Laditelná kontrola úrovně genové exprese zprostředkovaná CRISPRi pomocí upravené RNA s jedním průvodcem v Escherichia Coli

ABSTRAKTNÍ

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-složit). Tyto sgRNA také umožnily modulární regulaci s různými cílovými sekvencemi DNA. Tento systém jsme použili k redistribuci metabolického toku za účelem produkce derivátů violaceinu v předvídatelném poměru a optimalizace produkce lykopenu. Tento systém by pomohl urychlit procesy optimalizace toku v metabolickém inženýrství a syntetické biologii.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ÚVOD

Klastrovaný pravidelně meziprostorový krátký palindromický repetice typu II (CRISPR) / CRISPR-asociovaný (Cas) systém je RNA řízený systém štěpení DNA složený z CRISPR RNA (crRNA), trans-aktivující CRISPR RNA (tracrRNA) a proteinu Cas9 (1 ,2). Cas9 ze Streptococcus pyogenes byl široce používán v genomovém inženýrství díky svým dobře charakterizovaným vlastnostem (3, 4). Komplex proteinu spCas9, tracrRNA a crRNA se váže a štěpí cílový DNA protospacer komplementární k 20 nukleotidové (nt) spacerové sekvenci crRNA v přítomnosti 5'-NGG-3} sousedního motivu protospaceru (PAM ) sekvence (5,6). Pro zjednodušení systému lze použít chimérickou single guide RNA (sgRNA), kde jsou crRNA a tracrRNA spojeny umělým linkerem zvaným tetraloop (5). Umožňuje nahradit dvě samostatné RNA jedinou molekulou RNA, díky čemuž je systém lépe ovladatelný. Jeden ze systémů na bázi CRISPR, interference CRISPR (CRISPRi), využívá katalyticky neaktivní Cas9 (dCas9) nahrazením určitých aminokyselin z každé endonukleázové domény (7). Tato modifikace vytváří ribonukleoproteinový (RNP) komplex, který může směrovat a vázat se na cílovou DNA a interferuje s RNA polymerázou (RNAP), aby inhiboval iniciaci nebo prodlužování transkripce (7). Na rozdíl od knockoutu systémem CRISPR/Cas9, CRISPR umožňuje reverzibilní knockdown genů expresí dCas9 nebo sgRNA pod indukovatelným promotorem, což umožňuje větší flexibilitu v genové regulaci (7). Systém CRISPRi účinně umlčel cílové geny stokrát (7,8). Cílově specifická genová represe umožňuje vysoce výkonné fenotypování pomocí sgRNA poolu pro celý genom (9) nebo přesměruje tok uhlíku v upravených bakteriích směrem k cílové chemické látce (10–12). Navíc, multiplex CRISPRi byl prokázán u různých hostitelů pomocí různých metod ke stabilní expresi více sgRNA, včetně dlouhých crRNA polí, integrace toehold switch a neopakujících se extralong sgRNA polí (13–16). Tyto techniky inhibice více genů současně byly využívány k provádění složitějších úkolů, jako je redukce toxických meziproduktů nebo blokování konkurenčních cest v bakteriální fermentaci (13,16–19). Úplná represe však není pro metabolické inženýrství vždy žádoucí. Hladiny genové exprese by měly být přesně kontrolovány, aby se dosáhlo optimální enzymové aktivity mezi růstovými a produkčními cestami, aby se vyrovnaly koncentrace intracelulárních prekurzorů a zabránilo se akumulaci toxických meziproduktů (20–22). Byly vyvinuty různé techniky pro vytvoření represivní účinnosti CRISPRi. Bylo manipulováno několik faktorů, jako je množství sgRNA a proteinu dCas9 nebo výběr sgRNA. Řízení exprese dCas9 nebo exprese dCas9 i sgRNA pomocí indukovatelného promotoru regulovalo expresi cílového genu více než 30-krát, respektive 300-krát (23,24). Bylo však pozorováno, že modulace koncentrace dCas9 může vést k nekonzistentní účinnosti represe u různých protospacerů (23). Omezený počet dostupných indukovatelných promotorů také navzdory mnoha snahám představuje problémy s designem (25). Další strategií je vložení ligandově specifického RNA aptameru do sgRNA, kde malá příbuzná molekula může vystavit spacer, a tím umožnit na dávce závislou kontrolu CRISPRi (26). Ligandově specifická sgRNA je užitečná, pokud je dostupný vhodný pár ligandu a aptameru. Vzdálenost od místa začátku transkripce a orientace vazby dCas9 také ovlivňují účinnost CRISPRi (7). Úprava vzdálenosti mezi vazebným místem sgRNA a místem počátku transkripce může optimalizovat cestu v metabolickém inženýrství (17,27,28). Účinnost hybridizace mezi sekvencemi spaceru a protospaceru také mění účinnost vazby komplexu RNP (29–31). Proto byly zavedeny neshody navržené mimo oblast semene ke změně volné energie, aby se diverzifikovala účinnost CRISPRi (31,32). Navrhování sgRNA je však vyžadováno pro každou novou cílovou sekvenci a dosažení významného rozdílu ve volné energii pouze prostřednictvím nesprávného párování může být náročné. Kromě toho existuje možnost zvýšené vazby mimo cíl (33). Nicméně je stále omezena na přesné potlačení více genových expresí modulárním způsobem bez ohledu na cílovou sekvenci. V této studii jsme vyvinuli laditelný systém CRISPRi, který reguluje genovou expresi s vysokou přesností a předvídatelností. Iterativním fluorescenčním tříděním buněk knihovny sgRNA zacílené na tetraloop a jeho přilehlou oblast jsme dosáhli účinnosti transkripční represe až 45-násobně i při změně cílové DNA. Tento systém umožňuje předvídatelnou redistribuci metabolického toku bez manipulace s hostitelským genomem nebo syntetickými cestami, což poskytuje slibný nástroj pro optimalizaci metabolických drah.

