Vývoj multifunkčního kosmetického krému s využitím bioaktivních materiálů ze Streptomyces

Ram Hari Dahal1 , Tuan Manh Nguyen1,2, Dong Seop Shim3, Joon Young Kim4, Jangyul Lee4 a Jaisoo Kim1,*

Abstraktní:Stále více se používají různé kosmetiky s jedinou funkcí, ale kosmetika s multifunkčními aktivitami zůstává omezená. Naším cílem bylo vyvinout multifunkční kosmetický krém santioxidantanti-tyrosinázové, anti-aging a antimikrobiální aktivity. Antimikrobiální aktivity byly prováděny diskovou difúzní metodou. Buněčná toxicita a buněčná proliferace byly hodnoceny na 96-jamkové destičce s různými buněčnými liniemi, jako jsou HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1 a B16F10. Byla hodnocena inhibice houbové tyrosinázy, inhibice elastázy a aktivity vychytávání 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylových (DPPH) radikálů a byla vypočtena IC50. Mezoporézní částice oxidu křemičitého byly syntetizovány pomocí Pluronic P123 a tetraethyl ortho-silikátu (TEOS). Snímky obličeje byly pořízeny systémem VISIA-CR (Facial Imaging System for Clinical Research). Drsnost obrazu byla analyzována softwarem PRIMOS a jas obrazu byl analyzován pomocí Chromameter CR-400. Surový produkt kmene T65 inhiboval různé lidské patogenní bakterie, jako jsou Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus epidermidis. IC50 surového produktu T65 pro tyrosinázu hub, elastázu a aktivity vychytávání radikálů DPPH byly 58,73, 14,68 a 6,31 ug/ml, v daném pořadí. Surový produkt T65 proliferoval kolagen typu I v CCD-986Sk buňkách až na 145,91 procent ± 9,11 procent (průměr ± SD; průměr 24, 48 a 72 h) při 250 pg/ml. Syntetizované mezoporézní částice (SBA-15) potvrdily udržitelný výkon řízeným uvolňováním po dobu tří dnů. Formulovaný funkční kosmetický krém obsahující T65 vložený SBA-15 výrazně snížil drsnost pokožky o 4,670 procent a zvýšil jas pleti o 0,472 procent po aplikaci 4 týdnů. Surový produkt T65 inhiboval jak grampozitivní, tak gramnegativní patogeny. Syntetizovaná mezoporézní částice, SBA-15, potvrdila, že fyziologicky aktivní látka byla uvolněna ve stavu udržitelného uvolňování. Surový produkt T65 vykazoval bezvadnou antimikrobiální,antioxidant, anti-aging a bělící aktivity s necytotoxickými účinky na různé buněčné linie související s lidskou kůží.

klíčová slova: antioxidant; cytotoxicita; anti-tyrosináza; proti stárnutí; antimikrobiální; mezoporézní částice oxidu křemičitého; Kosmeceutické přípravky; estetická aplikace

cistanche ztracené říše bylinymá také aúčinek bělení kůže.

1. Úvod

Kůže je největší orgán a vnější obal lidského těla. Vizuální vzhled pleti umožňuje odhadnout věk, pohlaví, zdraví, přitažlivost a krásu [1,2]. Kosmetické přípravky jsou široce používány pro zlepšení vzhledu pokožky a zpomalení stárnutí pokožky. Topická aplikace kosmetiky navíc ukazuje, jak zvýšit atraktivitu manipulací s faktory krásy spojenými s kontrastem obličeje [3,4]. Kosmetický průmysl neustále hledá nové a přírodní bioaktivní materiály s anti-agingovými, antioxidačními, antityrosinázovými a antimikrobiálními vlastnostmi pro kosmetické přípravky ke zlepšení přístupů v péči o pleť [5,6].

Stárnutí kůže je komplexní biologický proces způsobený různými vnitřními a vnějšími faktory, které vedou k fyziologické dysfunkci a ztrátě strukturální integrity kůže. Vnitřní stárnutí, obecně známé jako přirozené stárnutí (chronologické stárnutí) pokožky souvisí s hormonálními změnami na základě věku, zatímco vnější stárnutí je spojeno s pohybem svalů, znečištěním, nikotinem, vystavením slunečnímu záření, kofeinu, teplotě, životním stylem, jako je např. jako strava (výživa), nedostatek spánku, stres a další zdravotní stavy [7–9]. Elastin pomáhá kůži vrátit se do původní polohy po pohybu, zatímco elastáza produkovaná v acinárních buňkách elastin degraduje a vede ke stárnutí kůže [9]. Anti-elastáza inhibuje elastázu a zachovává elastin v původním stavu, což zabraňuje stárnutí pokožky. Kosmetické nebo pleťové produkty s vlastnostmi proti stárnutí pozitivně ovlivňují stárnutí pleti [10–13].

Volné radikály jsou obvykle generovány během buněčného metabolismu. Reaktivní formy kyslíku (ROS) a reaktivní formy dusíku (RNS), jako je aniontový radikál, superoxid, peroxid, hydroxylový radikál, oxid dusnatý (NO), peroxydusitan a kyselina chlorná, jsou zodpovědné za oxidační poškození buněk, lipidů, proteinů, a DNA, což vede k ateroskleróze, karcinogenezi, kardiovaskulárním onemocněním, buněčnému stárnutí, chronickému zánětu, diabetu, hypertenzi, mutagenezi, neurodegeneracím, revmatoidní artritidě, mrtvici, septickému šoku a dalším degenerativním onemocněním [7,14–17]. Antioxidanty zabraňují oxidaci proteinů a tvorbě ROS a RNS, které mohou redukovat poškození normálních tkání volnými radikály bojem proti oxidativnímu stresu [17–19].

Kůže produkuje tmavý pigment známý jako melanin. Produkce melaninu zabraňuje poškození kůže UV zářením [9]. Nadprodukce a akumulace melaninu však způsobuje kožní hyperpigmentaci, která vede k estetickým komplikacím, jako jsou melasma, pihy, senilní lentiginy, névus a ephelis [9,20]. Tyrosináza je glykoprotein nacházející se v membránách melanosomů, které jsou odpovědné za biosyntézu melaninu hydroxylací l-tyrosinázy na 3,4-dihydroxyfenylalanin (l-DOPA) a následnou oxidací l-DOPA na dopachinon [21]. Díky spontánní polymeraci se dopachinon nakonec přemění na melanin [22]. Nadměrně produkovaný melanin by měl být kontrolován, aby byla zachována celistvost kůže. To je důvod, proč objev nových inhibitorů tyrosinázy pro vývoj kosmeceutických přípravků vyvolal značný zájem [23–25].

