Dietní cistanche zmírnilo akutní poškození ilea kachny

Abstrakt: Aflatoxin B1 (AFB1) je stabilní toxický metabolit ohrožující zdraví lidí a zvířat a široce kontaminovaná krmiva a lidské potraviny. Tato současná studie měla za cíl prozkoumat účinkydietní cistanchena poškození ilea u kachen vyvolané podáváním AFB1 a prozkoumat jeho základní mechanismy. Kachny (N=450, jednodenní samec) s podobnou hmotností byly náhodně rozděleny do 3 skupin obsahujících kontrolní skupinu, skupinu AFB1 (60 µg AFB1 kg-1 tělesné hmotnosti) a cistanche (500 mg cistanche kg−1 dieta) plus skupina AFB1. Podávání AFB1 výrazně zvýšilo poškození ilea, adukty AFB1-DNA v plazmě a oxidační stres a zánět. Přidání cistanche do stravy chránilo ileum před morfologickým poškozením vyvolaným podáváním AFB1, snížilo adukty AFB1-DNA v plazmě a eliminovalo oxidační stres a zánět v ileu kachen.Antioxidaceaprotizánětlivé účinky cistancheby mohl chránit ileum před akutním poškozením aktivací signální dráhy Nrf2-ARE a inhibicí signální dráhy NF-κB. přesvědčivě,cistanchebyl dietníantioxidačníaprotizánětlivéprostřednictvím aktivace signální dráhy Nrf{0}}ARE a inhibice akutního poškození signální dráhy NF-KB vyvolaného podáváním AFB1.

klíčová slova:cistanche; akutní ileum; AFB1-adukty DNA; Nrf2-JSOU;

Klikněte zde pro produkty Cistanche proti stárnutí

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950

1. Úvod

Maso je důležitým zdrojem vysoce kvalitních bílkovin pro lidskou výživu. Kachní maso je hojně konzumováno po celém světě, zejména v Asii, kvůli jeho žádoucím nutričním vlastnostem [1]. Chov kachen proto přitáhl pozornost lidí. Pro kachny existují různé nevýhody v procesu chovu, jako je AFB1, které ohrožují zdraví kachen. Aflatoxin B1 (AFB1) je jedním ze stolních toxických metabolitů produkovaných druhy Aspergillus. AFB1 je uznáván jako nejtoxičtější mezi skupinami aflatoxinů (AF), spolu s řadou toxických účinků ohrožujících zdraví lidí a zvířat [2].

Pro lidi nebo zvířata je jídlo nebo krmivo běžným a důležitým způsobem expozice AFB1, ale inhalace a přímý kontakt s kůží nebo sliznicí se také počítají a nejsou ignorovány [3]. Předchozí studie prokázaly, že AFB1 vykazuje silnou toxicitu, která je velmi komplexní a silná, což má za následek zpomalení růstu, biologické malformace, jaterní toxicitu, poruchy trávicího traktu a dokonce rakovinu [4,5]. AFB1 získaný z kontaktu s potravou nebo sliznicí měl negativní účinky na dýchací systém, trávicí systém a tkáně a růstovou výkonnost [3,6,7]. Poškození tkání a orgánů vyvolané podáváním AFB1 související s oxidačním stresem a zánětem. Podávání AFB1 zaznamenalo zvýšený obsah aduktů AFB1-DNA v poraněném orgánu [8]. Ke vstřebávání a přeměně živin a toxinů došlo v žaludku a tenkém střevě, tedy v tenkém

Střevní slizniční imunitní systém je první linií, která chrání těla před poraněním [9]. Funkčnost a morfologii zdravého gastrointestinálního traktu mohou zničit nepříznivé faktory, jako jsou toxické látky, bakterie a viry [10,11]. AFB1 indukoval destrukci střevní struktury, projevující se odlučováním epiteliálních buněk v jejunálních klcích a infiltrací lymfocytárních buněk ve střevě kuřete [12,13]. Variační funkčnost a morfologii lze přičíst procesu metabolismu toxinů, který je často doprovázen oxidačním stresem Zánět. Je naléhavou záležitostí najít protijed, který sníží a minimalizuje hrozbu AFB1 pro lidi a zvířata.

V důsledku toho je AFB1 jedním z hlavních problémů v drůbežářském průmyslu kvůli své silné toxicitě. cistanche je druh polyfenolové složky vyskytující se v oddencích kurkumy (Cur cuma Longa Linn) jako funkční krmná přísada používaná v krmivech pro hospodářská zvířata [14] a široce používaná

