Dietní kakaové flavanoly zlepšují mitochondriální funkce v kosterním svalstvu a upravují metabolismus celého těla u zdravých myší

pro více informací kontaktujte:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: Mitochondriální dysfunkce je široce uváděna u různých onemocnění a přispívá k jejich patogenezi. Hodnotili jsme účinekkakaové flavanolysuplementace mitochondriální funkce a celého metabolismu a zkoumali jsme, zda se účastní mitochondriální deacetyláza sirtuin-3 (Sirt3), či nikoli. Zkoumali jsme účinky 15denní suplementace CF u divokého typu a Sirt3-/myši. Celotělový metabolismus byl hodnocen nepřímou kalorimetrií a k posouzení byl proveden orální glukózový toleranční testmetabolismus glukózy. Mitochondriální respirační funkce byla hodnocena v permeabilizovaných vláknech a byl kvantifikován obsah pyridinových nukleotidů (NAD plus a NADH). U divokého typu suplementace CF významně modifikovala metabolismus celého těla podporou využití sacharidů a zlepšením glukózové tolerance. Suplementace CF vyvolala významný nárůst mitochondriální hmoty, zatímco došlo k významné kvalitativní adaptaci k udržení produkce H2O2 a buněčného oxidačního stresu. Suplementace CF vyvolala významné zvýšení obsahu NAD plus a NADH. Všechny výše uvedené efekty byly u Sirt3-7myší otupeny. Souhrnně suplementace CF zvýšila metabolismus NAD, který stimuluje metabolismus sirtuinů a zlepšil mitochondriální funkci, což pravděpodobně přispělo k pozorované adaptaci metabolismu celého těla, s větší schopností využívat sacharidy, alespoň částečně prostřednictvím Sirt3.

Klíčová slova: kakaové flavanoly; metabolismus NAD; mitochondriální hmota; metabolismus glukózy; kosterní sval

kliknutím získáte další informace

1. Úvod

Mitochondrie jsou subcelulární organely, které se účastní mnoha buněčných funkcí, jako je transdukce energie prostřednictvím mitochondriální oxidativní fosforylace a mitochondriální produkce peroxidu vodíku nebo mitochondriálně zprostředkovaná aktivace buněčné smrti [1-3]. Objevující se důkazy naznačují, že mitochondriální dysfunkce je zapojena do mnoha patologií a hraje ústřední roli v jejich patogenezi [4]. Naše skupina uváděla mitochondriální postižení u pacientů s diabetem 1. typu dlouho před klinickými komplikacemi [5]. Navíc ke snížení mitochondriální oxidační kapacity dochází se stárnutím i u zdravých lidí [6]. Identifikace strategií ke zmírnění těchto dysfunkcí nebo zvýšení mitochondriální hmoty je proto příležitostí k prevenci nebo alespoň ke snížení výskytu mnoha poruch nebo ke zvýšení aerobní kapacity zdravých subjektů.

V této souvislosti je zajímavá identifikace bezpečných a přírodních sloučenin, které zvyšují mitochondriální funkci a metabolismus celého těla s omezenými vedlejšími účinky nebo bez nich. Mezi přírodními sloučeninamikakaové flavanoly(CF) jsou považovány za slibné molekuly, protože bylo prokázáno, že jejich konzumace pozitivně ovlivňuje kardiovaskulární zdraví, inzulínovou rezistenci nebo imunitní funkce [7]. Ukázalo se, že CF zlepšuje metabolismus glukózy a krátkodobé podávání CF je následováno zvýšením inzulinové senzitivity, a to i u hypertoniků s intolerancí glukózy [8,9].

Mezi flavanoly je (-)-epikatechin (EPI) nejběžněji nalezeným monomerem v CF a EPI je považován za hlavní biologicky dostupnou a bioaktivní molekulu CF [10]. Konzistentní soubor důkazů ukazuje, že suplementace EPI zlepšuje mitochondriální funkci a/nebo obsah v kosterním svalstvu [11]. Suplementace EPI stimuluje četné cesty konvergující na peroxisomovém proliferátorem aktivovaném receptoru gama koaktivátoru 1-alfa(PGCl ) a hlavních jaderných transkripčních komplexech. EPI přímo zvyšuje tvorbu oxidu dusnatého, který stimuluje mitochondriální biogenezi [11]. Současně jsou sirtuiny 1 a 3 stimulovány suplementací EPI [11]. Použití proanthokyanidinů, oligomerníchflavonoidykteré obsahují EPI, bylo prokázáno, že zvyšuje intracelulární hladiny nikotinamidadenindinukleotidu (NAD plus ) prostřednictvím zvýšení několika prekurzorů pro biosyntézu NAD a upreguluje hladiny mRNA sirtuinu -1 v krysích játrech [12]. Rodina sirtuinů (Sirt), NAD-dependentní deacetyláza, zahrnuje sedm členů, kteří se liší svou subcelulární distribucí, substrátovou specifitou a buněčnými funkcemi [13]. Sirt1, extenzivně studovaný člen této rodiny, stimuluje mitochondriální biogenezi podporou deacetylace PGCl , čímž zvyšuje jeho transkripční aktivitu [14]. Sirte, klíčový metabolický senzor, byl stimulován po podání EPI [12,15-17]. Vliv EPI na jiné sirtuiny však nebyl prozkoumán. Hodnocení EPI efektu bude zvláště zajímavé u sirtuinů umístěných v mitochondriích (Sirt3, Sirt 4 a Sirt5), o kterých je známo, že modulují aktivitu Krebsova cyklu a enzymů dýchacího řetězce [18]. Sirt3, který je vysoce exprimován ve tkáních s vysokým metabolickým obratem a obsahem mitochondrií, je zvláště zajímavý, pokud jde o jeho kritickou roli při udržování normální mitochondriální funkce prostřednictvím reverzibilní deacetylace proteinu lysinu [19-21]Kromě toho hraje Sirt3 důležitou roli v regulace metabolismu celého těla [20. Bylo prokázáno, že Sirt3 je pozměněn v kosterním svalstvu modelů diabetu 1. a 2. typu a kardiovaskulárních onemocnění [22,23]. Dále bylo navrženo, že aktivace Sirt3 by mohla představovat slibnou terapeutickou strategii pro zlepšení mitochondriální funkce a metabolismu [23,24]. Proto je zajímavé zjistit, zda je Sirt3 základem části příznivých účinků suplementace CF na metabolismus celého těla a mitochondriální funkci.

