Expozice výfukových plynů vznětových motorů mění vyjádření sítí zapojených do neurodegenerace v mozku zebrafish, část 1

Abstraktní

Neurodegenerativní onemocnění jsou hlavní příčinou invalidity ve světě, ale jejich etiologie z velké části zůstává nepolapitelná. Genetické faktory mohou představovat pouze menšinu rizika většiny těchto poruch, což naznačuje, že faktory životního prostředí hrají významnou roli ve vývoji těchto onemocnění.

Neurodegenerativní onemocnění se týkají typu onemocnění, které způsobuje degeneraci mozkových buněk z různých důvodů. Mezi běžné patří Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba atd. Tato onemocnění postihují neurony v mozku, což má za následek zhoršenou funkci mozku a symptomy, jako je paměť, myšlení a změny chování.

Nemusíme však kvůli těmto nemocem ztrácet náš pozitivní přístup. Existuje mnoho způsobů, jak pomoci pacientům zlepšit paměť a zmírnit příznaky. Podívejme se na některé z těchto metod:

Nejprve se věnujte fyzickému cvičení. Výzkumy ukazují, že fyzická aktivita zlepšuje krevní oběh v mozku a zvyšuje uvolňování chemických látek, jako je dopamin a endorfiny, které pomáhají chránit a zlepšovat funkci neuronů. Cvičení může zároveň pomoci snížit problémy, jako je úzkost, deprese a nespavost, a pacientům tak bude příjemnější čelit životu.

Za druhé, udržovat sociální vztahy. Je také velmi důležité, že naše sociální sítě jsou úzce propojeny se souvisejícími oblastmi mozku a sociální interakce může nejen snížit stres, ale také zlepšit zdraví mozku zvýšením štěstí, bojem proti depresi a dalším.

Konečně se pořádně najezte a dopřejte si dostatek spánku. Oba tyto aspekty mohou mít významný vliv na zdraví mozku. Dobrá strava musí nejen obsahovat dostatek živin, ale také se musí vyvarovat opakované konzumace příliš velkého množství cukru, nasycených tuků a cholesterolu. Dostatek spánku navíc může pomoci v boji s problémy s pamětí v různých fázích, zejména s nemocemi, jako je Alzheimerova choroba.

Stručně řečeno, neurodegenerativní onemocnění neznamenají vzdát se očekávání do života. Při zachování pozitivního přístupu je také nutné přijmout vědecké a účinné metody ke zlepšení kvality života. Více smíchu a více slunečního svitu vám pomůže zůstat zdraví. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola je tradiční čínský léčivý materiál, který má mnoho jedinečných účinků, jedním z nich je zlepšení paměti. Účinnost Cistanche deserticola pochází z mnoha aktivních složek, které obsahuje, včetně kyseliny tříslové, polysacharidů, flavonoidních glykosidů atd. Tyto složky mohou podporovat zdraví mozku různými cestami.

Klikněte na 10 způsobů, jak zlepšit paměť

Nedávno bylo zjištěno, že dlouhodobé vystavení znečištění ovzduší zvyšuje riziko Alzheimerovy a Parkinsonovy choroby, ale molekulární mechanismy, kterými působí, nejsou dobře známy.

Zebrafishembrya vystavená extraktu z výfukových částic (DEPe) vedou k dysfunkční autofagii a ztrátě neuronů. Zde jsme vystavili embrya zebrafish DEPe a provedli jsme vysoce výkonné analýzy proteomické a transkriptomické exprese z jejich mozku, abychom identifikovali patogenní dráhy vyvolané znečištěním ovzduší. Léčba DEPe změnila několik biologických procesů a signálních drah relevantních pro neurodegenerativní procesy, včetně metabolismu xenobiotik, zrání fagozomů a zpracování amyloidu. Největší indukce genové exprese v mozku byla u Cyp1A (více než 30-násobek).

Relevance této změny exprese byla potvrzena blokováním indukce pomocí CRISPR/Cas9, což vedlo k dramatickému zvýšení citlivosti na toxicitu DEPe, což potvrzuje, že indukce Cyp1A byla kompenzačním ochranným mechanismem.

Tyto studie identifikovaly narušené molekulární dráhy, které mohou přispívat k patogenezi neurodegenerativních poruch. V konečném důsledku určení molekulárního základu toho, jak znečištění vzduchu zvyšuje riziko neurodegenerace, pomůže při vývoji terapií modifikujících onemocnění.

Klíčová slova

Znečištění ovzduší · Demence · Parkinsonova choroba · Alzheimerova choroba · Transkriptomika ·Proteomika.

Úvod

Znečištění ovzduší je hlavním přispěvatelem k úmrtnosti a je spojeno s onemocněním dýchacích cest, srdečními chorobami, mrtvicí, rakovinou plic a cukrovkou. Objevující se epidemiologické důkazy podporují souvislost mezi vystavením znečištění ovzduší a rozvojem neurodegenerativních onemocnění, včetně Alzheimerovy a Parkinsonovy choroby (AD a PD) (Fu et al. 2019). Existuje nedostatek výzkumu, který by zkoumal mechanismy, kterými může znečištění ovzduší zvýšit riziko AD a PD, ale jen málo takových, které existují, podporuje kauzální vztah (Fu et al. 2019).

