Stanovení echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche Herba pomocí HPLC

XU Shanshan1 ,WU Kangyu2 ,TU Xingming2 （1. Třetí klinická lékařská fakulta Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405 Guangdong, Čína; 2. Třetí přidružená nemocnice Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510378 Guangdong,Čína） 

Abstraktní: Objektivní Pro stanovení byla zavedena metoda HPLCEchinakosidve vodním extraktu CIstanche deserticola. MetodyEchinakosid byl stanoven pomocí HPLC. Separace byla provedena na Inertsil ODSSP C18 kolona s mobilní fází sestávala z acetonitrilu（A）a 0,4% roztok kyseliny fosforečné（B）,gradientovou elucí. Detekční vlnová délka byla nastavena na 333 nm,a teplota kolony byla 30 stupně. Průtok byl 1,0 ml.min-1 a injekční objem byl 10 ul.VýsledekLineární vztah echinakosidu v rozsahu koncentrací 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 byl dobrý（r = 0.999 8）. Návratnost byla 94,59 procenta -105,31 procenta（RSD= 2,93 procenta,n = 9）. Obsah echinakosidu ve vodních extraktech Cistanche herba byl 15,527,7.347,12,267 mg.g-1 . 

Závěr: Zavedená metoda HPLC s dobrou opakovatelností je přesná,jednoduché a proveditelné. Je vhodný pro stanovení echinakosidu ve vodním extraktu zCistanche deserticola ma. 

Klíčová slova:HPLC;vodní extrakt zCistanche deserticola;Echinakosid;určení obsahu

Cistanche deserticolaje tonikum běžně používané v tradiční čínské medicíně v klinické praxi a má pověst „pouštní ženšen". Cistanche deserticola zahrnutá do vydání čínského lékopisu z roku 2015 je sušená, šupinatá, masitá nať rostliny Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma nebo Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Má hřejivou povahu, sladkoslanou chuť, patří do meridiánů ledvin a tlustého střeva. Má účinky tonizace jangu ledvin, prospívá esenci a krvi, zvlhčuje střeva a zmírňuje zácpu [2]. 

Pouštní ženšen

"Shennong Materia Medica Classic" uvádí, že dokáže "vyživovat střed, vyživovat pět vnitřních orgánů a posilovat jin a vyživovat podstatu.".Cistanche deserticola obsahuje především fenylethanoidní glykosidy, iridoidy a glykosidy, lignany a glykosidy, polysacharidy, estery a alkaloidy [3].Fenylethanolové glykosidyjsou hlavními aktivními složkamiCistanche deserticola, mezi nimiž jsou echinacea a bazénové indikační složky pro identifikaci a stanovení obsahu Cistanche deserticola v čínském lékopisu. 

Fenylethanolglykosid je hlavní aktivní složkou Cistanche deserticola

Farmakologické studie [4] to ukazují Cistanche deserticolamá různé farmakologické účinky, jako je zvlhčení střev a zmírnění zácpy, ochrana jater, odolnost proti osteoporóze, antioxidační, proti stárnutí a proti únavě. Vodný extrakt zCistanche deserticolamůže podporovat kostní morfogenetický protein 2 geny osteoblastů u potkanů, stejně jako tartrát-rezistentní kyselou fosfatázu a osteokalcin v séru myší po ovariektomii, stejně jako geny Smad1 a Smad5 a transformační růstové faktory v kostní dřeni- Exprese atd.účinek proti osteoporóze [5-6]. Echinosid může podporovat proliferaci osteoblastů a podporovat diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně na osteoblasty in vitro[7-9]. 

Echinosid, hlavní chemická složka Cistanche deserticola

Kliknutím sem zobrazíte produkty Natural Cistanche Echinacoside

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

V posledních letech se objevilo mnoho zpráv o stanovení obsahu echinacosidu a u bazénu v alkoholovém extraktu z Cistanche deserticola a jejích složených přípravcích [10-12], ale existuje jen málo zpráv o stanovení obsahu indikátorové složky ve vodním extraktu z Cistanche deserticola. V této studii byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ke stanovení obsahu echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche deserticola.