Antimikrobiální konzervační látky se do kosmetických přípravků přidávají pro udržení mikrobiologické čistoty po celou dobu jejich aplikací [26]. Namísto používání kosmetických konzervačních látek, jako je methylparaben, jsou lepší a pro lidské zdraví prospěšnější přírodní antimikrobiální sloučeniny s jinými funkcemi [27–29]. Sekundární metabolity izolované z bakteriálních zdrojů mohou mít jak konzervační, tak antimikrobiální vlastnosti, které inhibují kolonizaci bakteriálních patogenů (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis a Staphylococcus aureus) v kůži [9,26,28].

Bioaktivní sloučeniny produkované půdními nebo mořskými bakteriemi, zejména aktinobakteriemi, jsou nevyužité a stále neprozkoumané [23,30]. Různé bioaktivní sloučeniny, které jsou použitelné v kosmeceutickém a kosmetickém průmyslu, včetně těch, které mají anti-aging, antioxidační, anti-tyrosinázové, antimikrobiální a necytotoxické vlastnosti, mají velký potenciál pro nová použití.

Existuje mnoho studií o bioaktivních materiálech izolovaných z rostlin, které se v současnosti používají v kosmetických přípravcích, ale k dispozici je jen velmi málo studií o bioaktivních materiálech z bakterií [9,21,24–27,31]. Cílem této studie bylo zhodnotit kosmeceutický potenciál ethylacetátových extraktů z bakteriálního kmene Streptomyces sp. T65 pro antioxidační, anti-aging, anti-tyrosinázové a antibakteriální aktivity a jakékoli cytotoxické účinky na různé myší a lidské buněčné linie. Kromě toho jsme se zaměřili na syntézu mezoporézních částic oxidu křemičitého. A konečně, hlavním cílem této studie bylo vyvinout finální kosmetický přípravek pro topickou aplikaci s využitím bioaktivního materiálu extrahovaného z půdních mikroorganismů.

2. Materiály a metody

2.1. Reagencie, buněčné linie a vybavení

Všechna použitá rozpouštědla byla analytické čistoty. Buněčná linie melanomu B16-F10, linie myšího melanomu B{2}}F1 a buněčná linie lidských keratinocytů (HaCaT) byly zakoupeny od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Dulbeccovo modifikované Eaglesovo médium (DMEM), penicilin-streptomycin a teplem inaktivované fetální bovinní sérum (HI FBS) byly zakoupeny od Gibco (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., Soul, Jižní Korea). Souprava pro počítání buněk-8 (CCK-8) byla zakoupena od společnosti Dojindo (Kumamoto, Japonsko). Myší makrofágová buněčná linie RAW264.7 a CCD-986Sk lidské fibroblasty byly zakoupeny od Korean Cell Line Bank (Seoul, Jižní Korea). Lipopolysacharid (LPS, Escherichia coli, sérotyp O11:B4), sulfanilamid, naftylethylendiamin dihydrochlorid, houbová tyrosináza, prasečí pankreatická elastáza, l-tyrosin, kyselina askorbová, arbutin, N-Succ-(Ala)3-p-nitroanilid , 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), kolagen typu I, Tween 20, tetramethylbenzidin (TMB ), tetraethyl ortho-silikát (TEOS), pluronic P-123 (poly(ethylenglykol)-blok-poly(propylenglykol)-blok-poly(ethylenglykol); PEG-PPG-PEG) a -melanocyt -stimulační hormon (-MSH) byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH) a kyselina oleanolová byly zakoupeny od společnosti Aldrich (St. Louis, MO, USA). Primární protilátka COL1A1 (kolagen, typ I, alfa 1) a sekundární protilátka konjugovaná s HRP (křenová peroxidáza) byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Čtečka mikrodestiček SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) byla použita pro 96-čtení jamkové destičky.

2.2. Patogenní bakteriální kmeny

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 a Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 byly zakoupeny od Korean Agriculture Culture Collection (KACC, Jeonju, Jižní Korea); Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234 a Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 byly získány z Korea Environmental Microorganisms Bank (KEMB, Suwon Jižní Korea); a Propionibacterium acnes KCTC 3314 byl zakoupen od Korejské sbírky pro typové kultury (KCTC, Jeongeup, Jižní Korea).

2.3. Izolace a konzervace

Různé vzorky půdy byly odebrány z rekultivovaných travních porostů v Hwaseong (37◦16′10" N 126◦45′43" E) a Kyonggi University Forest (37◦18′1" N 127◦2′20" E) v Koreji. Bakterie byly izolovány pomocí výše popsané metody [9]. Kolonie byly naneseny na plotny R2A každý 1 týden pro krátkodobou konzervaci a skladovány při -80 °C jako suspenze v bujónu R2A doplněném 20 procenty (objem/objem) glycerolu pro dlouhodobou konzervaci.

2.4. Screening, identifikace a fylogenetická poloha izolovaných kmenů

Screening kosmetických a antimikrobiálních aktivit izolovaných kmenů byl dokončen, jak bylo popsáno dříve [9]. Bakterie s funkcemi byly identifikovány pomocí sekvenování genu 16S rRNA. Genomová DNA kmenů byla extrahována pomocí soupravy InstaGene Matrix kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a gen 16S rRNA byl amplifikován pomocí PCR pomocí univerzálního bakteriálního primeru 27F a 1492R [32]. Produkt PCR byl purifikován pomocí multiscreen-filtrační destičky (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) a byl sekvenován pomocí analyzátoru DNA Applied Biosystems 3770XL s použitím soupravy BigDye Terminator cycle sequencing kit v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Téměř úplná sekvence vyhovovala softwaru SeqMan (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA). Nejbližší kmen izolovaných funkčních kmenů byl identifikován pomocí EzBioCloud [33] a databáze NCBI GenBank [34]. Související sekvence 16S rRNA byly získány z GenBank a fylogenetická analýza byla provedena pomocí MEGA7 [35].

2.5. Kultura bakterií

P. acnes byla kultivována inkubací při 37 ◦C po dobu 3–4 dnů anaerobně v Schaedlerově anaerobním bujónu (Oxoid). Pro anaerobní kultivaci byla použita anaerobní nádoba BBL se systémem GasPak EZ Gas Generating Container System (Becton Dickinson, NJ, USA). S. epidermidis a S. aureus byly kultivovány v médiu TSB (Tryptic soy buth) (Oxoid) při 37 °C po dobu 24 hodin aerobně. E. coli, P. aeruginosa a B. subtilis byly kultivovány v médiu LB (Luria-Bertani) (Oxoid). Izolované bakteriální kmeny byly kultivovány v R2A při 28 ◦C po dobu 4–5 dnů.

2.6. Kvašení

Pro fermentační proces bylo inokulum připraveno v R2A bujónu při 28 ◦C po dobu 4–5 dnů ve 150 hodin. Kmen T65 byl fermentován s použitím 1–2 procentního inokula v médiu ISP2 (International Streptomyces Project 2) při 28 °C po dobu 1 týdne ve 140 hodin.