V této studii jsme použili integrativní přístup ke zkoumání účinku 15-denní suplementace CF u myší. Předpokládali jsme, že suplementace CF by: (i) upravila metabolismus celého těla ametabolismus glukózy(ii) zvýšit mitochondriální funkci v oxidativním a glykolytickém svalu v permeabilizovaných vláknech a (ii) zvýšit metabolismus NAD. Také jsme zkoumali předpokládané zapojení Sirt3 do mitochondriální biogeneze indukované CF a metabolismu celého těla. Naší hypotézou bylo, že účinky CF na metabolismus celého těla a mitochondriální hmotu budou u Sirt3-7 myší oslabeny.

2. Metody

2.1. Zvířata a strava

Pro tuto studii byli 129S1/SvlmJ 10-týdenní myší samci zakoupeni od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Abychom určili, zda se sirtuiny účastní adaptace mitochondriální hmoty a funkce vyvolané podáváním CF, použili jsme také 10-týdenní celotělové knock-out samce Sirt3 myší na stejném kmeni jako divoký typ [25]. Sirt3/myši byly použity k prozkoumání zapojení Sirt3 do mitochondriální biogeneze indukované CF a adaptací metabolismu celého těla. Myši byly drženy v místnosti s regulovanou teplotou 23-25 stupňů a řízeným osvětlením (cykly 12-h světla a tmy). Zvířata měla přístup k potravě pro hlodavce a vodě z vodovodu ad libitum.

Po alespoň týdnu zvykání ve zvířecím zařízení dostávala experimentální zvířata suplementaci CF prostřednictvím orální sondy přírodního extraktu (302,1 mg/kg tělesné hmotnosti dvakrát denně po dobu 15 dnů) resuspendovaného v karboxymethylcelulóze (Sigma-Aldrich, St. Louis , Mo, USA). Složení kakaového prášku je popsáno v tabulce 1 a bylo získáno od společnosti Naturex (Quart de Poblet, Španělsko). Složení bylo stanoveno metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie a 100 mg extraktu odpovídá průměrně 475 mg suchých kakaových semen. Kontrolní myši dostávaly vehikulum složené z podobného obsahu theobrominu a kofeinu rozpuštěného v karboxymethylcelulóze orální sondou. Denní dávka byla stanovena podle pokynů průmyslu, které převádějí dávku pro člověka na dávky ekvivalentní zvířatům na základě plochy povrchu těla, a dávku pro člověka jsme vynásobili 12,3 [26]. Orální sondu provedl zkušený technik.

2.2. Kolekce tkání 1

Dvacet čtyři hodin po poslední orální sondě byla zvířata, která nebyla nalačno, anestetizována pomocí ketaminu a xylazinu (v tomto pořadí: 100 a 10 mg/kg). Odběr tkání byl proveden ihned po dosažení anestezie. Byly vyříznuty soleus a bílá část gastrocnemia. Vzorky byly buď okamžitě zmrazeny v kapalném dusíku a skladovány při -80 stupni pro následnou analýzu, nebo byly použity k přípravě svalových vláken stažených z kůže.

2.3. Hodnocení metabolické a fyzické aktivity

Nepřímá kalorimetrie a spontánní fyzická aktivita byly měřeny pomocí Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). Myši byly umístěny jednotlivě v komorách při 28 stupních, se světlem od 07 h00 do 19 h00 a ad libitním přístupem k potravě pro hlodavce a vodě z vodovodu. Myši byly aklimatizovány na metabolické klece tři dny před prvním dnem sběru dat. Sběr dat byl proveden patnáctý den suplementace. Spotřeba kyslíku (VO2), produkce oxidu uhličitého (VCO2) a poměr výměny dýchacích cest (RER) byly měřeny při průtoku vzduchu 0,5 l/min a vzorku vzduchu o objemu 0,4 l/ min. Procento relativní kumulativní frekvence (PCRF) RER bylo stanoveno po dobu 24-h, jak dříve popsal Riachi et al. (2004). Ve stručnosti, PCRF byla stanovena přidáním frekvence každého datového bodu k předchozí sekvenci přírůstku (od 0,65 do 1,20 s přírůstkem 0,01)[27]. Metabolická flexibilita byla stanovena Hillovým sklonem (hodnota H) a 50. percentilem (EC50) křivky PRCF a měřením amplitudy RER po dobu 24 hodin (Riachi et al.2004). Obecná fyzická aktivita byla monitorována pomocí senzorového systému ovládaného infračerveným paprskem, který detekoval aktivitu osy x a z. Byly hodnoceny jak celkové počty (pokaždé, když je paprsek zlomený), tak ambulantní počty (každé, když je zlomen nový paprsek). Celkový počet X (X-TOT) se zaznamená, když se zvíře pohybuje vodorovně o více než 0,5 palce a představuje opakující se činnosti v malém měřítku, jako je škrábání a ošetřování. X-ambulatorní počet (X-AMB) měří skutečnou lokomoci registrací počtu pouze tehdy, když zvíře přeruší nový paprsek. Celkový počet Z (Z-TOT) je registrován, když dojde k vertikálnímu pohybu o 1,5 palce, tj. vzpřímení (Abreu-Vieira 2016). Pro odhad sacharidů a tukůoxidacez VO2 a VCO2 jsme použili tabulku neproteinového respiračního kvocientu od Péronnet a Massicotte dříve používanou u myší [28,29].

2.4. Celková tělesná a tuková hmota

Celková tuková hmota a celková libová hmota byly stanoveny u neanestetizovaných myší kvantitativní rezonanční interferenční analýzou za použití celotělového magnetického rezonančního analyzátoru EchoMRI (Echo Medical System, Houston, TX, USA). Celková tuková hmota představovala součet veškerého tuku v těle. Celková netuková hmota zahrnovala především svaly a vnitřní orgány. Je známo, že kosterní svalová hmota tvoří největší část celkové svalové hmoty.

2.5. Orální test glukózové tolerance (OGTT)

Glykemie byla měřena pomocí kapky krve odebrané z ocasu pomocí glukometru (Accu-Chek Performa, Roche, Argentina). OGTT byl proveden na myších, které byly hladověny po dobu 5 až 6 hodin. Měření bylo provedeno poslední den suplementace CF. Po měření bazální glykémie (čas O) byl myším per os injikován roztok 20% glukózy ve sterilní vodě v dávce 1,5 g glukózy/kg tělesné hmotnosti-1. Glykemie byla měřena 15, 30, 60, 90 a 120 minut po injekci roztoku glukózy. Přírůstková plocha glukózové křivky byla poté vypočtena jako míra glukózové tolerance.