MATERIÁLY A METODY

Bakteriální kmeny, plazmidy a činidla

Kmeny a plazmidy Escherichia coli použité v této studii jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1. Primery použité v této studii jsou uvedeny v doplňkové tabulce S2. Klonovací postupy jsou popsány v doplňkových metodách. Cílové geny a jejich cílové sekvence DNA pro systém CRISPR jsou uvedeny v doplňkové tabulce S3. Mach1-T1R byl použit pro obecné klonování. Knihovna byla zkonstruována pomocí NEB 5-alfa Electrocompetent E. coli (NEB). Rutinní kultury pro konstrukci plazmidů a kmenů byly prováděny při 37°C v bujónu Luria-Bertani (LB) nebo na LB agarové plotně obsahující vhodná antibiotika (34 g/ml chloramfenikolu, 50g/ml spektinomycinu). PCR byla provedena pomocí Q5® High-Fidelity DNA polymerázy (NEB). Plazmidy a PCR produkty byly purifikovány pomocí GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit a Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology). Účinnost represe mutantů sgRNA Kultivační médium přes noc bylo obnoveno na OD600 0,05 a inkubováno, dokud nedosáhlo hodnoty mezi 0,6 a 0,8. Kultivační médium bylo poté zředěno na OD600 0,05 pomocí 20 ng/ml aTc a inkubováno po dobu 4 hodin. Fluorescence jedné kolonie byla měřena při 575 nm/616 nm pomocí čtečky mikrodestiček Hidex Sense (Hidex) a hodnota OD600 byla stanovena pomocí spektrofotometru Jenway 7300 (Jenway). Relativní fluorescence byla vypočtena jako jednotky fluorescence na hodnotu OD600, s hodnotou pro PC nastavenou na 100 %.

Účinky Cistanche tubulosa-léčí zácpu

screening knihovny sgRNA

Byla použita stejná kulturní metoda jako výše popsaná. Kultivační médium bylo naředěno na [buňka]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

Extrakce RNA

Celková RNA byla extrahována pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen) pouze tehdy, když miRNeasy Mini Kit (Qiagen) pro kvantifikaci sgRNA, po ošetření RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) a skladování při –80◦C. Během extrakčního procesu bylo provedeno štěpení DNA na koloně pomocí sady DNázy bez RNázy (Qiagen). DNA kontaminace byla ověřena pomocí PCR bez reverzní transkripce. Koncentrace a čistota každého vzorku byly stanoveny pomocí NanoDrop One (Thermo Scientific) a kvalita byla hodnocena pomocí DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) na LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

