingolipidových drah, je již dostupných pro léčbu jiných onemocnění [40], věříme, že naše zjištění mohou nabídnout podporu pro zkoumání jejich terapeutického potenciálu u hypertenzního mozku aledvinovécévní poruchy.

Materiály a metody

Zvířecí modelyVšechny experimenty byly provedeny s použitím dvouměsíčních samců spontánně hypertenzních (SHRSP) a spontánně hypertenzních (SHRSR) samců krys, které byly náchylné k mrtvici, a byly porovnány s normotenzními krysami WistarKyoto (WKY) odpovídající věku a pohlaví. . SHRSP a SHRSR jsou nejčastěji používané zvířecí modely v preklinických studiích hypertenze a přidružené cévní mozkové příhody [5,6]. Byli chováni ve zvířecím zařízení IRCCS Neuromed, udržováni při konstantní pokojové teplotě a 12hodinových cyklech den/noc a byli krmeni běžnou potravou pro krysy a vodou ad libitum. Všechny studie na zvířatech byly provedeny v souladu se schválenými protokoly IRCCS Neuromed Animal Care Review Board a „Istituto Superiore di Sanità“ (číslo povolení ISS: 1086/2020) a byly provedeny v souladu se směrnicí EU 2010/63/EU pro pokusy na zvířatech .

ImunoblottingyPotkani byli usmrceni dekapitací a tkáněmi (mozek aledviny) byly bleskově zmraženy v kapalném N2 a rozdrceny v třecí misce paličkou. Rozdrcená tkáň byla homogenizována v lyzačním pufru obsahujícím 20 mM Tris, pH 7,4, 1 procento Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 2 mM Na3V04 a směs inhibitorů proteázy 1:1000 (Sigma-Aldrich) a sonifikován pulsy 2*10 s. Pro imunoblotování bylo 20 ug celkového proteinového lyzátu imunoblotováno s následujícími protilátkami: anti-SPHK1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-SPHK2 (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK ), anti-SGPL1 (1:1000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), anti-S1PR1 (1:1000) (Immunological Sciences), anti-S1PR2 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) anti-S1PR3 (1:1000) (Immunological Sciences), anti-SPTLC1 (1:1000) (Abcam) a anti-SPTLC2 (1:1000) (Abcam). Pro normalizaci proteinu byl použit anti-aktin (1:2000) (Immnunological Sciences, Řím, Itálie). Proteinové pásy byly detekovány pomocí ECL Prime (GE Healthcare) a kvantifikovány pomocí softwaru Quantity One Software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Extrakce RNA a qPCR.

Celková RNA byla extrahována pomocí sady Rneasy (Qiagen) podle pokynů výrobce. 1000 ng celkové RNA bylo syntetizováno pomocí Super Script III reverzní transkriptázy (Invitrogen) a výsledná cDNA byla amplifikována pomocí Power SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) podle pokynů výrobce. Kvantitativní qPCR analýza byla provedena za použití specifických primerů: Kdsr FW: 50-TAAAGCAGGCACAGGAGAAG-30; Kdsr RV: 50-GCCTGAGAGGACACAAACA -30; Des FW: 50-AGAGGAGTTCGAATGGGTCTA-30; Des RV: 50- GATAGCCAGAGTCATGGAATGG-30; CerS1 FW: 50- CCTGGAAGCTTCTGTTCTACTT-30; CerS1 RV: 50- CATGTACACGGTGGCATAGA-30; CerS2 FW: 50- CATGGCTGTCACTGTGGATAA-30; CerS2 RV: 50- GAGAAGCAGAGGAGAATGATGG-30; CerS6 FW: 50- CAGGAGTGGACAAAGCAAGA-30; CerS6 RV: 50- TGGTTTGGCTATGAATCTCTCG-30; Gapdh FW: 50- AACGACCCCTTCATTTGACCTC-30; Gapdh RV: 50- CCTTGACTGTGCCGTTGAACT-30.

CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL