Současné klinické aplikace in vivo genové terapie s AAV část 3

GAN

GAN je autozomálně recesivní neurodegenerativní porucha centrálního a periferního nervového systému, která se typicky projevuje progresivní slabostí a ataxií. Jedinci také trpí ztrátou smyslů a ztrátou chůze a podlehnou respiračnímu selhání.62

Recesivní dědičnost a paměť jsou dvě témata, která, jak se zdá, nemají přímou souvislost, ale existuje mezi nimi úzký vztah. Recesivní dědičnost se týká fenoménu genetické dědičnosti, který existuje v genomu, ale nezpůsobuje zjevné fenotypové změny. Paměť se týká schopnosti lidí získávat, ukládat a získávat informace během kognitivních procesů. Jak tedy tato dvě témata souvisí?

Za prvé, recesivní dědičnost a paměť jsou oba produkty nervového systému. V našem mozku jsou desítky miliard neuronů, které přenášejí informace přes pregangliovou substantia nigra a synapse. Spojení mezi neurony a účinnost přenosu synapsí jsou ovlivněny geny. Proto můžeme říci, že vývoj a funkce nervového systému je mostem mezi recesivní dědičností a pamětí.

Za druhé, recesivní dědičnost a paměť mají také vzájemný vliv. Některé studie ukázaly, že genové variace mohou ovlivnit výkonnost paměti. Například ztráta nebo mutace určitých genů může ovlivnit tvorbu a stabilitu synapsí v mozku, a tím ovlivnit paměť lidí. Trénink paměti přitom může ovlivnit i recesivní dědičnost. Některé experimenty ukázaly, že za určitých okolností může plasticita paměti ovlivnit expresi a mutaci konkrétních genů, a tím změnit fenotypové vlastnosti jednotlivých potomků.

Konečně lze změnit a zlepšit jak recesivní dědičnost, tak paměť. Přestože nemůžeme změnit svůj genom, můžeme si zlepšit paměť vytvořením příznivého prostředí a praxí. Paměť může zlepšit například zdravý životní styl, dobrý spánek a kognitivní trénink. Podobně lze k léčbě a zlepšení stavů souvisejících s recesivní dědičností použít i některé nové technologie a léčby, jako je genová editace a genová terapie.

Stručně řečeno, existuje úzký vztah mezi recesivní dědičností a pamětí. I když nemůžeme zcela ovládat svou genetickou dědičnost, můžeme změnit a zlepšit svou paměť vytvořením příznivého prostředí a praxí, což je také něco, co bychom měli mít pozitivní. Je vidět, že potřebujeme zlepšit naši paměť a Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche může také regulovat rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů, které jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může Cistanche také zlepšit průtok krve a podporovat dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek získá adekvátní výživu a energii, a tím zlepší mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klikněte na vědět doplňky pro zlepšení paměti

Na základě neuropatologických studií dochází ke ztrátě exprese gigatonů, která postihuje kůru mozečku, mozkový kmen a zadní sloupce míchy, což z ní činí ideální kandidátní poruchu pro intratekální přenos genu AAV9 (přehled Bailey et al.63).

Gigaxonin je nutný k organizování a degradaci intermediárních filament a vede k zvětšeným axonům s hustě svázanými intermediárními filamenty (přehled Bailey et al.63).

V National Institutes ofHealth (NIH; ClinicalTrials.gov: NCT02362438) probíhá fáze 1 studie eskalace dávky intratekálního AAV9/GAN.

Výhled do budoucnosti

Téměř 2 desetiletí po počátečních studiích intracerebrálního genového přenosu pomocí AAV2 se metody přenosu genů do CNS značně rozšířily. Je-li požadován fokální přenos genů, jako například u PD a AADC, lze pomocí vektorů AAV2 dosáhnout přesnějšího přenosu genu do většího objemu mozkové tkáně za použití metod, jako je dodání se zesílenou konvekcí řízenou MRI.64–66

Většina poruch CNS by však ideálně vyžadovala široký a účinný přenos genů do celého CNS. Objev novějších AAV kapsid, jako je AAV9, umožnil mnohem širší stupeň přenosu genu než vícenásobné stereotaxické injekce.9,10,67–69 Kromě četných studií na zvířecích modelech byla aplikace AAV9 prokázána v klinických studiích po intratekální injekci (jako u GAN) nebo nitrožilní injekcí (jako u SMA13).