2.6. Analýza qRT-PCR

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA byla syntetizována z celkové RNA （2 μl） za použití iScript reverzního transkripčního supermixu pro RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA). Celkové produkty RT byly analyzovány kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s použitím 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG podle specifikací výrobce (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Kanada). Cyklování bylo dosaženo v cyklovači CFX96 (Biorad, Hercules, Kalifornie; podmínky: 95 stupňů C po dobu 10 minut a 40 cyklů 95 stupňů po dobu 30 s, 55 stupňů po dobu 45 s a 72 stupňů po dobu 45 s). Na konci každého běhu byla nepřítomnost tvorby primer-dimeru a přítomnost jedinečného amplikonu potvrzena pomocí křivky tání. Hodnoty prahového cyklu (Ct) byly použity podle 2-metody A△Ct k analýze dat qPCR, s buď ß-aktinem nebo HPRT1 jako provozním genem【30】. Kvantitativní hodnoty RT-PCR byly vztaženy k hodnotám kontrolní skupiny, které byly nastaveny na 1.

2.7. Enzymové aktivity

Měření specifické aktivity komplexů elektronového transportního řetězce a citrátsyntázy bylo provedeno spektrofotometricky, jak bylo popsáno dříve [31]. Rozdrcené zmražené bílé gastrocnemius svaly (~30 mg) byly homogenizovány pomocí vibračního mikroperličkového homogenizátoru v 500 ul homogenizačního pufru (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA a 5 mg.ml-Iof BSA , pH 7,4) s následným přidáním 500 ul hypotonického média (25 mM fosforečnanu draselného a 5 mM MgCl, pH 7,2). Vzorky byly poté podrobeny třem kolům cyklů zmrazování a rozmrazování v kapalném dusíku. Vzorky byly centrifugovány po dobu 10 minut při 600 x g při 4 stupních a supernatant byl až do analýzy uchováván na ledu. Obsah proteinu byl stanoven v supernatantu v triplikátech za použití soupravy Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Aktivita citrátsyntázy (CS) byla stanovena spektrofotometricky při 412 nm po redukci 2 mM 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoové kyseliny) v přítomnosti 0,1 mM acetyl -CoA a 12 mM kyseliny oxaloctové v 200 mM Tris pufru (pH 7,4). Stanovení NADH-decylubichinon oxidoreduktázy (komplex I) citlivé na rotenon bylo provedeno při 340 nm s použitím akceptoru 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-n-decyl-14-benzochinonu（ 80 μM) a NADH jako donor elektronů （200 μM） v 10 mM Tris pufru (pH 8,0). Ke kvantifikaci aktivity citlivé na rotenon byl použit přídavek 4 μM rotenonu. Aktivita cytochromoxidázy (komplex IV) byla provedena při 550 nm s použitím 10 μM redukovaného cytochromu c jako donoru a 2,5 mM n-dodecyl-ß-maltosidu k permeabilizaci obou mitochondriálních membrán ve 100 mM pufru fosforečnanu draselného (pH 7,0).

Všechny enzymové testy byly stanoveny trojmo a výsledky byly vztaženy k výsledkům kontrolní skupiny, které byly nastaveny na 100.

2.8. Mitochondriální hodnocení

Mitochondriální dýchání a mitochondriální produkce H2O2 byly studovány in situ v saponinem permeabilizovaných vláknech pomocí bílého m. gastrocnemius a soleus|1]. Stručně, vlákna byla separována pod binokulárním mikroskopem v roztoku A při 4 stupních (v mM: 2,77 CaK2 EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl2, 20 tauriny,0,5 DTT,5{ {50}} K-methansulfonáty, 20 imidazolů, 5,7 Na2 ATP a 15 kreatin-fosfát, pH 7,1) a permeabilizované v roztoku A s 50 ug·mL-I saponinu po dobu 30 minut při 4 stupních. Mitochondriální respirační funkce byla stanovena v oxymetru vybaveném elektrodou Clarkova typu (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Komora byla naplněna 1 ml roztoku B (v mM: 2,77 CaK, EGTA, 7,23 K, EGTA, 6,56 MgCl,, 20 taurin, 0,5 DTT, 50 K-methansulfonáty a 20 imidazolů, pH 7,1) a po zaznamenání základní obsah kyslíku v komoře byl jeden svazek 1-2 mg suché hmotnosti permeabilizovaných myovláknů umístěn do komory, která byla poté utěsněna. Po základních odečtech byly postupně přidány následující přídavky: palmitoylkarnitin a malát (160 μM~5 mM), glutamát (10 mM), sukcinát (25 mM), rotenon (0,5 μmM) CP, antimycinogenní činidlo 1 CP -A (8 uM) a N,N',N'-tetramethyl-p-fenylendiamin dihydrochlorid a askorbát (0,9:9 mM). Dýchání bylo měřeno při 23 stupních za stálého míchání. Na konci každého testu byla vlákna opatrně vyjmuta z xylografické cely, blotována a sušena alespoň 24 hodin při~80 °C pro stanovení hmotnosti vlákna. Rychlosti spotřeby O2 (JO2) byly vyjádřeny v nmol O2 min-1.(mg suché hmotnosti)-I. Všechna měření byla provedena alespoň duplicitně.

Čisté uvolňování H2O2 dýchacími mitochondriemi bylo měřeno v permeabilizovaných svazcích vláken pomocí fluorescenční sondy Amplex Red（20 μM∶excitace-emise∶563-587 nm）, jak bylo popsáno dříve [32]. Po přípravě permeabilizovaných vláken vzorky

určené pro měření H2O2 byly třikrát opláchnuty v pufru Z (v mM:110 K-Mes, 35 KCl, 1 EGTA, 5 K2HPO4, 3MgCl, 6H2O a 0,5 mg:mL{ {14}} BSA, pH 7,3 při 4 stupních). Svazky vláken ({{20}}.3-1.0 mg suché hmotnosti) byly inkubovány při 37 stupních v křemenné mikrokyvetě za nepřetržitého magnetického míchání v 600 ul pufru Z (pH 7,3 při 37 °C). doplněné 1,2 U·mL-I křenové peroxidázy. Základní hodnoty fluorescence byly provedeny v nepřítomnosti jakýchkoliv exogenních respiračních substrátů. Následně byly přidány následující přísady: glutamát (5 mM), sukcinát (5 mM), rotenon (0,5 uM), ADP (10 mM) a antimycin-A （8 μM）. Na konci každého testu byla vlákna opatrně vyjmuty z kyvety, odsát a usušit, aby se stanovila hmotnost vlákna. Rychlosti produkce H2O2 byly vyjádřeny v AU·min-1.(mg suché hmotnosti)-I a na kapacitu oxfos, což odpovídalo maximálnímu mitochondriálnímu dýchání ve stavu fosforylace. Všechna měření byla provedena alespoň duplicitně.

