Expozice vznětových výfukových plynů mění výraz sítí zapojených do neurodegenerace v mozku zebrafish, část 2

Příprava vzorku proteinu

Pro přípravu vzorků proteinů byly hlavy 80 až 100 anestetizovaných larev (5 pdf) pečlivě izolovány a promyty PBS před přenesením do lyzačního pufru, který sestával z 15% předchlazeného TCA/acetonu obsahujícího 0,07% beta-merkaptoethanolu (ME )a koktejl inhibitoru proteázy (potřebuje výrobce) v celkovém objemu 500 ul.

V posledních letech je značný zájem o účinky vzorků proteinů na paměť. Stále více lidí si začíná uvědomovat důležitost stravy pro zdraví, zejména důležitou roli bílkovin v lidském těle.

Bílkoviny jsou základní stavební látkou lidského těla a hrají v lidském těle důležitou roli. Z tohoto důvodu se vzorky proteinů staly pro mnoho lidí důležitým kanálem v jejich snaze o zdraví a krásu. Kromě budování svalů a tvarování těla mohou vzorky bílkovin také zlepšit paměť člověka.

Někteří vědci zkoumali vztah mezi proteiny a pamětí. Zjistili, že dlouhodobý příjem dostatečného množství bílkovin je prospěšný pro všechny aspekty fyzického zdraví, zejména paměť. Přibývá důkazů, že příjem bílkovin ve stravě má ​​důležitý vliv na mozkové funkce a paměť.

Protein je důležitou složkou neuronů v lidském mozku, takže denní příjem bílkovin má důležitý dopad na lidskou paměť a schopnost myšlení. Dlouhodobý příjem bílkovin nejen uspokojuje potřeby těla na bílkoviny, ale také pomáhá mozku zůstat aktivní a zdravý.

Kromě toho mohou bílkoviny také pomoci tělu udržovat rovnováhu krevního cukru a udržovat stabilní náladu. To je velmi důležité pro udržení paměti a myšlení. Mírný příjem bílkovin proto může pomoci zlepšit různé kognitivní funkce a emoční stavy lidského těla.

Celkově existuje silný vztah mezi vzorky proteinů a pamětí. Zvýšení příjmu bílkovin pomáhá udržovat váš mozek a tělo zdravé, zlepšuje myšlení a paměť. Pro lidi, kteří potřebují zlepšit svou paměť, je velmi nutné konzumovat přiměřené množství bílkovin. Proteinová jídla bychom měli jíst přiměřeně a dbát na rozumná jídla, abychom si udrželi zdravé tělo a bystrou mysl. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola má antioxidační, protizánětlivé a anti-aging účinky, které mohou pomoci snížit oxidační a zánětlivé reakce v mozku, a tím chránit zdraví nervového systému. Kromě toho může Cistanche deserticola také podporovat růst a opravu nervových buněk, čímž zlepšuje konektivitu a funkci neuronových sítí. Tyto účinky mohou pomoci zlepšit paměť, rychlost učení a myšlení a mohou také zabránit rozvoji kognitivní dysfunkce a neurodegenerativních onemocnění.

Klikněte na vědět doplňky pro posílení paměti

Po krátké homogenizaci byly proteiny sráženy po dobu 12 hodin při 20 stupních, poté následovala centrifugace při 12,000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut při 4 stupních. Supernatant byl odstraněn a proteinová peleta byla dvakrát promyta studeným acetonem (obsahujícím 0.07 % ME a koktejly inhibitoru proteázy). Finální proteinová peleta byla rozpuštěna v lyzačním pufru obsahujícím 7,0 M močovinu, a 2,0 M thiomočovinu sonikací na ledu.

Vzorky solubilizovaných proteinů byly centrifugovány při 15, 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při 4 stupních, aby se vysrážely nerozpustné částice, a koncentrace finálních vzorků proteinu byla měřena pomocí Bradfordovy metody.

Vysoce výkonná proteomická analýza založená na TMT

Vzorky byly redukovány, alkylovány a štěpeny postupným přidáváním trypsinu a lys-C proteáz. Peptidy byly poté označeny pomocí 10-plexTMT izobarických značek podle pokynů výrobce. Značené vzorky byly smíchány a poté jemně frakcionovány pomocí chromatografie s reverzní fází s vysokým pH.

Jednotlivé frakce byly poté analyzovány pomocí LC–MS/MS pomocí online chromatografie s reverzní fází a tandemové hmotnostní spektrometrie na hmotnostním spektrometru Thermofsher Fusion Lumos. Data byla získána pomocí metody MS3 založené na synchronní selekci prekurzorů, jak bylo popsáno dříve (McAlister et al. 2014). Vyhledávání v databázi a extrakce informací reportérových iontů TMT byly prováděny pomocí softwarové platformy MaxQuant (Cox a Mann 2008).