Předpokládá se, že použití AAV9 nebo podobných AAV kapsid brzy rozšíří aplikaci genové terapie na více poruch CNS. Zatímco však AAV9 značně rozšířil schopnost léčit větší počet poruch CNS, stále se zaměřuje na menšinu buněk v celém mozku.70

Do budoucna by novější generace AAV kapsid s vyšší účinností cílení na CNS zvýšila účinnost léčby genové terapie zaměřené na CNS a také by rozšířila počet onemocnění, která by mohla být potenciálně léčena genovou terapií.

Klinická in vivo genová terapie očních poruch

Genová terapie získala své místo v běžné lékařské praxi poté, co FDA schválila Luxturna, což je AAV{0}}léčba retinálního pigmentového epitelu (RPE)65-LCA (LCA2) založená na AAV (IRD).

Tento úspěch byl založen na desetiletích práce mnoha skupin, z nichž jedna pokračovala v komercializaci produktu.71–76 U léčených pacientů došlo ke zlepšení citlivosti na světlo a vizuálně řízeného chování, která změnila život.

Podrobné souhrny biologie RPE65, preklinických studií na zvířecích modelech a léčby LCA2 genovou terapií více skupinami jsou již publikovány.77,78

Dramatický úspěch tohoto programu katalyzoval akademickou sféru i průmysl k vytvoření důkazu konceptu, že genová terapie by mohla obnovit nebo zachovat vidění na zvířecích modelech jiných onemocnění sítnice, včetně, ale bez omezení na ně, AMD, choroideremie, ACHM, retinitis pigmentosa a XLRS.79– 85

Je však zajímavé, že tyto předklinické úspěchy se konzistentně nepřenesly do tak silných klinických výsledků, jako byly pozorovány u pacientů s LCA2.86–92 I když důvody tohoto rozporu dosud nebyly plně objasněny, nedostatečná exprese transgenu zprostředkovaná AAV v cílových buňkách a/nebo imunitní odpověď pravděpodobně hrála roli.

Budoucí úspěch v oblasti genové terapie sítnice a v širší oblasti genové terapie bude záviset na identifikaci proveditelných rozsahů terapeutických dávek, které jsou založeny na prokázané schopnosti (1) zacílit vhodný typ buněk v sítnici primátů a (2) řídit dostatečnou úroveň terapeutické exprese transgenu. . Zatímco k tropismu AAV, účinnosti transdukce a související imunitní odpovědi v sítnici přispívá mnoho faktorů, cesta podání je obzvláště kritická. Shrnutí současných a vyvíjejících se přístupů, jejich výhody a nevýhody a relevantní klinické příklady jsou diskutovány níže.

Subretinální injekce (SRI)

SRI se používá ve většině klinických studií, protože umožňuje umístění terapeutika in situ (v chirurgicky vytvořeném prostoru mezi fotoreceptory (PR) a RPE označovaném jako subretinální "puchýřka").

Většina IRD je způsobena mutacemi v PR-specifických genech. Kromě své blízkosti k nejběžnějším klinickým cílovým buňkám (tj. RPE a PR) je SRI atraktivní díky imunitní výsadě tohoto kompartmentu. Na rozdíl od systémově podávaných AAV vyvolávají subretinálně podávané vektory relativně sníženou imunitní odpověď jako na imunitní odchylku spojenou s přední komorou (ACAID).93,94

SRI je však náročná technika, popisovaná jako „téměř subspecialita sama pro sebe.“95 Vyžaduje vitrektomii (odstranění sklivce) a retinotomii (průchod jehly přes sítnici), což může být spojeno s komplikacemi, jako jsou trhliny sítnice , progrese katarakty nebo krvácení do sítnice/choroidey.96

Vytvoření subretinálního váčku vyžaduje oddělení sítnice od podkladové RPE. Fovea výlučně Thecone je obzvláště citlivá na oddělení. SRI vektoru pod foveou některých pacientů s LCA2 vedlo k centrálnímu ztenčení sítnice a ztrátě zrakové ostrosti.75

Podobné snížení tloušťky sítnice bylo pozorováno u pacientů s choroideremií.96 Chirurgická technika subretinální genové terapie je předurčena po zavedených subretinálních postupech, jako je injekce aktivátoru plasminogenu do subretinální tkáně (tPA) pro subretinální krvácení spojené s neovaskulární AMD.96

Je však třeba vzít v úvahu specifické úvahy pro přizpůsobení techniky konkrétním charakteristikám struktury sítnice přítomné v IRD. Vitreoretinální chirurgové dobře obeznámení se subretinální genovou terapií uvedli užitečnost intraoperační optické koherentní tomografie (OCT), která umožňuje in vivo zpětnou vazbu v reálném čase během chirurgických případů.97

Vytvoření subretinální blány pomocí mikrojehly (typicky 38- až 41-měřidlo, s teflonovou špičkou, buď prodloužitelné nebo neprodloužitelné, kanyla, která se umístí přes trokar apars plana) je náročná a kritická krok v postupu.98

Krok penetrace jehlou má malou chybovost: příliš hluboká penetrace hrotu jehly může mít za následek krvácení, obstrukci hrotu kanyly, neúmyslné suprachoroidální podání vektoru nebo trvalé poranění RPE; příliš mělká penetrace jehly však může způsobit retinoschízu intraretinální hydratací během tvorby puchýřků.97

Někteří chirurgové vytvoří před injekcí vektoru do tohoto prostoru „předpuchýř“ vyrobený s vyváženým solným roztokem (BSS), který může zabránit ztrátě vektoru do sklivce během tvorby váčku.

Další chirurgickou úvahou je inherentní obtížnost jednotného a přesného dodávání objemu spojená se současnou metodou transverzálního subretinálního dodávání.

Objem vektoru může být ovlivněn použitím BSS pre-puchýřku, ztrátou vektoru z výstupu sklivce z místa retinotomie a neúplným dodáním objemu cílového vektoru z důvodu uvážení chirurga (obavy o foveální protahování nebo tvorbu makulární díry nebo jiné bezpečnostní úvahy).

V klinických studiích, kde se rozhodnutí o eskalaci dávky činí s malým počtem subjektů, může být náročné učinit vhodná rozhodnutí o bezpečnosti nebo účinnosti, pokud nelze u všech pacientů dosáhnout potvrzení přesného a jednotného dodání objemu vektoru.

Je také důležité poznamenat, že i přes své relativní imunitní privilegium jsou AAV vektory stále schopny dosáhnout úrovně nepříznivého účinku a vyvolat reakce hostitelské buňky v subretinálním prostoru.

Ve fázi I/II klinických studií pro RPE65-LCA na University College London (ClinicalTrials.gov: NCT00643747) byl zaznamenán zánět oka po SRI 1 1012 vg AAV2-RPE65.71,99

Ve studii University of Pennsylvania/University of Florida nebyl zaznamenán žádný zánět (ClinicalTrials.gov: NCT00481546). Ve studii NantesUniversity Hospital (ClinicalTrials.gov: NCT01496040), která zejména používala jinou kapsidu AAV (AAV4), byl zánět zaznamenán na 4,8 1010 vg.100 Ve studii Spark Therapeutics fáze III (ClinicalTrials.gov) byl zánět 99960 mírný pozorováno při 1,5 1011 vg.76,101 Významný zánět byl také pozorován při 1 1011 vg v klinických studiích pro choroideremii.90,102

Různé dávky, při kterých byl klinicky pozorován zánět, mohou být přisuzovány rozdílům v produkci a charakterizaci vektorů, AAV kapsidě a základním stavu onemocnění sítnice.

Protože se pozornost nyní přesunula na hodnocení genových terapií pro IRD, kde cílovými buňkami jsou PR, stojí za to zvážit vztah mezi množstvím produktu nahrazujícího gen a dávkováním vektoru.

Aby byla jakákoli genová terapie úspěšná, musí být dosaženo dostatečné terapeutické hladiny transgenní exprese (např. proteinu) v dávkách, které nezpůsobí nezvládnutelný zánět. V ideálním případě by měl existovat dostatečný rozsah mezi minimální účinnou dávkou na zvířecích modelech a NOAEL (hladina bez pozorovatelných nepříznivých účinků), aby bylo možné provést studii fáze I/II s eskalací dávky.

Logika diktuje, že IRD způsobené defekty v retinálních proteinech exprimovaných na relativně nízkých úrovních mohou být snadněji řešeny genovou terapií.

Srovnání předklinických nálezů na velkých zvířecích modelech IRD oproti klinickým výsledkům podporuje tento koncept, ačkoli publikované klinické výsledky zůstávají nedostačující. Předklinické studie sponzorované AGTC hodnotily AAVRPGR (retinitis pigmentosa regulátor GTPázy) u nemocného psího modelu RPGR X-linked retinitis pigmentosa (XLRP).103 Účinnost (zlepšení autofluorescence fundu) byla hlášena při dávkách tak nízkých, jako je 1,8 109 vg,103 a zánětu byl pozorován až po dávce 4,5 1011 vg.103 Biogen's 6-měsíční výsledky klinické studie fáze I/II fáze I/II byly prezentovány na letošním setkání ASGCT.

Uvádí zlepšení zorných polí u šesti léčených pacientů s XLRP, „výjimečné zlepšení zraku“ a „důkaz možné regenerace vnějšího segmentu“ u jednoho pacienta léčeného vysokou dávkou (5 1011 vg). Zvládnutelný zánět byl pozorován pouze u této skupiny s vysokou dávkou.

Zatímco dosud nebyla předložena/zveřejněna, tisková zpráva AGTC104 (datum přístupu 6-12-20) uvádí, že 9 ze 17 léčených pacientů zaznamenalo zlepšení vidění, měřeno mikroperimetrií a/nebo nejlépe korigovanou zrakovou ostrostí (BCVA) 3 měsíce po injekci. Toto zlepšení vykazovali pouze pacienti se submakulárními injekcemi.

Za 6 měsíců po injekci bylo zlepšení u těchto devíti pacientů stabilní. U čtyř z těchto pacientů (4/8 testovaných) došlo ke zlepšení zrakové citlivosti (tj. mikroperimetrie).

Proteomická analýza odhaluje přibližně 2, 000 molekuly RPGR na PR senzorické cilium (PSC), což z něj dělá 1 087. nejvíce obohacený protein v tyčinkách. (CNGB3) v adog modelu CNGB3 ACHM odhalil pouze mírné zlepšení funkce sítnice při 5 1010 vg a zánětu při 5 1011 vg.

Studie fáze I/II pro CNGB3 ACHM byly zahájeny v roce 2016 jak AGTC, tak MeiraGTx, ale klinické výsledky dosud nebyly prezentovány/publikovány. Cyklické nukleotidové hradlové kanály jsou vysoce exprimovány (61, 000 molekul na PSC), díky čemuž jsou mnohem hojnější než RPGR.105

Preklinické studie na ovčím modelu podjednotky alfa 3 kanálu s hradlovaným cyklickým nukleotidem (CNGA3) ACHM odhalily robustní zlepšení funkce sítnice při 1,8 1{7}}11 vg (nejnižší testovaná dávka) a zánět při 6,0 1011 vg.

Klinické studie fáze I/II provedené ve Fakultní nemocnici Tuebingen a Univerzitě Ludwiga Maximiliana v Mnichově (ClinicalTrials.gov: NCT02610582) léčily pacienty v následujících dávkách: 1 1010 vg, 5 1010 vg nebo1 1011 vg.91

Nebyl hlášen žádný nezvladatelný zánět a při všech dávkách bylo pozorováno mírné zlepšení zrakové ostrosti, kontrastní citlivosti a prahů chromatické diskriminace v souladu s biologickou aktivitou zprostředkovanou vektorem.92

Dávky potřebné k podání terapie v preklinických studiích byly vyšší u CNGA3-ACHM ve srovnání s RPGR-XLRP, ačkoli klinické výsledky CNGA3-ACHM naznačují, že IRD způsobené defekty ve vysoce exprimovaných genech mohou být stále úspěšné.

Některé IRD, jako je Usherův syndrom spojený s MYO7A a Stargardtova choroba spojená s ABCA{2}}, jsou způsobeny mutacemi genů, pro které jsou kódující sekvence příliš velké, aby se vešly do standardního vektoru AAV (kapacita balení 5 kb).