Mitochondriální retenční kapacita vápníku (CRC) byla hodnocena v bílých svalových vláknech gastrocnemia, jak bylo popsáno dříve [33]. Stručně, vlákna byla inkubována v křemenné mikrokyvetě za stálého míchání v 60}0 ul CRC pufru （v mM~250 sacharóze, 10 MOPS, 0,005 EGTA a 10P;-Tris, pH 7,3). Vlákna pak byla vystavena jedinému pulzu 20 nM Ca2 plus. Změny v extramitochondriální koncentraci vápníku byly monitorovány fluorometricky pomocí Calcium green 5N(1 mM: excitace-emise:505-535 nm). Citlivost pórů s přechodem permeability (PTP) byla hodnocena měřením času potřebného pro otevření PTP a CRC byl vzat jako celkové množství Ca' nahromaděného mitochondriemi před jeho uvolněním. Na konci každého testu byla vlákna opatrně vyjmuta z kyvety, blotována a vysušena pro stanovení hmotnosti vlákna. Hodnoty CRC byly vyjádřeny v nM Ca2 plus na mg suché hmotnosti.

2.9. Analýza Western Blot

Proteiny z bílého m. gastrocnemius a soleus byly zředěny v Laemmliho pufru a separovány na Mini-PROTEAN TGX Stain-Free 10 procent prefabrikovaných polyakrylamidových gelech (Biorad); na každý gel byl nanesen vnitřní standard. Elektroforetická separace byla provedena při 200 V po dobu 35 minut v migračním pufru (25 mM TrisBase, 0 ,2 M glycin a 1 procento SDS (p/v)). Technologie Stain-Free (SF) obsahuje patentovanou trihalogenovou sloučeninu, která reaguje s proteiny a činí je detekovatelnými působením UV záření. SF zobrazení bylo provedeno pomocí softwaru ChemiDoc MP Imager a Image Lab4.{45}}.1 (Biorad, Hercules, Kalifornie, USA) s dobou aktivace skvrny 5-min, a proto byly vizualizovány vzorce celkového proteinu. Proteiny byly poté přeneseny na 0,2 um nitrocelulózovou fólii pomocí Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad). Kvalita přenosu byla kontrolována zobrazovacími membránami pomocí technologie SF. Po kroku přenosu byly karbonylové proteiny derivatizovány dinitrofenylhydrazinem zředěným v 2N HCI a nakonec byly důkladně promyty methanolem. Membrány byly blokovány 5% odtučněným sušeným mlékem v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku obsahujícím Tween-20 (TBST:15mM Tris/HCl, pH7,6,140mM NaCl a 0,05% Tween-20) pro 1 h při pokojové teplotě. Membrány byly poté inkubovány při 4 stupních přes noc nebo 2 hodiny při teplotě místnosti s následujícími primárními protilátkami: proteinová karbonylová primární protilátka (Anti-DNP;#STA-308, Cell Biolabs) a SOD2 (#Ab13533, Abcam). Po třech 10minutových promytích v TBST byly membrány sondovány sekundárními protilátkami na proteinový karbonyl (HRP-konjugát;#STA-308, Cell Biolabs) a SOD2 (anti-králičí IgG-HRP spojený;#7074, Cell Signalling) v blokovacím roztoku po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a nakonec byly důkladně promyty TBST. Ředění primárních a sekundárních protilátek bylo optimalizováno pro každou protilátku. Chemiluminiscenční detekce byla provedena pomocí ECL Clarity (Biorad) a zachycení snímků bylo provedeno pomocí ChemiDocMP. Všechny snímky byly analyzovány pomocí softwaru Image Lab 4.0.1. Normalizace intenzit proteinového signálu byla provedena po kvantifikaci příslušných hladin celkového proteinu na SF obrazech, kontrole vzorku a vnitřních standardech.

2.10. Měření NAD

Celkové hladiny NAD a NADH byly měřeny v homogenizovaném bílém gastrocnemiu pomocí komerční soupravy (#K337-100, Biovision, USA) a podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, byla extrahována celková zásoba NAD (NADt= NADt a NADH). U každého z extrahovaných vzorků byla polovina vzorku zahřátá na 60 stupňů po dobu 30 minut, aby došlo k rozkladu NADt při zachování neporušeného NADH. Vzorky NADt i NADH byly smíchány s cyklickým enzymem NAD a absorbance byla měřena při 450 nm. NADt a NADH byly kvantifikovány porovnáním se standardní křivkou NADH a normalizací na mg proteinu. Nakonec byl vypočten poměr NAD plus (NADt-NADH) k NADH. Všechny testy byly provedeny trojmo.

2.11. Statistika

Data jsou uvedena jako průměr ± standardní odchylka (SD). Normalita dat byla hodnocena pomocí D'Agostino-Pearsonova testu normality. Analýza dat byla provedena pomocí Studentova t-testu a dvoucestné ANOVA (skupina a čas) pro opakovaná měření následovaná Bonferroniho post hoc testem pomocí Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Byla použita oboustranná úroveň 5 procent pro chybu typu I.

3. Výsledky

3.1. Složení těla a metabolismus celého těla

Patnáct dní suplementace CF u myší divokého typu (WT) nezměnilo tělesnou hmotnost (p=0.091), libovou hmotnost (p=0.{{24} }73) a tukové hmoty hodnocené pomocí EchoMRI (p=0.89; obrázek 1A). Míry spotřeby O2 vyjádřené na chudou hmotu byly výrazně vyšší v cyklu tmy (8±8 procent , p=0.042), zatímco ve světlém cyklu zůstaly podobné (p =0 0,392, obrázek 1B.). Nedošlo k žádným změnám v lokomotorické aktivitě (data nejsou uvedena). CF myši vykázaly významný nárůst celotělového energetického výdeje o 15±15 procent (p =0.042; obrázek 1C) a v příjem potravy (0,08 ± 0,01 vs. 0,11 ± 0,01 g na štíhlou tělesnou hmotnost, respektive skupinu CF a WT, p=0,013, obrázek 1D).