2.7. Extrakce

Sklizený kultivační bujón byl centrifugován při 11 305 x g po dobu 20 minut při 4 °C s velkokapacitní odstředivkou 1736R (LABOGENE, Soul, Korea). Kultivační supernatant byl filtrován filtračním papírem o velikosti 150 mm (Whatman 1001-150, GE Healthcare, Maidstone, UK), aby se odstranily buněčné zbytky a koncentrován na rotační odparce při 40 °C. Koncentrovaný surový produkt byl poté dvakrát extrahován stejným objemem za použití pěti různých rozpouštědel (n-hexan, diethylether, dichlormethan, chloroform a ethylacetát). Bylo zjištěno, že nejlepším rozpouštědlem je ethylacetát a další analýzy byly provedeny s použitím extraktu ethylacetátu. Organická vrstva se oddělí dělicí nálevkou a odpaří se do sucha. Nakonec byl vysušený surový produkt rozpuštěn v methanolu pro další hodnocení.

extrakt z cistanche

2.8. Sběr aktivních frakcí pomocí preparativní HPLC (Prep-HPLC)

Aktivní frakce extraktu surové kultury T65 byly shromážděny pomocí preparativní HPLC (série Agilent 1200). Jako stacionární fáze byla použita reverzní kolona Shim-pack-PREP-ODS (K) C18 (30 mm id × 25 cm) s velikostí částic 15 μm. Pro mobilní fázi bylo použito 0,1 procenta HCHOOH vody (rozpouštědlo A) a acetonitrilu (rozpouštědlo B). Koncentrace rozpouštědla B byla 10 procent až 100 procent od 0 minut do 60 minut a 100 procent od 60 minut do 75 minut. Průtok byl 15 ml/min. Byl použit vícevlnný detektor (MWD) s 208, 230, 254 a 280 nm. Shromážděné frakce od 14 min do 21 min byly odpařeny do sucha a rozpuštěny v methanolu (T65 surový produkt) pro další hodnocení.

2.9. Životaschopnost buněk HaCaT

Buněčná životaschopnost HaCaT buněk byla stanovena pomocí testu CCK-8 (Cell Counting Kit-8) podle pokynů výrobce. Buňky HaCaT byly nasazeny na 96-jamkové destičky v množství 104 buněk na jamku a poté inkubovány při 37 °C po dobu 24 hodin v Dulbeccově modifikovaném Eaglesově médiu (DMEM) obsahujícím 10 procent fetálního bovinního séra (FBS). Buňky byly ošetřeny různými koncentracemi surového produktu T65 (10 mg/ml, 1 mg/ml, 100 ug/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml, 100 ng/ml a 1 ng/ml) a inkubovány při pokojové teplotě po dobu 2 hodin ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent CO2 s přídavkem 10 μl CCK-8 činidla. Absorbance reakční směsi byla měřena spektrofotometrem pro mikrodestičky při 450 nm a bylo vypočteno procento životaschopnosti buněk.

2.10. Hodnocení antioxidačních aktivit

2.10.1. Hodnocení toxicity v buňkách RAW264.7

Buňky RAW264.7 byly udržovány v DMEM obsahujícím 10 procento FBS, 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu při 37 °C v 5% CO2 inkubátoru. Buňky RAW264.7 byly nasazeny na 96-jamkovou mikrotitrační destičku s plochým dnem v hustotě 104 buněk na jamku s různými koncentracemi (0–1 mg/ml) surového produktu T65 a inkubovány při 37 ◦C po dobu 24 h v inkubátoru s 5% CO2. Po 24 hodinách inkubace byly buňky dvakrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a do každé jamky bylo přidáno 190 ul čerstvého média a 10 ul pracovního roztoku MTT (5 mg/ml) a destička byla poté inkubována při 37 ◦C po dobu 4 hodin v inkubátoru s 5% CO2. Poté byl supernatant odstraněn a krystaly formazanu, které se vytvořily, byly solubilizovány přidáním 150 ul DMSO (dimethylsulfoxid) do každé jamky po dobu 10 minut při 37 °C v inkubátoru s 5% CO2. Intenzita rozpuštěných krystalů formazanu byla kvantifikována pomocí čtečky mikrodestiček při 570 nm.

2.10.2. Stanovení oxidu dusnatého

Buňky RAW264.7 (105 buněk/ml) byly předem ošetřeny různými koncentracemi surového produktu T65 (15,5–125 ug/ml) po dobu 30 minut, poté následovala stimulace 1 ug/ml LPS po dobu 24 hodin. Koncentrace NO uvolněného z buněk byla stanovena pomocí Griessova činidla pomocí standardní křivky NO2– [36]. Sto mikrolitrů kultivačního supernatantu bylo inkubováno se 100 μl Griessova činidla (směs N-1-naftyl ethylendiamin dihydrochloridu (NEDHC) a sulfanilamidu) při pokojové teplotě po dobu 20 minut ve tmě. Absorbance byla měřena při 540 nm.

2.10.3. DPPH test vychytávání volných radikálů

Činnosti vychytávání volných radikálů DPPH byly prováděny podle dříve popsané metody [9]. Surový produkt extraktu kultury T65 byl zředěn na koncentrace 600, 200, 100, 20 a 4 ug/ml v methanolu. Reakční směs o objemu 180 ul byla připravena s 90 ul 0,1 mM DPPH (rozpuštěného v MeOH) a 90 ul roztoků vzorků různých koncentrací (tabulka S1). Testované reakce byly důkladně promíchány v 96-jamkových destičkách, inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut a absorpce byla měřena při 516 nm pomocí spektrofotometru. Procento inhibice DPPH bylo vypočteno následovně:

Inhibice ( procenta )=[1 − (ODexp − ODcon) / (ODstd − ODbln)] × 100 (1)

kde ODexp je absorbance experimentálního vzorku; ODcon je absorbance kontroly; ODstd, absorbance standardu; a ODbln, absorbance blanku.

2.11. Hodnocení aktivit proti stárnutí

2.11.1. Hodnocení cytotoxicity v buňkách CCD-986Sk

Buněčná cytotoxicita různých koncentrací (0–1 mg/ml) surového produktu T65 v buňkách lidských kožních fibroblastů (CCD-986Sk) byla stanovena pomocí MTT testu, jak bylo dříve popsáno pro MTT test RAW264.7 buňky.

2.11.2. Proliferace lidských fibroblastů pomocí CCD-986Sk buněk

Buněčná proliferace lidských dermálních fibroblastů (HDF) byla stanovena v buňkách CCD{{0}}}Sk pomocí testu CCK-8. CCD-986Buňky Sk byly nasazeny na 96-jamkové destičky v množství 5 × 103 buněk/jamku a poté inkubovány při 37 °C po dobu 24 hodin v DMEM obsahujícím 10 procent FBS. Buňky byly ošetřeny různými koncentracemi surového produktu T65 (0–1 mg/ml) a inkubovány při pokojové teplotě po dobu 2 hodin ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent CO2 s přídavkem 10 μl CCK-8 činidla. Absorbance reakční směsi byla měřena čtečkou mikrodestiček při 450 nm a procento životaschopných buněk bylo stanoveno ve srovnání s absorbancí neošetřených buněk.