1. Materiál

1.1 Zařízení

LC-20AT vysokoúčinná kapalinová chromatografie, SPD-20detektor, SIL-20automatický vzorkovač, CTO-10ASvp teplota kolony, pracovní stanice kapalinové chromatografie LCsolution, Shimadzu Corporation z Japonska; MES125P-OCE-DU elektronické analytické váhy, Sartorius, Německo; SHZ-D (III) cirkulační vodní víceúčelová vakuová pumpa, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 rotační výparník chladicí cirkulační systém, RV10DS96 rotační výparník, IKA, Německo; DK-S26 elektrická termostatická vodní lázeň, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; Stroj na ultra čistou vodu řady UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Léčivé materiály a činidla

Meat Rong léčivý materiál, zakoupený od Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., číslo šarže: 18010011806001, 181001. Sušené, šupinaté, masité stonky rostliny Leobaceae Cistanche deserticola identifikované hlavním čínským bylinkářem Třetím Tu Xingingingem Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine jsou uloženy v drogové inspekční místnosti Třetí přidružené nemocnice Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine; Echinoside referenční látka, obsah 89,7 procenta, Čínský institut pro kontrolu potravin a léčiv, číslo šarže: 111670-201706; Acetonitril je chromatograficky čistý (Merck, Německo); Methanol a kyselina fosforečná jsou analyticky čisté (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Voda je ultra čistá voda.

2. Metody a výsledky

2.1 Příprava vodního extraktu z Cistanche deserticola

Vezměte sicistanche prášek, přidejte 10násobek množství destilované vody, zahřejte a pod zpětným chladičem dvakrát extrahujte, pokaždé po dobu 1 hodiny. Filtrujte, spojte filtrát a použijte rotační odparku ke koncentraci filtrátu na obsah surového léčiva 0,100 g · ml-1. Skladujte při 4 stupních pro pohotovostní režim. 2.2 Chromatografické podmínky a vhodnost systému Chromatografická kolona: kolona InertsilODS SPC18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm）; Mobilní fáze: acetonitril (A) - 0,4% roztok kyseliny fosforečné (B), gradientová eluce: 0~ 5 minut, 17 procent A; 5 ~ 25 minut, 20 procent A; 25 ~ 30 minut, 17 procent A; Vlnová délka detekce: 333 nm; Teplota kolony: 30 stupňů; Průtok: 1,0 ml · min-1; Objem vstřiku: 10 μ L. Za těchto chromatografických podmínek je rozlišení mezi píky echinacey a sousedními složkami větší než 1,5 a teoretický počet kolon by pro píky echinacey neměl být menší než 4000. Chromatogram je znázorněn na obrázku 1.

Obrázek 1 HPLC chromatogramy echinakosidu (A) a vodního extraktu z Cistanche herba (B)

2.3 Příprava roztoku

2.3.1 Referenční roztok

Navažte přiměřené množstvíEchinacetinreferenční látku, přesně ji zvažte, vložte do 10ml odměrné baňky, přidejte methanol, aby se rozpustil, a připravte, aby obsahovala 898,794 echinacetinu na mililitr μg referenčního roztoku, skladovaného při 4 stupních pro pohotovostní režim.

Echinoside z Cistanche deserticola

2.3.2 Zkušební roztok

Přesně odměřte 2.0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odpařte ve vodní lázni, rozpusťte v methanolu, doplňte do konstantního objemu v 10 ml odměrné baňce, dobře protřepejte, 0,22 μM mikroporézní membránová filtrace, jmenovitě.

2.4 Zkoumání lineárního vztahu

Přesně změřte {{0}},25, 0,50, 1.00, 2.00, 2,50, a 3.00 ml referenčního roztoku podle 2.3.1 a umístěte je do 5ml odměrné baňky, přidejte methanol do konstantního objemu a dobře protřepejte, abyste získali gradientové koncentrace 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176, 449,3970 a 539,2764 μG · mL-1 referenčního roztoku, 0,22 μM Mikroporézní membránová filtrace. Proveďte stanovení podle chromatografických podmínek v 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Použitím hmotnostní koncentrace referenční látky jako úsečky (X, μG · ml-1) je plocha píku ordináta (Y) a získá se rovnice lineární regrese: Y=13185. 0X-32273.0, r=0,9998. Výsledky ukázaly, že echinacea se pohybovala od 44,9397 do 539,2764 μ Lineární vztah v rozmezí koncentrací g · ml-1 je dobrý.