jako zelené a přírodní koření, barvivo, konzervační látka a aroma v potravinářském průmyslu. Rostlinné extrakty jako cistanche obsahující polyfenoly zlepšily obranyschopnost organismu [15]. cistanche hraje klíčovou roli proti patologicko-patologickým stavům a aktivitám zprostředkovaným oxidativním stresem při použití jako terapie pro léčbu a prevenci chronických onemocnění [16,17]. Klinické studie ukázaly, že cistanche nemá závažné toxické nebo vedlejší účinky a má antikarcinogenní a antitoxikogenní vlastnosti, což vedlo k tomu, že cistanche je atraktivním chemopreventivním prostředkem proti poškození tkání vyvolaným AFB1- [18–20]. Literatura prokázala, že cistanche má schopnost protizánětu, antiapoptózy a antioxidace tím, že aktivuje dráhu Nrf2/HO{13}}, zvyšuje antiox kapacitu eliminovat zánět a oxidační stres v těle a eliminovat AFB1-indukovanou oxidační stres [21–25]. cistanche potlačil oxidační stres a tvorbu zánětu aktivací Nrf2-ARE a inhibicí signální dráhy NF-κB při démonizaci zbytků ledvin [26], antioxidační a protizánětlivé vlastnosti. Kromě toho cistanche z potravy významně zlepšila antioxidační kapacitu u brojlerů [27] a kachen [28]. Nebyl žádný pokus o korelaci role cistanche v signální dráze Nrf2-ARE a NF-κB a ve zvířecím modelu akutního podávání AFB1.

Tato studie vnesla světlo do této problematiky a poskytla teoretický základ pro cistanche jako přísadu do krmiva k ochraně zdraví kachen před podáváním AFB1 a ke snížení ekonomických ztrát krmivářského a chovatelského průmyslu způsobených znečištěním AFB1.

2. Materiály a metody

2.1. Chemikálie

cistanche byl zakoupen od Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Čína, CAS: 458-37-7), jeho čistota byla více než 98 procent podle analýzy HPLC. AFB1 (čistota větší nebo rovna 98 procentům, CAS NO. 1162-65-8) byl zakoupen od Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Protilátky použité v této studii byly zakoupeny od Bey time Biotechnology, Shanghai, Čína, včetně GAPDH (katalogové číslo: AG019), Nrf2 (katalogové číslo: AF7623), Phospho-NF-KB p65 (Ser276) (katalogové číslo: AF5875), HRP značené kozí anti-králičí IgG (H plus L) (katalogové číslo: A0208) a kozí značené HRP

Anti-Mouse IgG (H plus L) (Katalogové číslo: A0216).

2.2. Kachny a chov

Experimentální protokol byl proveden v souladu s postupy uvedenými v Příručce pro péči a použití zemědělských zvířat v zemědělském výzkumu a výuce Severovýchodní zemědělské univerzity (číslo protokolu: NEAU-[2011]-9).

Kachny (n {{0}}, jednodenní samec Anas platyrhynchos, 33,8 ± 0,2 g) bez významně odlišné hmotnosti byly zakoupeny z komerční líhně a náhodně rozděleny do 3 skupin (tabulka 1), z nichž 10 replikovat kotce (klece) na skupinu a 15 kachen na kotec na 70-den

pokus krmení. Základní diety byly formulovány podle National Research Council (1994). Kachny ve skupině T0 a T0 plus AFB1 byly krmeny kukuřično-sójovou bazální stravou (tabulka 2), kachny ve skupině T500 plus AFB1 byly krmeny základní stravou doplněnou 500 mg

cistanche kg−1 diety (T500) 70-denní zkušební verze. V 70 dnech byly kachny s podobnou tělesnou hmotností ve skupinách T0 plus AFB1 a T500 plus AFB1 krmeny 60 µg AFB1 kg-1 tělesné hmotnosti a kachny ve skupině TO byly krmeny stejným objemem roztoku PBS. Kachny byly krmeny na experimentální základně Acheng Severovýchodní zemědělské univerzity a byl jim poskytnut ad libitum přístup k vodě a práškové stravě. Patnáct kachen s podobnou tělesnou hmotností (1,4 ± 0,3 kg) z každé skupiny bylo vybráno a hladověno po dobu 12 hodin, poté byly krmeny roztokem PBS kachnám ve skupině T0 a 60 µg AFB1 kg-1 tělesné hmotnosti kachnám ve skupině T0 plus AFB1 a Skupiny T500 plus AFB1 současně. Po 12 hodinách mělo patnáct kachen v každé skupině získat vzorky kachen.

2.3. Kolekce vzorků

Vzorky krve (10 ml) byly získány pomocí heparinových zkumavek ze žil kachních křídel a centrifugovány při 1000× g po dobu 15 minut při 4 ◦C. Získaná plazma byla okamžitě separována a skladována při -80 ◦C pro analýzu. Kachny byly anestetizovány inhalací éteru a usmrceny, aby se získalo ileum. Ileum bylo okamžitě promyto 3krát v PBS a jednotlivě uloženo v nádrži s tekutým dusíkem, poté při -80 °C pro qRT-PCR a analýzu antioxidační kapacity. Poté bylo získáno asi 0,125 cm3 ilea a vloženo do 4% roztoku paraformaldehydu pro tkáňové řezy a asi 1 mm3 ilea bylo vloženo do elektronového mikroskopu.

roztok při 4 ◦C pro pozdější ultrastrukturální pozorování.