Cistanche působí proti stárnutí.

2.11.3. Test syntézy kolagenu typu I

Syntéza kolagenu typu I byla testována imunoanalýzou s enzymem vázaným na imunosorbent (ELISA). CCD-986Buňky Sk byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 5 × 103 buňky/jamku v DMEM obsahujícím 10 procento FBS a inkubovány při 37 ◦ C po dobu 24 hodin. Různé koncentrace surového produktu T65 (31,25–25{{30}} pg/ml) byly přidány do média bez FBS po dobu 24 hodin. Poté bylo 100 μl kultivačního média a kolagenu typu I přidáno do kolagenem potažených 96-jamkových destiček a inkubováno při 37 ◦C po dobu 24, 48 a 72 hodin. Každá jamka byla promyta 0,05% fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem s 0,1% Tween 20 (PBST) a byla přidána primární protilátka COL1A1 a inkubována po dobu 1 hodiny. Znovu byly jamky promyty 0,05% PBST a byla přidána sekundární protilátka konjugovaná s HRP (křenová peroxidáza) a inkubována po dobu 1 hodiny. Každá jamka byla promyta 0,05% PBST a byl přidán TMB (tetramethylbenzidin). Po získání požadované intenzity zbarvení (modrá) byla reakce ukončena přidáním 0,5N H2SO4, čímž se barva roztoku změnila na žlutou. Absorbance byla měřena při 450 nm čtečkou mikrodestiček a byla stanovena produkce kolagenu typu I.

2.11.4. Test inhibice elastázy

Inhibiční aktivity prasečí pankreatické elastázy (PPE) byly testovány podle postupu popsaného dříve [9]. Surový produkt T65 byl zředěn na koncentrace 30{{10}}0, 1000, 500 a 100 ug/ml v methanolu. Reakční směs byla připravena s 0,2 M Tris-HCl pufrem (pH 8,0), 0,5 mM N-Succ-(Ala)3-ρ-nitroanilidem (SANA) jako substrátem, prasečí pankreatickou elastázou (3,5 U/ml v 0,2 M Tris-HCl pufr; pH 8,0) a inhibitor (vzorek). Každý vzorek byl předinkubován při 37 °C po dobu 15 minut a celková reakční směs byla inkubována při 37 °C po dobu 20 minut. Absorpce byla měřena při 400 nm. Celková reakční směs o objemu 150 ul byla připravena podle tabulky S2. Konečné koncentrace vzorku v reakční směsi byly 300, 100, 50 a 10 ug/ml. Procento inhibice PPE bylo vypočteno pomocí vzorce (1).

2.12. Hodnocení bělicích aktivit

2.12.1. Hodnocení cytotoxicity v buňkách B16F1

Cytotoxicita surového produktu T65 vůči buňkám melanomu B16F1 byla stanovena testem MTT. Buňky B16F1 byly nasazeny na 96-jamkové destičky v množství 104 buňky na jamku a poté inkubovány při 37 °C po dobu 24 hodin v DMEM obsahujícím 10 procent FBS. Buňky byly ošetřeny různými koncentracemi surového produktu T65 (0–1 mg/ml) a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 2 hodin ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent CO2. Absorbance reakční směsi byla měřena spektrofotometrem pro mikrodestičky při 450 nm a bylo vypočteno procento životaschopnosti buněk.

2.12.2. Inhibice syntézy melaninu v buňkách B16F10

Buňky B16F10 byly předem ošetřeny -MSH v 6-jamkových destičkách v množství 105 buněk na jamku a inkubovány při 37 °C po dobu 24 hodin v DMEM obsahujícím 10 procent FBS k podpoře syntézy melaninu. Buňky byly inkubovány s různými koncentracemi surového produktu T65 (31,25–125 ug/ml) a 100 ug/ml arbutinu jako pozitivní kontrola v přítomnosti nebo nepřítomnosti -MSH po dobu 48 hodin. Byla pozorována inhibice syntézy melaninu v melanomových buňkách B16F10.

Cistanche inhibuje tvorbu melaninu.

2.12.3. Test inhibice houbové tyrosinázy

Inhibiční aktivity houbové tyrosinázy byly stanoveny, jak bylo popsáno dříve [9]. Surový produkt T65 byl zředěn na koncentrace 3000, 1000, 500 a 100 ug/ml v methanolu. Reakční směs byla připravena s 0,1 M pufrem fosforečnanu draselného (pH 6,8), 3 mM roztokem l-tyrosinu [rozpuštěným v DW (destilovaná voda)] a 2000 U/ml houbové tyrosinázy (rozpuštěné v 0,05 M pufru fosforečnanu draselného, ​​pH 6,8 ; Sigma) v 96-jamkových destičkách. Celková testovací směs 150 μl (120 μl fosfátového pufru, 10 μl l-tyrosinu, 15 μl roztoku vzorku a 5 μl houbové tyrosinázy; tabulka S3) byla inkubována při 37 ◦C po dobu 10 minut a absorpce byla měřena při 475 nm. Konečné koncentrace vzorku v reakční směsi byly 300, 100, 50 a 10 ug/ml. Standard byl bez roztoku vzorku, kontrola byla bez l-tyrosinu a slepý pokus byl bez l-tyrosinu a roztoku vzorku. Procento inhibice tyrosinázy bylo vypočteno použitím vzorce (1).

2.13. Analýza aminokyselin

Volná aminokyselina surového produktu T65 byla stanovena metodou GC-FID (plynová chromatografie – plamenový ionizační detektor) v Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Pro metodu GC-FID byl použit stroj Agilent 6890N GC-FID; kolona, ​​ZB-AAA (10 m x 0,25 mm); teplota vstřikovací části, 250 ◦C; injekční kolona, ​​2 ul; dělicí poměr, 5:1; teplotní podmínky, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detektor, FID @ 320 ◦C; nosič, plynný dusík, 1,5 ml/min; výrobce, Phenomenex; aminokyselinový standard; a koncentrace 200 μmol/l.

Kompozitní aminokyseliny surového produktu T65 byly stanoveny metodou GC-FID (plynová chromatografie – plamenový ionizační detektor) v Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Pro GC-FID byl použit stroj Agilent 6890N GC-FID; kolona, ​​ZB-AAA (10 m x 0,25 mm); teplota vstřikovací části, 250 ◦C; injekční kolona, ​​2 ul; dělicí poměr, 5:1; teplotní podmínky, 110 ◦C → 32 ◦C/min → 320 ◦C; detektor, FID @ 320 ◦C; nosič, plynný dusík, 1,5 ml/min; výrobce, Phenomenex; aminokyselinový standard; a koncentrace 200 μmol/l.