RT-qPCR analýza

Primery pro RT-qPCR pocházely buď z laboratorních zásob, nebo byly navrženy pomocí nástroje Primer3Plus (34) a jsou uvedeny v doplňkové tabulce S4. Gen CysG byl použit jako referenční gen (35) pro všechny experimenty RT-qPCR. Standardní křivka byla vytvořena 10-násobným zředěním šablony z 107 kopií/l na 10−1 kopií/l. Limit kvantifikace byl stanoven přizpůsobením počtu kopií a rychlosti pozitivní amplifikace esovité funkci a výpočtem hodnoty 95% pozitivního počtu kopií. Lineární dynamický rozsah byl definován jako nejnižší počet kopií, při kterém je zpětně vypočtená variace Cq menší než 35 %. Hodnoty Cq nad 30 nebo hodnoty neamplifikované v kontrole bez šablony byly validovány. Údaje standardní křivky jsou k dispozici v doplňkové tabulce S5 a doplňkovém obrázku S1. Celkem 2,5 ng celkové RNA bylo použito v 10 1 RT-qPCR reakci s Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). RT-PCR byla provedena v triplikátech na StepOnePlus™ RealTime PCR System (Applied Biosystems) s následujícími kroky: (i) reverzní transkripce při 55 °C po dobu 10 minut, následovaná denaturací při 95 °C po dobu 1 minuty; (ii) 40 tepelných cyklů při 95 °C po dobu 10 s a 60 °C po dobu 1 minuty; (iii) analýza křivky tání při 95 °C po dobu 15 s a 60 °C po dobu 1 minuty, následovaná nárůstem z 60 °C na 95 °C rychlostí 0,3 °C/min. Relativní kvantifikace RNA byla stanovena pomocí metody delta-deltaCt (36) a analyzována pomocí softwaru StepOnePlus™ (Applied Biosystems).

RNA-sekvenování (RNA-seq) a analýza dat

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 na základě FPKM (Fragmenty na kilobázi přepisů na milion mapovaných čtení). Diferenciálně exprimované geny byly získány z prahu 1,5 (na základě log{4}}) a 0,01 (hodnota q).

Výroba a odběr proviolaceinu a prodeoxyviolaceinu

Pro výrobu violaceinu a prodeoxyviolaceinu bylo použito následující složení média: 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4,1 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l kvasnicového extraktu a 1{{20}} g/l glukózy. Noční kultivační médium bylo obnoveno na OD600 0,1 a kultivováno, dokud OD600 nedosáhlo mezi 0,6 a 0,8. Kultivační médium bylo poté zředěno na OD600 0,1 a doplněno 500 ng/ml aTc, 0,05 mM IPTG a 0,1 g/l L-tryptofanu na konečný objem 5 ml. Odebralo se 300 ul kultivačního média a centrifugovalo se při 14 000 rpm po dobu 5 minut, aby se získala buněčná peleta pro HPLC analýzu, a 300 ul kultivačního média se odebralo pro extrakci RNA.

HPLC analýza

Pro analýzu biosyntetické dráhy violaceinu byla buněčná peleta resuspendována v {{0}}objemovém methanolu, sonikována po dobu 5 minut, centrifugována a filtrována přes 0.22-m nylonový filtr. HPLC analýza následovala metodu (42) s Poroshell 120 EC-C18, 4,6 x 150 mm, 4 m kolona (Agilent). Dvě mobilní fáze, A s 0,1% kyselinou mravenčí v DDW a B s 0,1% kyselinou mravenčí v acetonitrilu, byly použity při průtoku 0,6 ml/min s následujícím gradientovým profilem: 95% A po dobu 1,5 min, rampa A od 95 % na 2 % po dobu 4 minut, udržování 2 % A po dobu 2 minut, zvyšování A z 2 % na 95 % po dobu 30 s a udržování 95 % A po dobu 10 minut. Vzorky byly detekovány pomocí PDA detektoru a HPLC plocha byla stanovena při 600 nm pro violacein a 610 nm pro prodeoxyviolacein.