Akumulace proteinových inkluzí v mozku je univerzálním rysem neurodegenerativních poruch a je pravděpodobně běžnou cestou vedoucí k neuronální dysfunkci a smrti. Například tvorba struktur amyloidu-beta (A-beta) a tau jsou patologickými znaky agregátů AD a -synukleinu (-syn) nebo Lewyho tělísek při PD (Ross a Poirier 2004; Woulfe 2008).

Zdá se, že změny v proteostáze jsou alespoň částečně základem tvorby těchto agregátů, ale přesné mechanismy jsou stále neznámé a mohou se u jednotlivců lišit v závislosti na genetických a environmentálních rizikových faktorech. Víme, že zvýšená exprese nebo snížená degradace A-betaor -syn může vést k AD a PD (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Dalšími společnými rysy neurodegenerativních poruch jsou záněty a oxidační stres. Aktivované mikroglie, zánětlivé buňky v CNS, lze snadno ocenit při pitvách mozků s AD a PD a pravděpodobně přispívají k patogenezi neurodegenerace (Kannarkat et al. 2013). Předpokládá se, že tento zánět a možná mitochondriální dysfunkce vedou k oxidativnímu stresu, což je také ceněno u pitvaných mozků (Picca et al. 2020).

Většina mechanistických studií o znečištění ovzduší a neurodegeneraci se dosud zaměřila na zánět (Jayaraj et al. 2017). Zdá se, že znečištění ovzduší zvyšuje zánět CNS i oxidační stres v mozku zvířat i lidí (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a,bac; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Yokota a kol. 2013a, b).

Zvláště zajímavé jsou zjištění, že znečištění ovzduší zvyšuje expresi některých zánětlivých genů v čichovém bulbu (OB) myší, oblasti mozku, kde je patologie PD pozorována velmi časně v průběhu onemocnění (Levesque et al. 2011a, b; Yokota et al. 2013a) . Zánět byl také pozorován u psů žijících v městských oblastech ve srovnání s těmi, kteří žili ve venkovských oblastech, a autoři spekulovali, že tyto změny byly způsobeny vysokou úrovní znečištění ovzduší (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Stejní autoři také navrhli, že -syn se hromadil v mozcích lidí žijících ve městech kvůli znečištění ovzduší (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). V nedávné studii na modelu zebrafish bylo hlášeno, že expozice DEPe způsobuje neurotoxicitu a významné snížení počtu neuronů narušením autofagie (Barnhill et al. 2020).

DEPe obsahuje mnoho toxických složek znečištění ovzduší a běžně se používá k modelování expozice v systémech buněčných kultur (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). Autofagie je nezbytný intracelulární mechanismus pro odstranění a eradikaci špatně poskládaných proteinů a poškozených organel.

Přesná autofagická aktivita je skutečně nezbytná pro buněčnou homeostázu a dysfunkční autofagie v neuronech vede ke změněnému přežití a neurodegeneraci (Kesidou et al. 2013). V mnoha z těchto studií existují jasná omezení, ale všechny naznačují, že znečištění ovzduší zvyšuje riziko AD. a PD. Naše chápání mechanismů, kterými znečištění zvyšuje toto riziko, je omezené, ale ultrajemné částice a několik složek znečištění ovzduší se mohou dostat do mozku buď přímo čichovým bulbem nebo plícemi prostřednictvím krevního řečiště (Kilian a Kitazawa 2018).

Tyto částice se skládají z uhlíkového jádra a adsorbovaných sloučenin, jako jsou polycyklické aromatické uhlovodíky, kovy, dusičnany, sírany a další prvky a tvoří významný podíl látek znečišťujících ovzduší, zejména v městských oblastech. U mnoha z těchto sloučenin se podílí na inoxidačním stresu a buněčném toxicita přidává věrohodnost k kauzálnímu spojení znečištění ovzduší a neurodegenerace.

Podrobné multidisciplinární výzkumy, včetně buněčných a zvířecích modelů, mohou poskytnout náhled na příčiny onemocnění a nasměrovat budoucí terapeutické přístupy (Cannon a Greenamyre 2011). Mezi modelovými organismy používanými pro studie in vivo je Danio rerio (zebrafish) výkonným modelem pro studium toxikologie, molekulární genetiky, toxikogenomiky a objevování léků.

Většina biologických drah je u obratlovců vysoce konzervovaná a většina funkčních lidských genů má homology u zebřiček (Vaz et al.2018). Kromě toho se embrya zebrafish vyvíjejí rychle a nezávisle, což umožňuje analýzu v jakémkoli požadovaném vývojovém stádiu. Tyto vlastnosti spolu s rychlou reprodukcí a nízkými náklady na chov dělají z zebřičky příznivý model pro studium toxických účinků expozice životního prostředí.