2.14. Mastné kyseliny

Mastná kyselina surového produktu T65 byla stanovena metodou GC-FID (plynová chromatografie – plamenový ionizační detektor) v Korea Polymer Testing and Research Institute (Koptri). Pro GC-FID byl použit stroj Agilent 6890N GC-FID; kolona, ​​Supelco SP–2500 (100 m × 0,25 mm × 0,20 μm); teplota vstřikovací části, 250 ◦C; injekční kolona, ​​1 μl; dělicí poměr, 50:1; teplotní podmínky, 100 ◦C (4 min) → 3 ◦C/min → 240 ◦C (15 min); detektor, FID @ 285 ◦C; nosič, plynný dusík, 0,8 ml/min; výrobník, SUPELCO 37 Component FAME Mix; a koncentrace 0,5 mg/ml.

2.15. Antimikrobiální aktivity

Inhibice patogenních bakterií byla provedena diskovou difúzní metodou. Sto mikrolitrů kultury P. acnes při 108 CFU (jednotka tvořící kolonie)/ml bylo rozetřeno a inkubováno při 35 ◦C anaerobně po dobu 2–3 dnů na Schaedlerových agarových miskách spolu s 6 mm diskem (Whatman) obsahujícím 15 ug surového extraktu rozpuštěného v methanolu a byly měřeny zóny inhibice. Podobně bylo naneseno 100 μl S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli a P. aeruginosa při 108 CFU/ml a inkubováno při 35 ◦C aerobně na miskách R2A nebo LBA pro {{12} dnů a byly měřeny zóny inhibice.

2.16. Syntéza mezoporézních částic oxidu křemičitého

Strukturu vyvolávající polymer byl rozpuštěn v deionizované vodě, aby se připravil roztok micel. Mezoporézní materiály oxidu křemičitého byly syntetizovány podle metod popsaných v literatuře [37]. Pro syntézu mezoporézních částic oxidu křemičitého (SBA-15) se 10 g Pluronic P123 (EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, USA) rozpustilo v 55 ml 2M HCl a následně se míchalo při teplotě místnosti. teplotu po dobu 30 min. Dále bylo do roztoku přidáno 22 g tetraethylorthosilicate (TEOS) a dále mícháno 30 min a umístěno na 24 h při 36 ◦C a poté vloženo do sušárny, ve které byla teplota udržována na 100 ◦C, a ponecháno 4 dny ve statickém stavu. Po 4 dnech se roztok v lahvičce změnil na zakalený. Zakalený roztok byl zfiltrován dvěma vrstvami celulózového filtračního papíru a promyt EtOH (dvakrát) a DI (deionizovanou) vodou (dvakrát). Výsledný filtrovaný prášek byl vysušen v konvekční peci 120 ◦C a vložen do muflové pece (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Soul, Jižní Korea). Šest vzorků bylo syntetizováno za stejných podmínek, ale v jiné dávce. Transmisní elektronové mikrofotografie (TEM) syntetizovaného SBA-15 byly pořízeny na Národní univerzitě v Soulu pomocí transmisní elektronové mikroskopie (Talos L120C; FEI).

2.17. BET analýza plochy povrchu

Velikost částic oxidu křemičitého byla měřena přístrojem Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt., Malvern, Spojené království). Pro přípravu vzorku analýzy BET (Brunauer–Emmett–Teller) bylo 5 g P-123 přidáno k 76 g 2M HCl a mícháno při 250 ot./min. po dobu 24 hodin. Po 24 hodinách, kdy byl P-123 zcela rozpuštěn, bylo rovnoměrně přidáno 160 ml DI (deionizované) vody a TEOS (15 ml/min) a směs byla míchána při 750 otáčkách za minutu po dobu 24 hodin. Poté byl vytvořený prášek oddělen filtrací a oddělený prášek byl umístěn do náprstku a promýván Soxhletem po dobu 24 hodin. Poté byl promyt deionizovanou vodou a vypálen v muflové peci (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Jižní Korea). Pro potvrzení účinnosti prášku vyrobeného syntézou SBA{14}} byly provedeny analýzy povrchové plochy BET. BET analýzy byly dokončeny Inha University a Changwon National University.

Sorpční analyzátor plynu (Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, OR, USA) byl použit ke zkoumání distribuce povrchové plochy a velikosti pórů připravených mezoporézních silikátových materiálů. Distribuce povrchové plochy a velikosti pórů byly vypočteny pomocí softwaru ASiQwin (Anton Paar Quanta Tech Inc., Boynton Beach, FL, USA) na základě izoterm adsorpce-desorpce. Původní syntetizované částice byly odplyněny při 300 ◦C/3h, poté byly měřeny adsorpční a desorpční izotermy N2 při teplotě −196 ◦C. Pro výpočet celkové plochy povrchu byla použita vícebodová BET analýza.

2.18. Posouzení udržitelnosti

Pro potvrzení přítomnosti T65 ve vloženém SBA-15 bylo provedeno následující provedení: 12 g SBA-15 a 1,2 g surového produktu T65 bylo smícháno v 500 ml acetonitrilu. Roztok se míchá 18 hodin při 30 °C. Po filtraci byla směs zfiltrována a přefiltrované částice byly vysušeny v konvekční sušárně při 100 °C. K nalezení samotné částice T65 v SBA-15 byl 1 g sušeného T65 vloženého do SBA-15 rozpuštěn v acetonitrilu a bylo přidáno 25 ml 3M kyseliny fluorovodíkové. Směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 24 hodin, dokud nebyl roztok čirý. Poté byl roztok zfiltrován a roztok filtrátu byl použit jako vzorek. Vzorky získané z výše uvedených experimentů byly analyzovány pomocí HPLC.

Pro stanovení vlastnosti řízeného uvolňování bylo 35 ml zabudovaného SBA-15 nalito do 50 ml minerálního oleje (M3516; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a dobře promícháno. Poté bylo ke směsi přidáno 50 ml DI vody a třepáno při teplotě místnosti po dobu 6 hodin a poté ponecháno na stole po dobu 12 hodin. Když byla kapalná vrstva oddělena, vodná vrstva byla odstraněna a byl odebrán 1 ml olejové vrstvy jako vzorek pro HPLC analýzu. Stejný experiment byl opakován druhý a třetí den a vzorek byl znovu analyzován pomocí HPLC.

2.19. Kosmetické složení a aplikace

2.19.1. Test složení a stability

Kosmetický produkt byl formulován z krému typu emulgátoru. Stabilita kosmetického přípravku byla stanovena uchováváním kosmetického produktu při různých teplotách (37, 45 a 60 °C), včetně v mrazáku, chladničce a při pokojové teplotě po dobu až 28 dnů. Stabilita kosmetického krému byla pozorována v prvním, druhém, třetím a čtvrtém týdnu.