Výroba lykopenu a odběr vzorků

Pro výrobu lykopenu bylo použito následující složení média: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1g NaCl, 2 ml 1M MgSO4, 0,1 ml 1M CaCl2 a 4 g/l glukózy (22). Bylo použito 27 g/ml chloramfenikolu a 50 g/ml spektinomycinu. Noční kultivační médium bylo obnoveno na OD600 0,1 na konečný objem 5 ml. Když OD600 dosáhlo mezi 0,5 a 0,6, přidal se aTc do konečné koncentrace 500 ng/ml, a když OD600 dosáhl mezi 0,9 a 1, přidal se IPTG na konečnou koncentraci 0,02 mM. Lykopen byl extrahován pomocí acetonu, jak je popsáno v odkazu (22). Koncentrace lykopenu byla získána z absorbance při 475 nm pomocí spektrofotometru Jenway 7300 za použití standardní křivky. Pro extrakci RNA bylo odebráno 300 ul kultivačního média.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

VÝSLEDKY A DISKUSE

Účinky mutací v sgRNA na účinnost represe systému CRISPR

Systém CRISPRi může potlačit genovou expresi, když se ternární komplex dCas9–sgRNA–DNA silně váže. Předpokládali jsme, že účinnost represe systému CRISPRi by mohla být změněna na určitou úroveň modulací tvorby komplexu RNP. Abychom kvantifikovali účinnost represe systému CRISPR, navrhli jsme systém hlášení fluorescence založený na genetickém okruhu, kde je dCas9 z S. pyogenes indukován anhydrotetracyklinem (aTc) a jak reportérový gen (mCherry), tak varianty sgRNA jsou konstitutivně exprimovány (obr. 1A). Jakmile je aTc přidán do média, ternární komplex dCas9–sgRNA–DNA blokuje transkripci reportérového genu a hladina fluorescence nepřímo ukazuje účinnost represe systému CRISPR. SgRNA obsahuje celkem 96 nukleotidů (nts). Oblast spaceru (prvních 20 nt) se váže na cílovou sekvenci DNA a dalších 76 nt přispívá k tvorbě komplexu a stabilitě. Vzhledem k tomu, že neshody v oblasti spaceru mohou ztratit specifitu a zvýšit účinky mimo cíl v systému založeném na CRISPR (33, 43), maximální délka sgRNA, kterou lze zkonstruovat, je 76 nt. V tomto případě by měla být získána velikost knihovny 476 (přibližně 1045), ale je příliš velká na to, aby mohla být zkonstruována. Je tedy nutné zúžit velikost knihovny určením specifických pozic na sgRNA. Nejprve jsme zkoumali, jak mutace v sgRNA v každé oblasti ovlivňují represi v systému CRISPR. Předchozí studie uvedla, že mutace v kmenové smyčce 1 (sg mut01 a sg mut02) vedly k významnému snížení nukleázové aktivity Cas9, zatímco mutace v kmenové smyčce 2 (sg mut03) nebo kmenové smyčce 3 (sg mut04) neovlivnila jeho činnost (44). Rekonstruovaná sgRNA (sg mut05) obsahující mutace v oblasti stem–loop 1 a repeat, tetraloop, anti-repeat a stem–loop 2 rovněž snížila aktivitu nukleázy (44). V systému CRISPRi však všech pět variant sgRNA mělo malý vliv na účinnost represe ve srovnání s divokým typem sgRNA (sg WT), přičemž každá varianta vykazovala 2–4% hladinu fluorescence ve srovnání s pozitivní kontrolou bez oblasti spaceru ( sg PC) (obrázek 1B). Tyto výsledky naznačují, že tvorba komplexu dCas9–sgRNA je méně citlivá na modifikaci sekvence v oblasti stem–loop 1 v systému CRISPRi, na rozdíl od systému CRISPR/Cas9. Předpokládali jsme, že odstranění oblastí souvisejících se stabilitou komplexu může být výchozím bodem pro další kontrolu exprese na více úrovních. Za tímto účelem jsme zkonstruovali zkrácenou sgRNA (sg trcSL1) postrádající linker, stopku-smyčku 2 a stopku-smyčku 3. Tato zkrácená sgRNA má minimální počet komponent a bylo prokázáno, že významně snižuje aktivitu nukleázy v CRISPR/ Systém Cas9 (5,44). Při testování v systému CRISPRi vykazoval tento defektní mutant 8% hladinu fluorescence ve srovnání s sg PC, což naznačuje, že by se mohl stále vázat na dCas9 a potlačit požadovaný gen na určité úrovni i při snížené stabilitě ternárního komplexu (obrázek 1B). Strukturální analýza komplexu RNP naznačuje, že oblasti spojky, stonku-smyčky 2 a stonku-smyčky 3 sgRNA jsou zodpovědné za stabilizaci komplexu prostřednictvím svých interakcí s nukleázovou doménou dCas9, což vede k významnému snížení indelu. účinnost v systému CRISPR/Cas9 (44). Na rozdíl od toho, repetice: anti repeat region a stem-loop 1 sgRNA interagují hlavně s rozpoznávací doménou a PAM-interagující doménou dCas9 a významně neovlivňují účinnost indelu v systému CRISPR/Cas9 (44). Tento výsledek podporuje pozorování, že sg trcSL1 vykazoval významné snížení nukleázové aktivity v systému CRISPR/Cas9, zatímco vazebnou afinitu v systému CRISPRi ovlivnil jen mírně.