Suplementace CF významně modifikovala metabolismus celého těla: hlavní účinek vyšší RER ve skupině CF byl pozorován po 24 h(p=0.023, obrázek 2A) a průměrný RER za 12 h byl vyšší ve skupině CF v cyklech světla a tmy (plus 5±3 procenta ,p=0.035 a plus 9±4 procenta, v tomto pořadí, p=0,026). Navíc suplementace CF podporovala využití sacharidů (CHO) (51 ± 13 procent spotřeby energie záviselo na oxidaci CHO ve skupině CF oproti 37 ± 12 procentům v kontrolní skupině během světelného cyklu, p=0.108 a 71 ± 21 procent ve skupině CF vs. 47 ± 24 procent v kontrolní skupině během cyklu tmy, p=0,004; obrázek 2B.). Při vyjádření v kJ však nebyl žádný rozdíl v oxidaci CHO ani v oxidaci mastných kyselin (CHOoxidace: 3,7±1,4 kcal·d-1 u kontroly vs.4,4±1,7 kcal.čistá tělesná hmotnost-1. d-1 v CF,p=0,33 a oxidaci mastných kyselin: 2,3±1,0 kcal·d-Iin kontrola vs.2,6±0,87 kcal.čistá tělesná hmotnost-1.d{{ 50}}v CF,p{51}}.608). Analýza PRCF RER odhalila zvýšení hodnot EC50 ve skupině CF (p=0,009; obrázek 2D), což znamená, že CF vyvolává posun k většímu využití sacharidů. Snížení sklonu Hill bylo pozorováno ve skupině CF (hodnoty H: 25,16±4,44 u kontrol vs.12,79±3,96 ve skupině CF,p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Mitochondriální bioenergetika

Testovali jsme účinek suplementace CF na energetiku mitochondrií u bílého m. gastrocnemius a soleus u WT myší. Bylo pozorováno vyšší mitochondriální dýchání s použitím komplexních IV substrátů v bílých m. gastrocnemius a soleus (p=0.004, resp. p=0.028; obrázek 3A, B). Nebyly pozorovány žádné změny respiračních poměrů CII/CI a CIV/CI (p =0,899 a p =0,701 pro bílého gastrocnemia a p=0,693 a p{{ 11}}.912 pro svaly plosky, data nejsou uvedena). Kromě toho byly aktivity komplexu, I, IV a citrát syntázy významně zvýšeny v bílém svalu gastrocnemius (v tomto pořadí: plus 31 ± 27 procent ,p=0,004; plus 28 ± 38 procent ,p=0 .027; plus 35±38 procent ,p= 0.009; plus 14±13 procent ,p=0.040;obrázek 3C). Schopnost mitochondrií oxidovat palmitoyl-karnitin má tendenci se zvyšovat bílý gastrocnemius (plus 24±12 procent ,p =0,096; obrázek 3D), zatímco u soleus nebyl pozorován žádný rozdíl (p =0,363). Relativní rychlosti dýchání stimulovaného palmitoyl-karnitinem se nezměnily, když byly vyjádřeny jako funkce dýchání komplexu I (62 ± 11 v kontrolní skupině vs. 64 ± 20 ve skupině CF u bílého gastrocnemia a 70 ± 18 vs. 72 ± 16 v soleus). Dále jsme zkoumali citlivost na otevření PTP indukované Ca plus u bílého gastrocnemia. Jak je znázorněno na obrázku 3E, ani čas do otevření PTP, ani kapacita retence Ca² se po doplnění CF nezměnily (p=0.608 a p=0.943, v tomto pořadí).

Hodnocení mRNA genů zapojených do mitochondriální biogeneze ukázalo 70% upregulaci mRNA NRF1, zatímco u PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa a Cox2 nebyl zaznamenán žádný rozdíl (tabulka 3). Na několika vzorcích jsme zkoumali účinek suplementace CF na mitochondriální superkomplexy (obrázek S1, doplňkové materiály). Denzitometrická analýza naznačuje, že suplementace CF zvýšila celkový obsah superkomplexů bez kvalitativní adaptace nebo přeskupení. Respirační hustota se zlepšila o 58 procent při použití sond komplexu I a komplexuⅡ a o 93 procent při použití sondy komplexu I. Podobně obsah komplexu I a komplexu III vložený do superkomplexů byl vyšší ve skupině CF.

Suplementace CF snižuje mitochondriální emisi ROS. Zatímco emise H2O2 zůstaly nezměněny jak u bílého gastrocnemia, tak u soleus, když jsou vyjádřeny na suchou hmotnost (obrázek 4A, respektive B), rychlosti byly sníženy, když jsou vyjádřeny na obsah mitochondrií (obrázek 4C). Hlavní pozitivní účinek suplementace CF byl pozorován u různých stavů u bílého gastrocnemia (str<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Markery oxidačního stresu v kosterním svalu

Úroveň buněčného proteinového oxidačního stresu u WT myší nebyla ovlivněna suplementací CF, protože buněčný obsah SOD2 byl podobný v experimentální a kontrolní skupině u bílého gastrocnemia a soleus (obrázek 4E). Navíc nebyl pozorován žádný rozdíl v karbonylaci proteinu u bílého gastrocnemia a soleus (obrázek 4F). Navíc nebyl pozorován žádný rozdíl v expresi mRNA katalázy a MnSod po suplementaci CF (tabulka 3).

3.4. Metabolismus NAD

Celková zásoba pyridinových nukleotidů se po suplementaci CF zvýšila o 36±33 procent (p=0.012). Konkrétně se obsah NAD a NADH zvýšil u bílého gastrocnemia (respektive o 69±60 procent ,p{{6 }},026 a 29±42 procent ,p=0,017;obrázek 5A,B) a poměr NAD plus/NADH měl tendenci se zvyšovat ve skupině CF (p =0,084). Ne významný účinek byl pozorován u mRNA Sirt3 (p=0,096), mRNA NMNAT (p=0,094) a mRNA Sirt1 (p =0.869; Tabulka 3 ).