2.19.2. Klinické zkoušky, dobrovolníci a aplikační metody

Funkční kosmetický krém obsahující surový produkt T65 byl aplikován 21 dobrovolnicím za účelem stanovení zlepšení vrásek a bělící účinnosti prostřednictvím drsnosti a jasu pokožky. Všechny experimentální postupy pro zapojení lidí do této studie byly schváleny Elad Institutional Review Board (IRB) (EL-P-7400). Informovaný souhlas byl získán od všech jednotlivých účastníků. Testy byly provedeny před aplikací přípravku, po 2 týdnech a po 4 týdnech. Přibližně 5 mg kosmetického přípravku bylo aplikováno dvakrát denně (ráno a večer) na obličej po očištění obličeje a jemně rozetřeno podle textury pleti. Dobrovolníkům nebylo dovoleno používat žádné jiné krémy nebo produkty 1 týden před testem a během testu.

2.19.3. Metody snímání a zpracování obrazu

Snímky pořídila VISIA-CR. Drsnost snímků byla analyzována softwarem PRIMOS (PRIMOS verze 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, USA). Průměrná drsnost (Ra) a maximální hloubka drsnosti (Rmax) byly vypočteny pomocí následujícího vzorce:

Míra Ra nebo Rmax ( procento )=(hodnota před léčbou – hodnota po léčbě)/hodnota před léčbou × 100 (2)

Jas snímků byl analyzován pomocí Chromameter CR-400. L* je parametr jasu a měří se podle následujícího vzorce:

L* míra nárůstu ( procenta )=(hodnota před léčbou – hodnota po léčbě)/hodnota před léčbou × 100 (3)

2.20. Statistická analýza

Statistické výpočty hodnoty IC50 byly provedeny statistickým softwarem OriginPro 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). Všechny experimenty byly provedeny v triplikátech a všechny výsledky byly prezentovány jako průměr ± SD ze tří samostatných experimentů. Data byla analyzována nezávislou vzorkovou t-testovou jednocestnou analýzou rozptylu (jednosměrná ANOVA), následovanou Tukeyho post-hoc testem pomocí OriginPro 8.5. Rozdíly byly považovány za významné při p <>

3. Výsledky a diskuse

3.1. Izolace, selekce a fylogeneze vybraných aktivních kmenů

Z odebraných vzorků půdy bylo izolováno celkem 2285 kmenů bakterií. Výsledky screeningu ukázaly, že 102 kmenů bakterií mělo funkce použitelné pro kosmeceutika (tabulka S4). Na základě primárního screeningu Streptomyces sp. Bylo zjištěno, že T65 má vyšší aktivity pro všechny kosmetické aplikace, jmenovitě pro antioxidační, antielastázové, antityrosinázové a antimikrobiální aktivity. Nakonec byl kmen T65 vybrán pro další hodnocení, aby se identifikovalo jeho potenciální použití v kosmetice. Fylogenetická analýza ukázala, že kmen T65 tvořil klad se Streptomyces bungoensis DSM 41781T (nejbližší kmen na základě genové sekvence 16S rRNA) se silnou bootstrap hodnotou (obrázek S1).

3.2. Detekce a odběr bioaktivního materiálu

Smíšené bioaktivní materiály z extraktu kultury ethylacetátu T65 byly odebrány z Prep-HPLC. Bioaktivní materiály byly měřeny při 208, 230, 254 a 280 nm pomocí detektorů. Frakce byly sbírány na základě času (od 14 min do 21 min). Shromážděné frakce byly odpařeny do sucha a rozpuštěny v methanolu (surový produkt T65) a byly použity pro všechna hodnocení, včetně antimikrobiálních aktivit.

3.3. Cytotoxicita v buňce HaCaT

Životaschopnost buněk v buněčné linii lidských keratinocytů (buňka HaCaT) zůstala neovlivněna surovým produktem T65 až do 10 mg/ml. Na druhé straně se životaschopnost buněk zvýšila v závislosti na dávce, když byly aplikovány koncentrace 10 ng/ml až 10 mg/ml surového produktu T65 (obrázek S2). Toto koncentrační rozmezí mělo za následek více než 100% životaschopnost buněk, což ukazuje, že podporovalo proliferaci HaCaT buněk a bylo tedy netoxické pro HaCaT buněčnou linii.

3.4. Antioxidační aktivity

3.4.1. Cytotoxicita v buňce RAW264.7

Cytotoxicita surového produktu T65 byla hodnocena pomocí buněčné životaschopnosti v makrofázích RAW264.7 metodou MTT testu. Surový produkt T65 nevykazoval žádný cytotoxický účinek na buněčné linie RAW264.7.

Naopak surový produkt T65 pomohl proliferovat buňky RAW264.7 způsobem závislým na dávce, když byl ošetřen 13,5 až 10}00 ug/ml. Když bylo použito 1000 ug/ml T65 surového produktu, životaschopnost buněk RAW264.7 byla 118,7 procenta (p < 0,05).="" tyto="" výsledky="" ukázaly,="" že="" surová="" sloučenina="" t65="" byla="" netoxická="" do="" 1="" mg/ml="" a="" mohla="" být="" použita="" v="" kosmetických="">

3.4.2. Inhibice produkce oxidu dusnatého (NO).

Ke stanovení hladin NO bylo použito Griessovo činidlo. Pro stanovení inhibice NO RAW264.7buňky byly ošetřeny 1 ug/ml LPS (lipopolysacharid) spolu s různými koncentracemi surového produktu T65. Buňky RAW264.7 byly aktivovány LPS a produkce NO byla měřena jako koncentrace dusitanů v kultivačním médiu. Ve srovnání se samotným LPS surový produkt T65 významně (p < 0="" 0,001)="" inhiboval="" koncentraci="" dusitanů="" v="" lps-stimulovaných="" buňkách="" raw264.7="" způsobem="" závislým="" na="" koncentraci="" při="" použití="" od="" 15,5="" do="" 125="" ug/ml="" (obr.="" 2).="" makrofágy="" byly="" lps-toll-like="" expresí="" indukovatelné="" no="" syntázy="" (inos)="" signalizací="" buněčné="" aktivace="" prostřednictvím="" receptorů="" [38].="" lps="" je="" aktivátorem="" makrofágů="" a="" hraje="" důležitou="" roli="" v="" produkci="" no="" v="" savčích="" buňkách="" [39].="" no="" je="" volný="" radikál="" produkovaný="" imunokompetentními="" buňkami,="" jako="" jsou="" makrofágy="" [40].="" produkce="" no="" má="" fagocytární="" účinek="" na="" makrofágy.="" pro="" antioxidační="" test="" byla="" tedy="" vybrána="" makrofágová="" buněčná="" linie="" raw264.7.="" po="" dlouhou="" dobu="" byla="" věnována="" značná="" pozornost="" hledání="" přírodních="" antioxidantů="" k="" inhibici="" produkce="" no="" [41].="" při="" 125="" ug/ml="" surový="" produkt="" t65="" dostatečně="" snížil="" hladiny="" no="" o="" 57,4="" procent="" ve="" srovnání="" s="" no="" produkovaným="" 1="" ug/ml="" lps.="" na="" základě="" inhibice="" no="" produkovaného="" v="" lps-indukované="" makrofágové="" buněčné="" linii="" raw264.7="" lze="" extrakt="" kultury="" t65="" považovat="" za="" silný="">

Hodnoty DPPPHrRaaddiciacal lsScacvaveenggininggpAerccteivnity v různých koncentracích a hodnota IC50 surového produktu T65 jsou uvedeny v tabulce S5. Kyselina askorbová (vitamín C) byla používána jako standard, protože se používá v pleťových vodách, krémech, sérech a náplastech, o kterých je dobře známo, že mají silné antioxidační aktivity pro topické aplikace [42]. Bylo zjištěno, že IC50 pro aktivity vychytávání radikálů DPPH pro vitamin C a sekundární produkty T65 jsou 5,01 a 6,31 ug/ml (obrázek 3).