Obrázek 1. Konstrukce systému a vliv na účinnost represe mutací sgRNA. (A) Systém dvou plazmidů pro kvantifikaci účinnosti represe. Jeden plazmid s původem p15A obsahuje gen dCas9 pod aTc-indukovatelným promotorem a gen mCherry pod konstitutivním promotorem. Druhý plazmid s původem cloDF13 obsahuje sgRNA divokého typu nebo mutantní sgRNA pod konstitutivním promotorem. (B) Relativní fluorescence každého mutantu sgRNA (sg mut01 ∼ sg mut05 a sg trcSL1) a sg WT ve srovnání s sg PC. +1 až + 20 jsou sekvence spaceru, které se vážou na gen mCherry. sg PC: sgRNA bez spaceru jako pozitivní kontrola, sg WT: sgRNA divokého typu. Chybové úsečky označují standardní odchylku (n=3). P-hodnoty byly stanoveny nepárovým t-testem. ns: nevýznamné, **P< 0.01

Změna účinnosti tvorby komplexu pro víceúrovňovou kontrolu exprese

Tetraloop je umělý linker, který spojuje crRNA a tracrRNA v systému CRISPR-Cas9 (5). Krystalová struktura ternárního komplexu složeného z dCas9, crRNA a tracrRNA ukázala, že tetraloop a jeho 5 a 3 přilehlé oblasti mají malý kontakt s dCas9 (44). Současně jsou pro funkční komplex kritické oblasti repeat:anti-repeat a stem–loop 1 (44). Protože neinteraguje přímo s dCas9, byly tetraloop a jeho přilehlé oblasti prozkoumány jako potenciální místa pro inženýrství sgRNA s dalšími složkami, jako je začlenění sekvencí aptamerů pro rekrutování dalších proteinů do sgRNA (45, 46). Je pravděpodobné, že mutace v této oblasti by mohly diverzifikovat vazebnou afinitu mezi sgRNA a dCas9 bez úplného narušení komplexu. Byla zkonstruována 12- mer náhodná knihovna (4 nt z oblasti tetraloop a 4 nt z 5 a 3 přilehlých oblastí, v daném pořadí) s použitím sg trcSL1 jako templátu, aby se dále snížila efektivita tvorby komplexu mezi sgRNA a dCas9 (obrázek 2A ). Použili jsme dvoustupňovou strategii třídění, abychom získali různé mutanty sgRNA pokrývající účinnost represe mezi sg WT (plně represivní stav) a sg PC (nerepresivní stav). Původní knihovnu jsme rozdělili do menších knihoven s různými rozsahy intenzity fluorescence a poté jsme individuálně identifikovali fluorescenci každé varianty sgRNA z menší knihovny. Distribuce fluorescence původní knihovny získané průtokovou cytometrií byla téměř totožná s distribucí sg PC (obrázek 2B). Avšak po třech po sobě jdoucích krocích třídění měla každá knihovna (vysoká, střední a nízká) 63 %, 24 % a 14 % střední úrovně fluorescence ve srovnání s sg PC, v tomto pořadí (obrázek 2B). Z těchto menších knihoven bylo izolováno 82 kolonií s hladinami fluorescence v rozmezí od 8 % do 104 % (obrázek 2C). Tyto výsledky naznačují, že mutující tetraloop a jeho lemující oblast sgRNA může modulovat vazebnou afinitu mezi dCas9 a sgRNA pro různé účinnosti represe. Analýza kvantitativní PCR s reverzní transkripcí (RT-qPCR) 10 mutantů sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, doplňková tabulka S6) s různými fluorescenčními signály mezi sg WT a sg PC mezi 82 koloniemi sgRNA ukázala, že hladiny fluorescence se lineárně zvyšují se zvyšujícími se transkripty mCherry , což naznačuje, že náš systém CRISPRi řídí genovou expresi na transkripční úrovni (doplňkový obrázek S2). Náš laditelný systém CRISPRi využívá upravené sgRNA, které mohou dosáhnout až 45-násobné kontroly represe, což umožňuje jemné doladění účinnosti represe bez změny množství dCas9 nebo sgRNA. Pozoruhodnou výhodou našeho systému je, že dokáže doladit účinnost represe prostřednictvím specifických variant sgRNA bez potenciálu nezamýšlených následků, i když je vyžadováno další klonování. Navíc růstová křivka naznačuje, že náš systém nezpůsobuje významnou buněčnou zátěž (doplňkový obrázek S3). Kromě toho RNA-Seq na třech variantách sg trcSL1 s různou úrovní účinnosti represe ukázala, že exprese 51 až 83 genů byla změněna, na rozdíl od 262 genů změněných v sg WT (doplňkový obrázek S4). Tyto výsledky naznačují, že varianty sg trcSL1 měly ještě nižší off-target účinky než konvenční systém CRISPRi. Je zvláště relevantní v aplikacích metabolického inženýrství, kde optimalizace metabolických drah často zahrnuje manipulaci s více geny. Schopnost doladit genovou expresi bez způsobení negativních vedlejších účinků může výrazně urychlit proces optimalizace a zlepšit celkovou efektivitu a produktivitu systému.