3.5. Reakce metabolismu celého těla a buněk po suplementaci CF u Sirt3-/myší

Zkoumali jsme účinek suplementace CF u Sirt{{0}} myší. Složení těla jako hmotnost, libová hmota a tuková hmota se mezi CF a kontrolní skupinou nelišily (p= 0.52,p=0.66,p=0.45, v tomto pořadí; Obrázek 6A). Podobně nebyl denní výdej energie ovlivněn suplementací CF ({{10}}.38±0.{{40}}1 kcal.štíhlé tělo hmotnost-1.den-1 v kontrolách vs. 0,39 ± 0,01 kcal·beztuková tělesná hmotnost-1.den-1 v CF, p=0.502; obrázek 6B). RER byla podobná mezi oběma skupinami v cyklech světla a tmy (p=0.301; obrázek 6C) a oxidace substrátu nebyla ovlivněna suplementací CF (44 ± 17 procent spotřeby energie záviselo na oxidaci CHO v kontrolní skupina vs. 50 ± 11 procent ve skupině CF během světlé fáze, p=0.209 a 65 ± 19 procent v kontrolní skupině vs. 77 ± 21 procent ve skupině CF během tmavé fáze, p=0.395; Obrázek 6D). Metabolická flexibilita hodnocená pomocí amplitudy RER během 24 hodin zůstala mezi těmito dvěma skupinami podobná (0,19±0,05 u kontroly vs.0,20±0,03 u CF,p=0,604), zatímco sklon PRCF byl snížen ve skupině CF (H hodnoty: 17,77±4,38 u kontroly vs.12,79±3,93 u CF,p=0,039).

Dále jsme porovnávali účinek suplementace CF na aktivity mitochondriálních enzymů. Suplementace CF nedokázala zvýšit enzymatickou aktivitu komplexu I, I, IV a CS u Sirt3-/myš, jak bylo dříve pozorováno u WT (respektive: p=0.623,p=0 .629,p=0.283 a p=0.791, obrázek 6E). Větší enzymatická aktivita komplexu a IV byla pozorována u WT ve srovnání se Sirt3-7myší po suplementaci CF ( respektive:p=0.027 a P=0.045)

4. Diskuze

V této studii poskytujeme integrativní analýzu účinku požití CF. Pozorovali jsme, že chronické požití CF zlepšilo mitochondriální dýchání a snížilo produkci H2O2, hodnoceno v jejich prostředí myovlákna, zatímco náchylnost k otevření PTP byla nezměněna. Požití CF zvýšilo metabolismus NAD a podpořilo zapojení sirtuinových drah na pozorovaných mitochondriálních adaptacích. Pozorovali jsme také modifikace metabolismu celého těla směrem k větší schopnosti využívat sacharidy jako hlavní substrát, což naznačuje, že mitochondriální adaptace pravděpodobně přispěly k pozorované adaptaci metabolismu celého těla.

4.1.Metabolismus

Dietní podávání kakaových flavanolů bylo identifikováno jako účinná strategie pro zmírnění glukózové intolerance, která umožňuje zmírnit metabolická onemocnění [34]. Naše výsledky jsou v souladu s předchozími studiemi, které uváděly zvýšenou glukózovou toleranci po příjmu flavanolů [35,36]. Mechanismy navržené pro tento účinek zahrnují zvýšení translokace GLUT4 směrem k buněčné membráně, zvýšení fosforylace AMPK a up-regulaci exprese genu UCP-2 v kosterním svalu [8,37] . Kromě toho bylo požití CF spojeno se zlepšením citlivosti na inzulín u lidí[8]. Po 15 dnech konzumace hořké čokolády byl u zdravých jedinců pozorován pokles indexu inzulinové rezistence na modelovém hodnocení homeostázy současně se zvýšením kvantitativního indexu kontroly inzulinové senzitivity a indexu inzulinové senzitivity [8]. Pozorovali jsme také současné zvýšení glukózové tolerance a metabolické flexibility u WT myší, což se týká schopnosti organismu přizpůsobit oxidaci paliva dostupnosti paliva [38]. Je zajímavé, že zatímco zhoršená mitochondriální oxidační kapacita a související oxidace substrátu byly spojeny s inzulinovou rezistencí 39, vytrvalostní trénink zvýšil mitochondriální obsah, citlivost na inzulín a metabolickou flexibilitu [38]. Proto jsou současné výsledky specifické pro suplementaci CF a nejsou ovlivněny spontánní aktivitou.

Pozitivní účinek CF na metabolickou flexibilitu, stejně jako zvýšení aktivity mitochondriálních komplexů, byly u Sirt3-7 myší oslabeny, což naznačuje, že pozitivní účinky CF se alespoň částečně vyskytují prostřednictvím Sirt3. Tyto výsledky podporují předchozí zjištění a klíčovou roli Sirt3 v regulaci metabolické flexibility [24]. Naše výsledky naznačují, že zvýšení mitochondriální funkce může zvýšit metabolickou flexibilitu. Kromě mitochondriální funkce však byly jako determinanty metabolické flexibility identifikovány také bazální respirační kvocient, rychlost likvidace glukózy, kapacita ukládání lipidů v tukové tkáni a koncentrace volných mastných kyselin v plazmě, které je třeba vzít v úvahu [40]. Budoucí studie by měly hlouběji posoudit buněčné determinanty metabolické flexibility, abychom prohloubili naše chápání základních příčin zvýšení metabolické flexibility po suplementaci CF.

Hodnocení metabolismu celého těla odhalilo zvýšení relativní oxidace CHO po suplementaci CF. Tento výsledek je v kontrastu s předchozí studií, která zaznamenala zvýšení lipolýzy po akutním požití flavanolů nebo dvoutýdenní suplementaci flavan-3-olů u myší [36]. Kromě rozdílů ve složení extraktu mohou tato protichůdná zjištění vyplývat z pleiotropních účinků NO. Je dobře známo, že požití CF stimuluje produkci nebo biologickou dostupnost metabolismu NO [7]. Na jedné straně NO stimuluje transport a vychytávání glukózy v kosterním svalstvu. Stimulace produkce NO v myotubách pocházejících z buněčné linie inzulinem nebo peroxidem vodíku vedla ke zvýšení translokace GLUT4, která byla snížena inhibicí nNOS [41]. Kromě toho může NO zvýšit transport glukózy cestou nezávislou na inzulínu, což vede ke zvýšení hladin cyklického GMP a AMPK [42], což podporuje oxidaci glukózy v kosterním svalu potkana nezávisle na dostupnosti a oxidaci mastných kyselin [43]. Na druhé straně NO podporuje oxidaci mastných kyselin snížením hladiny malonyl-CoA prostřednictvím inhibice acetyl-CoA karboxylázy a aktivace malonyl-CoA dekarboxylázy v kosterním svalu[44]. Zatímco jsme pozorovali posun směrem k nižšímu relativnímu podílu použití mastných kyselin jako substrátu s CF, nebyl zde žádný rozdíl, pokud jde o absolutní hodnoty vyjádřené v kJ. To naznačuje, že zvýšení energetického výdeje pozorované při suplementaci CF závisí na zvýšení oxidace glukózy. Proto tyto výsledky podporují myšlenku, že konzumace CF zvyšuje citlivost na inzulín a podporuje oxidaci glukózy bez současného vlivu na oxidační kapacitu mastných kyselin. Tyto výsledky vyvolávají otázku, zda je vhodné používat kakaové flavanoly v kontextu diety s vysokým obsahem tuků. Budoucí studie by měly zhodnotit možný škodlivý účinek spojení suplementace CF a diety s vysokým obsahem tuků.