Existuje jen několik studií o antioxidačních aktivitách bakteriálních izolátů ve srovnání s těmi z rostlinných materiálů a většina studií se zaměřila na dobře zavedené rostlinné produkty [43–49]. Koncentrace 10 ug/ml produktu byla schopna vychytat 68,66 ± 2,83 procenta volných radikálů DPPH. Hodnota IC50 surového produktu T65 byla téměř srovnatelná s hodnotou nejsilnějšího antioxidantu vitaminu C, což ukázalo, že by mohl být použit jako antioxidační činidlo při formulaci kosmeceutik.

3.5.1. Cytotoxicita v buňkách CCD-986Sk

Cytotoxicita surových sloučenin T65 v buňkách lidských dermálních fibroblastů (HDF) byla hodnocena v buněčné linii CCD-986Sk pomocí MTT testu. Když byla dodána koncentrace surového produktu T65 od 0 do 1 mg/ml, HDF buňky proliferovaly způsobem závislým na dávce až do koncentrace 500 ug/ml. Tento výsledek ukázal, že surové sloučeniny z T65 byly necytotoxické pro HDF buňky. Bylo však zjištěno, že koncentrace vyšší než 1 mg/ml je cytotoxická a pouze 81,34 procent buněk přežilo ve srovnání s kontrolou (obrázek 4).

3.5.2. Proliferace HDF

Proliferace HDF buněk byla stanovena pomocí CCD {{0}}Sk buněčné linie. Surový produkt T65 proliferoval HDF buňky způsobem závislým na koncentraci od 0 do 500 ug/ml (obrázek 5). Nicméně byl cytotoxický v koncentraci 1 mg/ml. Růst lidských dermálních epiteliálních buněk potvrdil schopnost vylepšování vrásek prostřednictvím změny primárních kultivovaných buněk izolovaných z lidských dermálních buněk a sekretovaného kolagenu [50,51].

3.5.3. Syntéza kolagenu typu I

Syntéza kolagenu typu I byla detekována pomocí ELISA. Surový produkt T65 při 250 pg/ml zvýšil koncentraci kolagenu typu I v závislosti na dávce až na 145,91 procent ± 9,11 procent (průměr ± SD; průměr 24, 48 a 72 hodin). Výsledek tří experimentů po 24, 48 a 72 hodinách ukázal syntézu kolagenu typu I (obrázek 6). Sekrece kolagenu dermálními buňkami doprovázená růstem lidských dermálních epiteliálních buněk tedy potvrdila schopnost sloučenin T65 zlepšit tvorbu vrásek.

3.6. Bělící činnosti

3.6.1. Cytotoxicita v buňkách B16F1

Výsledek cytotoxicity surového produktu T65 na buňky melanomu B16F1 testem MTT je znázorněn na obrázku 8. Výsledek inkubace surového produktu T65 v buňkách B16F1 vykazoval netoxické účinky až do koncentrace 1 mg/ml. Buňky B16F1 proliferovaly způsobem závislým na dávce až do koncentrace 62,5 ug/ml, ale bylo vyhodnoceno významné (p < 0,05)="" na="" dávce="" závislé="" snížení="" životaschopnosti="" buněk="" od="" 125="" do="" 1000="" ug/ml.="" nicméně="" při="" koncentraci="" 1="" mg/ml="" bylo="" pozorováno="" 99,12="" procent="" ±="" 4,16="" procent="" životaschopných="" buněk="" (obrázek="" 8).="" experimentální="" výsledky="" ukázaly,="" že="" ethylacetátový="" extrakt="" kultury="" kmene="" t65="" byl="" necytotoxický="" pro="" buněčnou="" linii="" melanomu="" b16f1="" a="" mohl="" být="" použit="" ve="" formulaci="" kosmetických="" produktů="" pro="" bělení="" lidské="">

3.6.2. Inhibice syntézy melaninu v buňkách B16F10

Pro potvrzení bělícího účinku buňky B16F10, buněčná linie, která vylučuje a produkujemelanin v buňkách. Pro podporu syntézy melaninu byl B16F10 doplněn 1 ug -MSH. Jako pozitivní kontrola byl použit arbutin (100 ug/ml; komerčně dostupné bělící činidlo). Mikroskopické pozorování tohoto experimentu ukázalo téměř úplnou inhibici melaninu aplikací 125 ug/ml extraktu kultury T65 za 48 hodin (obrázek 9A, B). Tento experiment prokázal, že extrakt kultury T65 má potenciál inhibovat syntézu melaninu v závislosti na dávce a může být použit jako bělící činidlo pro formulaci kosmetických produktů pro topické aplikace.

3.7. Mezoporézní křemičité materiály

Mezoporézní materiál je materiál obsahující póry o průměru 2 až 50 nm podle nomenklatury IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), a tedy mezoporézní materiál oxidu křemičitého je materiál oxidu křemičitého, který má póry o průměru 2–50 nm. Tento materiál byl poprvé popsán v 70. letech 20. století v amerických patentech, ale v souvisejících oblastech nebyl dostatečně zaznamenán, a tak byl podobný materiál nezávisle prozkoumán a syntetizován Japonskem znovu v roce 1990 [69]. Podrobnější výzkum sledovala společnost Mobil Corporation Laboratories a tento materiál pojmenovali MCM (Mobil crystalline material), s příklady jako MCM-41 nebo MCM-48, jejichž mezopórový průměr se pohybuje od 2 do 6 nm [70,71]. Jiné výzkumné skupině na Kalifornské univerzitě v Santa Barbaře se o 6 let později podařilo syntetizovat mesoporézní oxid křemičitý s větší velikostí pórů (5–30 nm) a pojmenovali jej SBA (amorfní materiál Santa Barbara)-15 [72] . Materiál Mesopore oxid křemičitý byl původně navržen pro použití jako molekulární síto kvůli jeho vlastnímu strukturálnímu charakteru, ale v poslední době našel širokou škálu aplikací při dodávání léčiv, katalyzátoru, biosenzoru, skladování energie a tak dále.