Porovnání TMT dat napříč vzorky bylo provedeno pomocí MSStats (Choiet al. 2014). Transkriptomická analýza Z anestetizovaných embryí bylo izolováno přibližně 80–100 hlav (120 h), promyty PBS a podrobeny celkové extrakci RNA pomocí Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis , USA) reagencie podle pokynů výrobce.

Kvalita a kvantita RNA byla hodnocena pomocí spektrofotometru NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) a dále pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer, aby byla zajištěna minimální koncentrace 50 ng/ul a číslo RNAintegrity (RIN) 8. Příprava knihovny byla poté provedena pomocí Illumina HiSeq4000ac protokol: "TruSeqStranded Total RNA Library Prep workflow with Ribo-Zero Gold" a vzorky byly sekvenovány za následujících podmínek: "Paired End run, R1=75 cykly (antisense řetězec), Index=8 cykly, R2=75 cyklů (snímací řetězec).“

Analýza dat

Oba soubory dat pro proteomické a transkriptomické studie byly současně nahrány a analyzovány pomocí online nástroje Metascape, který umožňuje anotaci genů pro různé druhy, včetně Danio rerio (Zhou et al. 2019). Aby bylo možné vyhodnotit příspěvek buď proteomu, nebo změny profilu transkriptomu v konkrétních drahách, byla data analyzováno pomocí softwaru Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Krämer et al. 2014).

Do aplikace byly nahrány datové sady obsahující genové nebo proteinové identifikátory a odpovídající hodnoty exprese. Každý identifikátor byl namapován na odpovídající objekt ve znalostní bázi Ingenuity.

Pro identifikaci molekul, jejichž exprese byla rozdílně regulována, byla nastavena hranice změny exprese 1.3-násobek. Funkční analýza identifikovala biologické funkce a/nebo nemoci, které byly nejvýznamnější v souboru dat. Pro analýzu byly uvažovány molekuly ze souboru dat, které splnily limit a byly spojeny s biologickými funkcemi. K výpočtu p-hodnoty určující pravděpodobnost, že každá biologická funkce a/nebo onemocnění přiřazená k tomuto souboru dat je způsobena pouze náhodou, byl použit přesný test Right-tailed Fisher.

Analýza dráhy

Pro vyhodnocení příspěvku změn profilu buď proteomu nebo transkriptomu ve specifických drahách byly oba soubory dat nahrány do softwaru IPA (Krämer et al. 2014). Nejvýznamnější změněné kanonické dráhy byly poté dále hodnoceny a interpretovány pomocí PCR a western blottingu, jak je popsáno níže.

Western blotting

Celkem 25 ug proteinů bylo naneseno na 12%NuPAGE (Novex, CA) a přeneseno na PVDFmembrány (Novex, CA), jak je popsáno (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku a 0,01% Tween 20 (TBST pufr) po dobu 30 minut při pokojové teplotě a poté inkubovány přes noc při 4 stupních buď s králičím polyklonálním anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) nebo myší monoklonální anti-GAP Abcam, CA), zředěný v TBST pufru obsahujícím 1 % odstředěného mléka.

Po promytí v TBST byly bloty inkubovány se sekundárními oslími anti-králičí-HRP (Abcam, CA) nebo kozími anti-myší-HRP (Santa Cruz, CA) protilátkami po dobu 2 hodin, poté byly vyvíjeny pomocí substrátu pro western blotting Pierce™ ECL Plus ( Thermo Fisher Scientific, USA). Pásy byly vizualizovány zobrazením pomocí LI-COR Scanneru a analyzovány pomocí denzitometrie (LI_COR Biosciences, NE).

PCR v reálném čase

Celková RNA byla izolována z hlav pomocí činidla TRIzol (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) podle pokynů výrobce a poté měřena pomocí spektrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, MA). Množství 1 ug každého vzorku RNA bylo reverzně transkribováno pomocí iScript™ reverzního transkripčního supermixu (Bio-Rad, CA), a PCR v reálném čase byla provedena pomocí SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermix (Bio-Rad, CA) a primery jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1. Relativní hladiny exprese byly vypočteny pomocí metody 2−ΔΔCT a k vyhodnocení významných rozdílů byl použit statistický T-test.