Lentivirus, který dokáže pojmout větší užitečné zatížení (9,7 kb), byl proto vybrán k řešení těchto IRD ve fázi I/II klinických studií, které začaly v roce 2011/2012. Dosud nebyly zveřejněny žádné zprávy o biologické aktivitě pro žádnou ze studií.

Má se za to, že je to přičítáno skutečnosti, že lentivirus špatně transdukuje postmitotické PR,106,107 cílovou buňku v USH1B i Stargardt. V současné době probíhají snahy několika skupin o vývoj duálních AAV vektorových platforem, které budou podporovat dodávání velkých genů do PR.108,109

Kromě monogenního onemocnění se AAV také používá k vektorizaci činidel antivaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) na sítnici prostřednictvím SRI, aby sloužila jako jednorázová léčba neovaskulární formy AMD (vlhká AMD).

To představuje potenciální zlepšení oproti standardním měsíčním intravitreálním injekcím (IVI) inhibitorů VEGF, které mohou trpět nízkou compliance. REGENXBIO nedávno dokončilo studii fáze I/IIa, ve které pacienti v pěti kohortách dostávali dávky AAV8-anti VEGF fab mezi 3 109 vg a 2,4 1011 vg na oko. Zvýšení hladiny proteinové exprese závislé na dávce bylo pozorováno po 1 měsíci pi

Nebyly zjištěny žádné nežádoucí účinky související s léčivem a žádné klinické příznaky imunitní odpovědi nebo očního zánětu souvisejícího s léčivem. Zatímco v kohortě 1 (3 109 vg/oko) nebo kohortě 2 (1 1010 vg/oko) nebyly zaznamenány žádné jasné známky zlepšení, pacienti v kohortě 3 (6 1010 vg/oko) vykazovali zlepšení průměrné BCVA a tloušťky centrální sítnice. 50 % pacientů v kohortě 3 zůstává bez injekce (tj. bez IVI inhibitorů VEGF) po dobu až 2 let po léčbě.

V poslední době výsledky kohorty 5 (2,5 1011 vg/oko) ukázaly, že 73 % pacientů zůstalo bez injekce po dobu nejméně 9 měsíců po léčbě. REGENXBIO plánuje upravit svůj přístup k doručování.

Jeho cílem je dodat AAV do subretinálního prostoru pomocí mikrokanyly, která přistupuje k sítnici posteriorně ze suprachoroidálního prostoru (viz část níže) a tím zvýšit dostupnost léčby (nevyžaduje vitrektomii/kompletní chirurgii). Další téma zájmu v oblasti genové terapie IRD je vyvíjející se analýza rizika a přínosu pro subretinální přístup.

Příkladem je, zda je vhodné oddělení fovey výlučně kužele pomocí SRI. U některých IRD charakterizovaných přítomností závažných funkčních deficitů navzdory zachování sítnice (např. GUCY2DLCA1) představuje SRI makuly atraktivní poměr rizika a přínosu. potenciál pro zisk, protože jejich zachovaná laminární architektura sítnice je činí (1) pravděpodobněji tolerovat chirurgické odchlípení fovey a (2) potenciálně lépe vnímat terapii.

To je v kontrastu s pacienty, kteří si zachovávají funkci čípku a mají aktivně degenerující sítnici (tj. retinitis pigmentosa). V druhém scénáři může SRI AAV schopných laterálního šíření za okraj odchlípení zprostředkovat terapeutické hladiny genové exprese ve foveálních čípcích a zároveň se vyhnout rizikům spojeným s foveálním odchlípením.

Extra-foveální SRI takových vektorů (založené na AAV44.9) skutečně podpořilo 98% transdukci foveálních čípků u makaka bez nutnosti oddělit foveu během operace.112

Kromě toho mohou tyto nové vektory, které se šíří laterálně z injekčního puchýřku, také umožnit funkční zlepšení přes větší rozlohu sítnice.112 Navzdory chirurgické složitosti nabízí SRI mnoho výhod (robustní genová exprese ve vnějších buňkách sítnice, dodávání do relativně imunitního systému). privilegované místo, jeho prokázaný úspěch při řešení IRD a nové kapsidové technologie, které se zkoumají za účelem dalšího zvýšení jeho bezpečnosti) naznačují, že tento přístup bude ještě nějakou dobu používán.

For more information:1950477648nn@gmail.com