4.2. Funkce mitochondrií

Bylo prokázáno, že dietní podávání kakaových flavanolů zlepšuje mitochondriální funkci, včetně (i) ​​mitochondriální respirace a aktivit enzymů transportního řetězce elektronů; (i) mitochondriální uvolňování H2O2, které odráží produkci mitochondriálních reaktivních forem kyslíku (ROS); a (i) mitochondriální retenční schopnost vápníku, která odráží náchylnost k otevření mitochondriálních permeabilních přechodových pórů (mPTP) (přehled viz [11]. Naše výsledky jsou v souladu s předchozími studiemi, nicméně naše studie byla první, která vyhodnotila účinek Suplementace CF na mitochondriální funkci hodnocenou in situ v permeabilizovaném vláknu a v různých typech svalů Na rozdíl od předchozích studií na izolovaných mitochondriích zachovává hodnocení mitochondriální funkce v permeabilizovaném vláknu mitochondriální morfologii, funkční interakce s jinými intracelulárními složkami [1] a vyhýbá se mitochondriální struktuře narušení během procesu izolace mitochondrií [32].Proto je důležité studovat mitochondriální funkce v tkáňových preparátech, kde je mitochondriální struktura zachována a je zastoupen celý mitochondriální pool, aby bylo možné lépe vyhodnotit odpověď na léčbu.

Předchozí studie provedené v buněčné kultuře nebo in vivo na myších ukázaly, že suplementace EPI, která je považována za hlavní bioaktivní molekulu u CF, zvyšuje maximální ADP-stimulované dýchání (např. dýchání ve stavu 3), když jsou mitochondrie energizovány kombinací energie. substráty vyživující různá místa podél dýchacího řetězce [45-49]. V souladu s těmito výsledky jsme pozorovali hlavní účinek suplementace CF na mitochondriální dýchání v oxidačních a glykolytických svalech. Abychom určili, zda toto zvýšení souvisí s nárůstem mitochondriální hmoty nebo s remodelací mitochondriálních respiračních komplexů, hodnotili jsme mitochondriální superkomplexy ze čtyřhlavého svalu. Předpokládá se, že tyto supramolekulární struktury snižují produkci ROS, stabilizují nebo pomáhají při sestavování jednotlivých komplexů, regulují aktivitu dýchacího řetězce a zabraňují agregaci proteinů ve vnitřní mitochondriální membráně bohaté na proteiny [50-52]. Navzdory omezenému počtu měření vizuální analýza výsledků (doplňkové materiály) naznačuje, že suplementace CF indukuje nárůst mitochondriální hmoty, což se odráží ve zvýšení počtu všech druhů superkomplexů, spíše než specifické reorganizace komplexu dýchacího řetězce. Souhrnně tyto výsledky naznačují, že CF podporuje nárůst mitochondriální hmoty bez kvalitativní adaptace uspořádání komplexu dýchacího řetězce.

Během mitochondriálního dýchání se tvoří proměnná množství superoxidu a mohou být metabolizovány za vzniku jiných typů ROS [53]. Přestože se nadměrná produkce ROS z mitochondrií podílí na širokém spektru patologií, nízké fyziologické koncentrace ROS mohou mít příznivé účinky, jako je ochrana proti infekčním agens a účast na buněčné signalizaci [2,54]. Předchozí studie provedené in vivo na hlodavcích a lidech a na modelech buněčných kultur uváděly příznivé účinky suplementace CF na produkci ROS a různé antioxidační systémy [11]. Například perorální sonda s EPI po dobu 15 dnů zvyšuje aktivitu SOD2 a katalázy u myších čtyřhlavých svalů [17]. Zatímco produkce mitochondriálních ROS nebyla široce hodnocena, pozorovali jsme, že úrovně produkce ROS byly podobné, když byly hodnoty vyjádřeny na svalovou hmotnost, zatímco produkce byla snížena, když byla vyjádřena na mitochondriální hmotu, což naznačuje, že dochází ke kvalitativním adaptacím k udržení fyziologických koncentrací ROS. Navíc jsme nepozorovali žádný účinek CF na SOD2 ani ROS-indukovaná poškození hodnocená karbonylací proteinu. Zatímco CF zvyšuje zásoby antioxidačních proteinů, včetně široce uváděných hladin SOD2 a katalázy [16,17,55], tato adaptace nebyla vždy spojena se snížením poškození vyvolaných ROS [56-59]. Tato data podporují teorii, že pro normální buněčnou homeostázu jsou vyžadovány nízké úrovně produkce ROS [2]. Souhrnně tyto výsledky naznačují, že současně se zvýšením mitochondriální hmoty podporuje CF kvalitativní mitochondriální adaptace ke zvýšení její antioxidační kapacity a udržení nízké úrovně produkce ROS.

4.3.Mitochondriální biogeneze

Mitochondriální hmota je výsledkem souhry mezi mitochondriální biogenezí a mitofágií. Naše studie se zaměřila na mitochondriální biogenezi aktivovanou konzumací polyfenolů [60]. Mitochondriální biogeneze je buněčný proces, který zlepšuje mitochondriální hmotu. Tento komplexní a vysoce regulovaný proces zahrnuje několik transkripčních faktorů, jaderných hormonálních receptorů a transkripčních koaktivátorů, které společně působí na koordinaci změn v expresi genů kódovaných jadernou a mitochondriální DNA [61]. Předchozí studie se pokoušely identifikovat, která dráha (cesty) může být základem mitochondriální biogeneze indukované suplementací CF. Stimulace signalizace závislé na NO se ukázala jako centrální dráha zapojená do mitochondriální biogeneze. Suplementace CF zvyšuje tvorbu NO inhibicí arginin degradujícího enzymu arginázy, což zvyšuje dostupnost L-argininu pro biosyntézu NO [62,63]. Navíc použitím inhibitoru eNOS byl stimulační účinek epikatechinu na mitochondriální biogenezi částečně oslaben [17]. Tyto výsledky naznačují zapojení dalších signálních drah ke stimulaci mitochondriální biogeneze.