Výsledky a diskuse

Proteomické a transkriptomické analýzy jsou dva hlavní nástroje pro pochopení molekulárních mechanismů, které jsou základem chorobných procesů a reakce na environmentální podněty (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jami et al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012) . Zde jsme provedli hluboké expresní analýzy na transkriptomické i proteomické úrovni v hlavách embryí zebrafish vystavených DEPe.

Hlavy, složené převážně z mozkové tkáně, byly izolovány, aby se eliminovaly expresní profily jiných tkání, protože nás zajímá stanovení vnitřních patologických drah CNS.

Výrazový profil hlav zebrafishembryí

Analýza profilu poskytla 11 172 detekovaných proteinů a 14 748 cílů mRNA z více než 26 000 kódujících genů (Howe et al. 2013). Mezi 11 172 proteiny identifikovanými ze vzorků značených TMT (doplňková tabulka 2) bylo 141 proteinů významně upregulováno a 607 bylo downregulováno (doplňková tabulka 3 a obr. 1a). Podobně bylo 367 transkriptů upregulováno a 149 bylo downregulováno mezi 14 748 transkripty (doplňková tabulka 4) detekovanými v analýze RNA-seq (obr. 1b a doplňková tabulka 5).
Ve většině případů byla zjištění z upregulovaných proteomických a transkriptomických analýz konzistentní. Například mezi špičkové vysoce upregulované proteiny patří cytochrom P450 Cyp1a, Cyp1c1, proteinová podjednotka gama vázající guaninnukleotid, Annexin, krátká izoforma plexinu B2b, člen dehydrogenázy/reduktázy (rodina SDR) 13-jako 1, S-antigen sítnice/šišinky mozkové (arestin) b a sulfotransferáza6B1.

Stejně tak mezi geny s nejvyšší transkriptomickou regulací patří cytochrom P450 (Cyp1a), chemokin (C–C motiv) ligand 27a, aryl-uhlovodíkový receptorový represor A, cytochrom P450 (Cyp1b) a glykoprotein Rh rodiny C. Na druhé straně downregulované proteiny a transkripty nebyly vždy vysoce korelované.

Například Complexin 2, Spectrin alfa, lehký řetězec srdečního myosinu-1, SEC23 interagující protein, ATPsyntázová membránová podjednotka EA, cytochrom b a NAD-dependentní protein deacetyláza patří mezi top vysoce downregulované proteiny, zatímco membránový protein retinalouter segmentu 1a , rodina nosičů rozpuštěných látek 5 (jodidový transportér), homolog B virového onkogenu FBJ myšího osteosarkomu, komplexin 4c, antigen podobný FOS 1a, opsin 1 a v-fos vykazují nejvyšší regulaci transkripce směrem dolů (tabulky 1 a 2).

Protilátky rozpoznávající proteiny zebrafish jsou omezené, ale potvrdili jsme vzorek těchto změn pomocí analýzy Western blot. Upregulace proteinu Cyp1A a downregulace komplexu 2 (CPLX2) byly potvrzeny pomocí GAPDH jako kontroly nanášení (obr. 2a). Vyšší hladiny TAT a transkripce UGT1B1 a nižší hladiny CHNRB a TH2 byly také potvrzeny qPCR s použitím Elf-alfa jako vnitřní kontroly (obr. 2b).

Genová anotace

Existuje několik online bioinformatických nástrojů a softwaru, které mohou poskytnout užitečné informace o genové anotaci. Mezi nimi byl v této práci použit Metascape se schopností genové anotace pro Danio rerio (Zhouet al. 2019).

Oba datové soubory pro proteomické a transkriptomické studie byly současně nahrány a analyzovány pomocí tohoto online nástroje. Po zkombinování výstupu proteomických a transkriptomických změn v softwaru bylo provedeno několik procesů, jako je reakce na xenobiotický podnět, metabolismus xenobiotik cytochromem P450 a cirkadiánní regulace genové exprese byly zjištěny indukované po ošetření DEPe (obr. 3a).

Tato analýza také navrhla potlačené úrovně biologických procesů, jako je „vizuální vnímání“, „fototransdukce“ a „internalizace receptoru spřaženého s G proteinem“. Změny v profilech exprese související s viděním nebyly neočekávané, protože léčba DEPe během raného vývoje vedla k menším očím (data nejsou uvedena).

Signalizace metabolismu xenobiotik

Xenobiotika, což jsou cizí přírodní nebo syntetické chemické sloučeniny, mohou vyvolat buněčnou stresovou reakci, která vede k diferenciaci, proliferaci, apoptóze nebo nekróze. Tělo se totiž potřebuje aktivně chránit před xenobiotiky a také toxickými endogenními sloučeninami a jejich metabolity prostřednictvím exprese enzymů a transportérů podílejících se na jejich eliminaci a detoxikaci.