2.5 Zkouška přesnosti

Vezměte 539,2764 μ G · mL-1 referenčního roztoku, kontinuálně 6x vstřikujte vzorek podle chromatografických podmínek v 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Výsledky RSD oblasti vrcholu echinacey bylo 1,81 procenta, což ukazuje na dobrou přesnost přístroje.

2.6 Test stability

Přesně odměřte 2,{1}} mlCistanche deserticolavodný extrakt, odpařit do sucha ve vodní lázni, rozpustit v methanolu, uvést do konstantního objemu v 10ml odměrné baňce, dobře protřepat, 0.22 μ Filtr s mikroporézní membránou, vstříknout vzorky pro stanovení po 0, 2, 4, 8, 12 a 24 hodinách podle chromatografických podmínek v 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Výsledky RSD oblasti píku echinacey bylo 1,16 procenta, což ukazuje, že testovaný roztok měl dobrou stabilitu během 24 hodin.

2.7 Zkouška opakovatelnosti

Přesně odměřte 6 porcí 2,{2}} ml vodyextrakt z Cistanche deserticolaPřipravte 6 dávek zkušebního roztoku paralelně podle metody popsané v 2.3.2, nastříkněte vzorky pro stanovení podle chromatografických podmínek popsaných v 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Výsledky RSD hmotnostní koncentrace echinacey byla 1,28 procenta, což ukazuje, že metoda měla dobrou opakovatelnost.

Experiment Cistanche deserticola

2.8 Test obnovy přidání vzorku

Přesně odměřte 9 porcí z 1,{2}} mlCistanche deserticolavodný extrakt, přidejte {{0}}.8, 1.0 a 1,2 ml referenčního roztoku (101,552 mg · ml - 1), odpařte ve vodní lázni, rozpusťte v methanol a doplňte na objem v ml odměrné baňce; Dobře protřepejte, 0,22 μ Filtr s mikroporézní filtrační membránou pro přípravu testovacího roztoku s vysokou, střední a nízkou koncentrací. Připravte paralelně 3 díly každé koncentrace, změřte podle chromatografických podmínek v 2.2, zaznamenejte plochu píku a vypočítejte zotavení ze závislosti na vzorku. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

2.9 Stanovení obsahu vzorku

Přesně odměřte 3 porce ze 2.0mlvodní extrakt z Cistanche deserticola, odpařit do sucha na vodní lázni, rozpustit v methanolu, dovést do konstantního objemu v 10ml odměrné baňce, dobře protřepat, 0,22 μ Filtr s mikroporézní membránou, měřit podle chromatografických podmínek v 2.2, zaznamenejte plochu píku a vypočítejte obsah echinacey. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 1 Výsledky testů výtěžnosti echinakosidu

Tabulka 2 Výsledky stanovení obsahu echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche herba

3.Diskuse

3.1 Způsob přípravy zkušebního předmětu

Vodný extrakt zCistanche deserticolaobsahuje různé chemické složky, jako jsou fenylethanolglykosidy a polysacharidy, které způsobují určitou interferenci s testovanými složkami. Tato studie zkoumala dvě různé koncentrace rozpouštědel, 50 procent methanolu a methanolu. Výsledky ukázaly, že separační efekt píku v chromatogramu testovaného produktu za použití 50% methanolu jako rozpouštědla byl špatný mezi echinaceou a sousedními složkami; Při použití methanolu jako rozpouštědla je rozlišení píku glykosidu echinacey dobré a nedochází k interferenci s jinými píky nečistot. Proto byl jako rozpouštědlo pro testovací roztok zvolen methanol. Za použití methanolu jako rozpouštědla byl vodní extrakt z Cistanche deserticola odpařen do sucha ve vodní lázni. Byly použity dvě metody zpracování: rozpouštění methanolu, třepání s konstantním objemem a rozpouštění methanolu ultrazvukem (10 minut). Výsledky ukázaly, že mezi oběma metodami nebyl žádný významný rozdíl. Tato metoda byla zvolena pro přípravu testovacího roztoku z důvodu jednoduché operace rozpouštění methanolu a konstantního objemového třepání.