2.4. Test hladin antioxidantů v plazmě

Plazmatické hladiny celkové superoxiddismutázy (T-SOD), glutathionperoxidázy (GSH Px), glutathion S-transferázy (GSH-ST) a malondialdehydu (MDA) byly měřeny testovacími soupravami (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Čína). respektive s

UV-VIS spektrofotometr (UV1100, MAPADA, Šanghaj, Čína).

2.5. Test hladin AFB1-DNA aduktů v plazmě

Tvorba aduktů AFB1-DNA v plazmě byla stanovena pomocí souprav ELISA podle specifikací soupravy (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nan jing, Čína).

2.6. Test antioxidační schopnosti v ileu

Ileum (100.00 mg) bylo uvolněno a smícháno v 0,9 ml mrtvicově fyziologického fyziologického roztoku (4 ◦C, 0,9 % NaCl, pH=7,2 –7,4) pro získání 10 procent homogenátu ilea/SPSS. Aktivita nebo obsah celkové superoxiddismutázy (T-SOD U/mg proteinu), reduktivního Glu glutathionu (GSH-PX µmol/mg proteinu), glutathion S-transferázy (GSH-ST U/mg proteinu) a malondialdehydu (MDA nmol/ mg proteinu) v ileu byly hodnoceny pomocí testovacích souprav (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Čína) s UV-VIS

spektrofotometr (UV1100, MAPADA, Šanghaj, Čína).

2.7. Izolace RNA a kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR)

Celková RNA kachního ilea (100,00 mg) byla izolována pomocí reagenční soupravy (TaKaRa, Japonsko) podle protokolu doporučeného výrobci. Koncentrace a čistota celkové RNA byly detekovány v poměru A260/A280 spektrofotometrem (IMPLEN, Německo). 1 ug celkové RNA v každém vzorku byl převeden na cDNA pomocí reagenční sady Prime Script™ RT s gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, Čína) podle

podle protokolu doporučeného výrobci. Získaná cDNA z každého kachního ilea byla použita jako templát pro soupravu TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Dalian, Čína) RT-PCR (qRT-PCR). Genové přírůstkové číslo kachen bylo získáno z NCBI a

kachní genové primery byly syntetizovány Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína) (tabulka 3). Relevantní genová exprese v kachním ileu byla stanovena pomocí termocykleru Quanta gen Q225. qRT-PCR byla spuštěna v Monad Selected Real-Time

PCR systém (ABI 7500 real-time PCR instrument (USA)) tekoucí do stavu: jeden cyklus při 95 ◦C po dobu 30 s, 40 cyklů při 95 ◦C po dobu 5 s a při 60 ◦C po dobu 30 s. Relativní poměr genové exprese detekční mRNA byl detekován metodou 2−∆∆Ct a normalizován na expresi -aktinu.

2.8. Western blotting

Kachní ileum bylo rozmělněno na prášek a lyžováno v RIPA pufru obsahujícím 1 mmol/l PMSF (Beyotime, Shanghai, Čína) v ledu. Celková koncentrace proteinu v ileu byla stanovena testovací soupravou bicinchoninové kyseliny (BCA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Čína). 12 procent a 10 procent SDS-polyakrylamidový gel pro elektroforézu

používá se k získání cílových proteinů s různou molekulovou hmotností. Poté byly cílové proteiny přeneseny na polyvinyliden-difluoridovou (PVDF) membránu (Beyotime, Shanghai, Čína) pro bloty pomocí trans blotovacího zařízení. Membrána PVDF byla promyta 3krát po dobu 10 minut pokaždé v 1 x PBST a poté blokována 2 hodiny v 5% odstředěném mléce. Membrána PVDF byla znovu 3krát promyta a inkubována s primárními protilátkami GAPDH, Nrf2 a P-P65 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína) po dobu 8 – 12 hodin při 4 °C. Následující den byla PVDF membrána znovu 3x promyta a inkubována s odpovídající křenovou peroxidázou značenou protilátkou při 37 °C po dobu 1 hodiny, poté znovu 3x promyta.

Pásy cílového proteinu byly detekovány a vizualizovány působením vylepšené fluorescenční detekční soupravy BeyoECL Star (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína). Obrazy blotů byly zaznamenány a analyzovány zobrazovací platformou Essential V6 (UVITEC, Cambridge,

Anglie). Protein GAPDH sloužil jako protein vnitřní kontroly. Všechny výsledky experimentu byly opakovány třikrát. Relativní exprese cílových proteinů byly vyjádřeny jako poměr intenzit pásů proteinů k GAPDH.

2.9. Statistická analýza

Experimentální data byla získána alespoň šestkrát a každý vzorek byl měřen třikrát. Analýza výzkumných dat pomocí Independent-Samples T Test od SPSS (verze 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) s 5 procenty Pravděpodobnost chyby a statistická významnost byla p < {{4} }.05 v této studii