Pro lepší pochopení molekulárních mechanismů, které stojí za patogenezí onemocnění, byla vyvinuta široká škála vysoce výkonných přístupů profilování genové exprese. Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii a vysoce výkonné sekvenování RNA mají zvláštní příslib při identifikaci požadovaných biologických drah. Tyto techniky byly široce používány k pochopení reakce buněčných a zvířecích modelů na environmentální podněty (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

V této studii jsme sledovali expresní analýzy účinků léčby DEPe na profily proteomů i transkriptomů v hlavách zebrafishembryí. Izolace vzorků z hlavy, která se skládá převážně z mozkové tkáně, umožnila získat tkáňově specifičtější profily a minimalizovat defekty pocházející z jiných tkání. Popisujeme zde změněnou genovou expresi a proteinové profily v několika drahách zapojených do neurodegenerace v hlavách zebřiček vystavených DEPe. Tyto výsledky poskytují nový pohled na možné mechanismy, kterými znečištění ovzduší zvyšuje riziko AD a PD.

materiály a metody

Léčba ryb a geneknockdown zprostředkovaný CRISPR/Cas{0}}

Všechny studie byly schváleny Výborem pro práva zvířat UCLA. Zebřičky (AB) byly chovány světelnou stimulací po dobu 1 hodiny a celkový počet 200 vajíček byl inkubován po dobu 24 hodin při 28 stupních. Výsledná embrya byla dechorionizována v pronáze (2 mg/ml) a ošetřena buď DEPe (Standardní referenční materiály, NIST, Gaithersburg, MD) v konečné koncentraci 20 ug/ml nebo vehikulem do 5 dnů po oplodnění (DPF).

Tato koncentrace byla vybrána, protože vedla ke ztrátě neuronů, jak bylo dříve hlášeno, ale bez významné úmrtnosti (Barnhillet al. 2020). Cyp1A knockdown fish byla připravena následovně. Pomocí nástrojů dostupných na http://crispr.mit.edu, the CRISPR RNA (Cyp1A-crRNA ) byl navržen na základě umístění vhodných míst PAM v prvním exonu genu Cyp1A.

Nejlepší design byl zakoupen od IDT DNA (www.idtdna.com) spolu se standardním CRISPR-Cas9 tracrRNA. crRNA pro Cyp1Agene a tracrRNA byly odděleně resuspendovány v 10 mM Tris-EDTA, aby se získala konečná koncentrace 100 uM. Poté byla tracrRNA kombinována s crRNAin 1x duplexním pufrem (100 mM octan draselný; 30 mM HEPES, pH 7,5; IDT DNA), čímž byla získána konečná koncentrace 10 uM. Směs byla zahřívána na 95 stupňů po dobu 5 minut ve vroucí vodní lázni a pomalu ochlazena na teplotu místnosti, aby bylo umožněno nasedání komplementárních nukleotidových sekvencí incrRNA a tracrRNA a tvorba funkční vodicí RNA (gRNA).

Objem 3 μl annealedgRNA byl poté kombinován se stejným objemem donorové jednovláknové DNA (ssDNA; 20}0 μM) jako templátová sekvence pro mutant Cyp1A. Ke směsi bylo přidáno množství 3 ug Cas9 nukleázy (IDT) v 1x injekčním pufru (5 mM KCl; 0,1 M fosforečnan sodný, pH 6,8), aby se vytvořily finální komplexy CRISPR/Cas9ribonukleoprotein (CyplA-RNP).

Pro přípravu Scramble RNP (SC-RNP) byla specifická Cyp1A-crRNA nahrazena komerční Scramble-crRNA bez cíle na genomu. Tato sekvence všech oligonukleotidů použitých v této práci je uvedena v doplňkové tabulce 1. Vejce byla injikována pod stereomikroskopem s přibližně 3 nL injekční směsi RNP.

Bylo provedeno pět biologických replikačních injekcí (každá replikace zahrnovala 400–600 vajíček injikovaných Cyp1A-RNP a 100–200 injekcí SC-RNP) a všechny mikroinjekce byly dokončeny během 60 minut. Vejce byla umístěna do 100 mm plastových Petriho misek a inkubována při 28 stupních ve vaječné vodě. Míra přežití embryí byla monitorována po dobu až 7 dnů.

Snímky přeživších ryb byly posouzeny pro hodnocení malformace. Každá larva byla zaslepeným způsobem hodnocena na přítomnost 4 vývojových malformací včetně malformace hlavy, malformace ocasu, srdečního edému a edému žloutku. Larvy se všemi 4 malformacemi by byly hodnoceny 4, zatímco normálně se vyvíjející larvy by měly skóre 0. K vyhodnocení signifikantních rozdílů byl použit statistický T-test.

For more information:1950477648nn@gmail.com