Mezi mezoporézními materiály SBA-15 a MCM-41 jsou různé rozdíly. Nejjednodušší způsob, jak tyto dva odlišit, je tloušťka stěny oxidu křemičitého. SBA-15 se silnější stěnou z oxidu křemičitého má stabilnější a tužší strukturu ve srovnání se strukturou MCM-41, která má tenčí tloušťku stěny. Syntetická metoda SBA-15 je navíc jednodušší než metoda MCM-41. Vzhledem k těmto rozdílům byla SBA-15 vybrána tak, aby nesl bioaktivní surový produkt T65 uvnitř mezopóru materiálu oxidu křemičitého.

3.8. Syntéza mezoporézních částic oxidu křemičitého

Poté, co byl proces kalcinace prováděn při 200 °C po dobu 2 hodin a 600 °C po dobu 3 hodin nepřetržitě, byl získán výsledný bílý mezoporézní prášek oxidu křemičitého. V tomto procesu byly syntetizovány SBA-15 8 nm pórů. Velikosti částic SBA-15 byly zjištěny v průměru 11,539–13,630 mm (obrázek S4) a byly určeny dvěma různými zařízeními: Inha University Laboratory a Changwon National University Laboratory. Kromě toho bylo všech šest vzorků na obrázku S4 syntetizováno stejnou metodou, ale jinou šarží.

Když byla směs udržována při 60 ◦C a ponechána po dobu 4 dnů za statických podmínek podle výše uvedené metody, byl známý SBA-15 o velikosti 5 nm. Navíc, když byla teplota regulována na 120 ◦C, byl syntetizován SBA-15 10 nm. Podle výsledků lze velikost mezopórů kontrolovat v závislosti na procesu stárnutí [73]. SBA-15 s póry 10 nm (obrázek 11) byl použit pro další zpracování, protože mezoporézní nanomateriály oxidu křemičitého s velkými póry mají lepší transportní účinky pro biomolekuly než úzké póry [74].

3.9. Hodnocení udržitelného výkonu

Aby se určilo, zda mezoporézní SBA-15 má schopnost řízeného uvolňování, byly SBA-15 a surový produkt T65 smíchány v DI vodě, methanolu, acetonitrilu nebo ethylenglykolu jako rozpouštědle. Když byly SBA-15 smíchány a voda, roztok se stal kaší kvůli koagulaci mezi povrchem oxidu křemičitého a vodou. Methanol byl dobrým rozpouštědlem jak pro oxid křemičitý, tak pro surový produkt T65. Avšak kvůli toxicitě byl acetonitril nahrazen methanolem. Částice pro imerzní poměr T65 byly určeny hodnotou PV (tabulka S13). Jak je uvedeno v tabulce S13, hodnota PV SBA-15 klesla po ponoření se surovým produktem T65. To ukázalo, že materiály T65 byly dobře ponořeny do mezoporézních částic oxidu křemičitého.

K určení, zda se uvnitř částice nachází T65, byl samotný T65 zkoumán pomocí HPLC (obrázek S5). Jak ukazují data, existovaly dva specifické píky (uvnitř červeného rámečku), které byly vždy viditelné v případě extraktů kultury T65, i když byla změněna šarže přípravku T65. Tyto dva píky měly retenční časy 10 min a 12 min při 230 nm. Vzorek filtrátu byl zkoumán pomocí HPLC, aby se určilo, zda je T65 přítomen uvnitř vloženého SBA-15. Jak je znázorněno na obrázku S6, byly pozorovány dva specifické píky blízko 10 min a 12 min. Kromě toho byl pozorován malý pík v blízkosti 18 minut retenčního času, což je velmi důležité pro sledování produktů T65, které se uvolňují v čase.

Obrázek 12 představuje řízené vydání udržitelného testu T65 embedded SBA-15 od 0 do 3 dnů. Specifický pík T65 byl viditelný v blízkosti 15 a 20 min od 0. do 3. dne. Surové produkty T65 byly řádně ponořeny a byly postupně vylučovány v průběhu času. Kromě toho mezoporézní materiály oxidu křemičitého (SBA-15) navrhované v této studii mohly nést fyziologicky aktivní látky v surovém produktu T65 a potvrdily, že fyziologicky aktivní látky byly po naložení uvolňovány způsobem postupného uvolňování. Kromě toho by mezoporézní materiál oxidu křemičitého navrhovaný v této studii mohl být v budoucnu použit jako dobrý nosič pro impregnaci různých funkčních materiálů a jako materiál s prodlouženým uvolňováním podporou různých fyziologicky aktivních látek.

4. závěr

Sekundární bioaktivní materiály extrahované z půdních mikroorganismů jsou zajímavé pro kosmetické aplikace díky jejich antimikrobiálním, antioxidačním, protivráskovým, bělícím a antimikrobiálním aktivitám. Tato studie popisuje novou aktivitu ethylacetátového extraktu kultury kmene T65 na funkční složky v kosmetických přípravcích. Surový produkt T65 byl netoxický pro různé buněčné linie, jako jsou HaCaT (lidské keratinocyty), RAW264.7 (buňky makrofágů), CCD-986Sk (buněčné fibroblasty lidské kůže) a melanomové buňky B16F1 a B16F10 . Surový produkt T65 navíc vykazoval zvýšenou regulaci syntézy kolagenu typu I, což je velmi důležité pro redukci vrásek na kůži. Kromě toho surový produkt T65 dostatečně inhiboval lidské patogenní bakterie, jako jsou B. subtilis, E. coli, P. acnes, S. aureus a S. epidermidis, což může pomoci zabránit zkažení kosmetického přípravku a kolonizaci patogenních bakterií. tvořící akné vulgaris na lidské kůži. Kromě toho surový produkt T65 inhiboval houbovou tyrosinázu pro bělící účinek a prasečí pankreatickou elastázu pro anti-aging aktivity a inhiboval NO a vychytávané DPPH radikály pro antioxidační aktivity. Syntéza mezoporézních částic oxidu křemičitého, SBA-15, prokázala, že surový produkt T65 by byl účinný v kosmetických přípravcích s účinnými vlastnostmi řízeného uvolňování. Nakonec in vivo aplikace formulovaného kosmetického přípravku spolu se surovým produktem T65 na obličeje dobrovolníků prokázala bělící a protivráskový účinek T65. Zbývá však objevit chemii různých bioaktivních sloučenin a molekulární mechanismy související s různými aktivitami inhibice enzymů a inhibice patogenů. Závěrem lze říci, že naše studie silně podpořila myšlenku, že do lokálně aplikovaných kosmetických produktů lze přidat bakteriální zdroje pro bělící účinek, tvorbu vrásek, antioxidační účinek a antimikrobiální účinky.

cistanche pharma special

Další podrobnosti získáte kliknutím sem.