Nedávno Aragones et al. (2016) uvedli, že dietní proanthokyanidiny, členové rodiny polyfenolů, zvyšují jaterní NAD plus metabolismus zvýšením biosyntézní dráhy de now o NAD plus a Sirte aktivity v závislosti na dávce u potkanů ​​[12]. Kromě toho játra exportují prekurzory NADt do jiných orgánů, jako je kosterní svalstvo, které má nižší kapacitu syntetizovat NAD, což zvyšuje možnost rozšíření účinků pozorovaných v játrech na celý organismus [64]. Zatímco některé studie uvádějí účinek suplementace CF na obsah, aktivitu nebo mRNA proteinu Sirt1 [12,15-17,65,66], zapojení metabolismu NAD do mitochondriální biogeneze po suplementaci CF pomocí ztráty nebo zisku funkce nebyla nikdy testována. Zatímco svalově specifický knock-out by byl výhodnější než celotělové myši Sirt3 KO použité v naší studii, naše výsledky naznačují, že CF zlepšuje metabolismus NAD a Sirt3 se podílí na tomto zlepšení aktivity mitochondriálního elektronového transportního řetězce vyvolaného suplementací. Pozitivní účinky pozorované na aktivitu mitochondriálních komplexů po suplementaci CF nebyly pozorovány u Sirt3-7 myší a větší aktivita aktivit komplexu I a IV byla pozorována po suplementaci CF pouze u WT. Tato pozorování rozšiřují předchozí práce ukazující, že Sirt3 hraje klíčovou roli v mitochondriální funkci ]67. Souhrnně tato zjištění naznačují, že sirtuiny se prostřednictvím modulace metabolismu NAD podílejí na zlepšení mitochondriální hmoty pozorované po suplementaci CF. 4.4. Limity

Kakaové boby jsou složeny ze směsi monomerních, oligomerních a polymerních flavanolů. Mezi flavanoly se zdá, že EPI je nejhojnějším polyfenolickým monomerem nalezeným v kakaových výrobcích, který představuje až 35 procent obsahu polyfenolů [68]. EPI byl stanoven jako hlavní bioaktivní molekula, která je základem přínosů spojených se suplementací kakaa a čokolády [47,69]. EPI metabolity (EPIm) se však mohou podílet na EPI-indukovaných biologických účincích pozorovaných ve studiích in vivo. EPIm může dosáhnout vyšších plazmatických koncentrací než EPI[70]. Kromě toho byly mezi druhy pozorovány velké rozdíly v EPIm. Ve skutečnosti 80 procent EPIm přítomných u lidí nebylo detekováno u potkanů, zatímco podobnost mezi myší a lidmi byla shledána o něco příznivější, protože byly detekovány dva hlavní lidské metabolity [70]. Použili jsme obohacený CF extrakt obsahující až pětkrát více EPI než nefermentované kakaové boby[71]. Kromě toho byl obsah EPI snížen o 10-20 procent fermentací a snížen v závislosti na teplotě během pražení [71,72]. Souhrnně tyto údaje naznačují, že pozornost by měla být věnována pouze obsahu EPI při hodnocení přínosů suplementace EPI na lidské zdraví a současné výsledky by měly být zváženy opatrně před extrapolací pozorovaných základních mechanismů u lidí.

5. Závěry

Každodenní suplementace CF po dobu 15 dnů vede ke zlepšení mitochondriálních funkcí v oxidativních a glykolytických svalech. Současné výsledky naznačují, že zvýšené mitochondriální dýchání vede ke zvýšení mitochondriální hmoty, zatímco buněčná úroveň produkce ROS byla zachována, což naznačuje kvalitativní adaptace v mitochondriích. Současně s dříve popsaným buněčným účinkem na metabolismus NO [73] moduluje CF metabolismus NAD, který stimuluje aktivitu sirtuinů. Sirt3 hraje ústřední roli v mitochondriálních adaptacích a metabolické flexibilitě po suplementaci CF. Vzhledem k tomu, že sirtuiny jsou v poslední době cílem různých patogenezí onemocnění, jako je diabetes nebo astma [74,75l, budou další studie zkoumat potenciální zájem o použití CF jako přirozeného aktivátoru sirtuinů.

Reference

1. Kuzněcov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Analýza mitochondriální funkce in situ v permeabilizovaných svalových vláknech, tkáních a buňkách. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]

2. Sena, LA; Chandel, NS Fyziologické role mitochondriálních reaktivních druhů kyslíku. Mol. Cell 2012, 48, 158–167. [CrossRef]

3. Wacquier, B.; Combets, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Souhra mezi intracelulárními Ca2 plus oscilacemi a Ca2 plus - stimulovaným mitochondriálním metabolismem. Sci. Rep. 2016, 6, srep19316. [CrossRef]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Mitochondriální nemoci: Příspěvek stresových reakcí organel k patologii. Nat. Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]

5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; a kol. Dodávka a využití svalového kyslíku u diabetu 1. typu, od okolního vzduchu po mitochondriální respirační řetězec: Existuje nějaký limitující krok? Diabetes Care 2020, 43, 209–218. [CrossRef]

6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Od mitochondrií k sarkopenii: Role zánětu a implikace osy RAGE-ligand. Exp. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kakao a čokoláda v lidském zdraví a nemoci. Antioxid. Redoxní signál. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Krátkodobé podávání hořké čokolády je následováno výrazným zvýšením citlivosti na inzulín a poklesem krevního tlaku u zdravých osob. Dopoledne. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]

9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. Po 15 dnech konzumace hořké čokolády s vysokým obsahem polyfenolů je snížen krevní tlak a zvýšena citlivost na inzulín u jedinců s intolerancí na glukózu a hypertenzí. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [CrossRef]

10. Ottaviani, JI; máma, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Stereochemická konfigurace flavanolů ovlivňuje hladinu a metabolismus flavanolů u lidí a jejich biologickou aktivitu in vivo. Volný Radic. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]