Tyto enzymy se dělí do tří skupin: enzymy fáze I (CYP, ALDH, FMO), které zavádějí polaritu do xenobiotik; enzymy fáze II (UGT, GST, SULT), které zavádějí hydrofilitu prostřednictvím konjugace hydrofilních molekul, jako je sulfát, kyselina glukuronová a glutathion s xenobiotiky; a enzymy fáze III (MDR1, OATP2, MRP), které transportují xenobiotika nebo konjugáty vytvořené během fáze II do extracelulární oblasti.

Tyto enzymy jsou indukovány prostřednictvím signálních kaskád zahrnujících specifické receptory (CAR, PXR, AHR) a aktivaci transkripčních faktorů zprostředkovanou MAPK (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

V nepřítomnosti aktivátorů se konstitutivně aktivní receptor (CAR) nachází v komplexu cytoplazmy asa s CCRP a HSP90. Ale když je přítomen aktivátor, CAR se přemístí do jádra a váže se na RXR za vzniku heterodimeru a dále se váže na několik variant motivu repetice, jako je DR3, DR4, ER6 a ER8, a přispívá k regulaci genové exprese (doplňková tabulka 2).

Naše proteomická analýza odhalila aktivaci xenobiotického metabolismu. Jasná upregulace CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (hemová oxygenáza 1), CAT (kataláza) a CES1 (karboxylesteráza 1) skutečně ukazuje indukci metabolismu fáze I, zatímco zvýšenou expresi UGT1A1 (UDP glukuronosyltransferáza člen A1 rodiny 1) a GSTP1 ( glutathionS-transferáza pi 1) indikuje aktivaci metabolismu fáze II.

Je zajímavé, že downregulace sulfotransferáz, jako je SULT1A1 (člen 1 sulfotransferázové rodiny), SULT1C2 (člen 2 sulfotransferázové rodiny 1C) a SULT2B1 (člen 1 sulfotransferázové rodiny 2B), naznačuje, že ke zvýšení hydrofility ve fázi II metabolismu dochází přednostně prostřednictvím konjugace s glukuronovou kyselinou a kyselinou glukuronovou. , ale ne sulfátová konjugace (obr. 4).

Výsledky transkriptomické studie jsou zcela konzistentní, protože CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 a UGT1A1 jsou všechny upregulovány na hladinách RNA. SULT2B1 však vykazuje upregulaci na úrovni RNA (zatímco nedostatečně zastoupená na úrovni proteinů).

To může být způsobeno zapojením dalších mechanismů, které indukují degradaci nebo inaktivaci enzymů sulfát transferázy po ošetření DEPe. Obzvláště překvapivé je, že tyto změny v metabolismu xenobiotik nastaly v hlavách (pravděpodobně mozcích) ryb. Exprese xenobiotických genů byla popsána v nervovém systému savců, ale toto je první zpráva o nich v mozcích zebřiček (McMillan a Tyndale 2018).

Tato zjištění jsou v souladu s podobnou studií provedenou Shankarem a spolupracovníky, kteří testovali účinky různých skupin environmentálních polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH) na vývoj embryí a dále hodnotili dopad každého léčebného režimu na profil transkriptomu.

Na celém těle 48 hpost-fertilizačních (hpf) embryí prokázali upregulaci Cyp1a na úrovni transkripce i proteinu jako časný spolehlivý biomarker aktivace xenobiotického AHR a následných transkriptomických změn (Shankar et al. 2019).

NRF2-zprostředkovaná reakce na oxidační stres

Oxidační stres může vyvolat apoptózu a nekrózu a předpokládá se, že se podílí na neurodegeneraci (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Hlavní buněčnou obrannou reakcí na oxidativní stres je indukce antioxidačních a detoxikačních enzymů.

Nukleární faktor-erytroidní 2-faktor 2 (Nrf2) se váže na prvky antioxidační odezvy promotoru (ARE) a aktivuje jejich transkripci. Neaktivní Nrf2 je spojen s proteinem vázajícím aktinKeap1 a je zadržován v cytoplazmě.

Nrf2, vyvolaný oxidačním stresem, je fosforylován v reakci na dráhy proteinkinázy C, fosfatidylinositol 3-kinázy a MAP kinázy. Fosforylovaný Nrf2 se pak může translokovat do jádra a vázat ARE, aby transaktivoval detoxikační a antioxidační enzymy (doplňková tabulka 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com