Čínská bylina cistanche

3.2 Výběr mobilní fáze

V této studii se odkazovalo na mobilní fázi (metanol-0,1% kyselina mravenčí) používanou pro stanovení obsahu Cistanche deserticola v Čínském lékopisu (svazek I) (2015). Výsledky ukázaly, že se pík echinaceového glykosidu rozšířil a došlo k fenoménu náběžné hrany, který může souviset se slabou eluční schopností mobilní fáze; S odkazem na příslušnou literaturu [12-13] byl jako mobilní fáze použit acetonitril-0,5% kyselina octová, ale vrcholový tvar echinacey byl špatný a docházelo k jevu ochlazení. Vzhledem k hodnotě pH mobilní fáze byl nakonec jako mobilní fáze použit acetonitril-0,4% kyselina fosforečná. V důsledku toho byl teoretický počet píků echinacey vyšší než 4000 a rozlišení mezi píky echinacey a sousedních složek bylo vyšší než 1,5. Tvar píku byl symetrický, bez interference s píky nečistot a základní linie byla stabilní. Proto byl v této studii jako chromatografická mobilní fáze pro stanovení obsahu echinacey použit acetonitril - 0,4% kyselina fosforečná. V této studii,ke stanovení Echinacea ve vodném extraktu Cistanche deserticola byla použita metoda HPLC.

Prášek z extraktu cistanche

Metoda je jednoduchá, přesná a reprodukovatelná. Je vhodný pro stanovení echinacey ve vodném extraktu cistanche deserticola a lze jej použít jako metodu kontroly kvality vodného extraktu cistanche deserticola.Tato studie pouze stanovila obsah echinacey ve vodním extraktu z Cistanche deserticola.V budoucnu,plánuje se stanovení obsahu echinacey ve složeném odvaru z Cistanche deserticola za účelem prozkoumání vlivu různých faktorů na obsah echinacey, což poskytne referenci pro kontrolu kvality odvaru obsahujícího Cistanche deserticola.

odkaz:

[1] Zhong Ping Desert ginseng and cistanche [J] Forest and Human Beings, 2004, 24 (11): 25

[2] Lékopis Národní lékopisné komise Čínské lidové republiky (část I) [M] Peking: China Medical Science and Technology Press, 2015:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei, et al Pokrok ve výzkumu ve studii Cistanche deserticola [J] Drug Evaluation Study, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Fang Jian Advances in pharmacological research on Cistanche deserticola [J] Guangming Traditional Chinese Medicine, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Vliv vodného extraktu z cistanche deserticola na expresi kostního morfogenetického proteinu 2 genu v krysích osteoblastech [J] China AnimalChov a veterinární lékařství, 2013, 40 (1): 17-21

[6] LIANG H,YU F,TONG Z,et al. Vodný extrakt cistanches herba ovlivňující hladiny exprese BGP a TRAP v séru a Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA a TIEG1 mRNA kostní dřeně u osteoporózy[J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40 （2）:757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming a kol. Pozorování echinosidu podporujícího proliferaci krysích osteoblastů aktivací ERK/BMP-2 Signal Pathway [J] Grassroots Medical Forum, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Studie Tian Yuan o diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně na osteoblasty indukované echinasidem a jeho mechanismem [D] Shenyang: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan atd. Studie o echinosidem indukované diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně na osteoblasty [J] Farmakologie a klinika tradiční čínské medicíny, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie, et al Stanovení echinosidu a pilosidu v mikroprášku Cistanche deserticola pomocí HPLC [J] Anhui Agricultural University, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun, a kol. : 609-613

[12] Xu Xiaoxue Farmakodynamické a metabonomické studie účinků Cistanche deserticola proti osteoporóze a jejích účinných složek [D] Yinchuan: Ningxia Medical University, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan a kol. Stanovení echinosidu a pilosidu v orální kapalině Qirong Runchang pomocí vysoce výkonné kapalinové chromatografie [J] Journal of Xinjiang Medical University, 2018, 41 (7): 886-888892