Obrázek 2. Struktura knihovny sgRNA a screening knihovny. (A) skafold sgRNA použitý v této studii. 12-mer obsahující tetraloop a jeho přilehlou sekvenci je náhodně mutován z sg trcSL1 za účelem získání knihovny sgRNA. (B) Distribuce fluorescence získaná z průtokové cytometrie před (vlevo) a po (vpravo) třídění. Každá distribuce obsahuje 100,000 buněk. (C) Fluorescence jednotlivých kolonií získaných z (B). Chybové úsečky označují standardní odchylku (n=2).

Účinky množství dCas9 a sgRNA na účinnost represe

Protože modulace množství buď dCas9 nebo sgRNA by mohla změnit účinnost represe systému CRISPRi (23, 24), je nezbytné prozkoumat dopad množství dCas9 a sgRNA na účinnost represe. Testovali jsme výkon našeho systému za různých podmínek změnou množství dCas9 a sgRNA pomocí deseti sgRNA mutantů (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). Pro expresi dCas9 byly použity tři různé koncentrace (20, 100 a 500 ng/ml) induktoru. Ve srovnání s hladinou mRNA dCas9, když bylo použito 20 ng/ml induktoru, byla dále zvýšena 15-násobně (100 ng/ml) a 22-násobně (500 ng/ml) (doplňkový obrázek S5A ). Existují obavy z nadměrné exprese dCas9, protože vysoká hladina dCas9 by mohla být pro buňky toxická (47,48) nebo někdy ne (49). Rychlost růstu však byla snížena o méně než 10 %, když bylo použito až 500 ng/ml aTc, podle růstových křivek při různých koncentracích induktoru (doplňkový obrázek S6). To naznačuje, že množství dCas9 nemělo za testovaných podmínek toxický účinek na E. coli. Účinnost represe se nepatrně změnila, když bylo exprimováno různé množství dCas9 (obrázek 3A). Bylo v souladu s předchozí studií, že systém CRISPRi dosáhl maximální účinnosti represe při [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Obrázek 3. Charakterizace a modularita laditelného systému CRISPRi. (A) Relativní fluorescence při různých koncentracích aTc (20, 100 a 500 ng/ml). (B) Relativní fluorescence pod různými promotory (J23100 a UPJ23119). (C) Relativní fluorescence pod různými protospacery. Osa x ukazuje relativní fluorescenci mCherry a osa y ukazuje relativní fluorescenci lacI33-mCherry (červená) a araC33-mCherry (modrá). 33 bp dalších sekvencí z lacI a araC bylo přidáno na 5-konec mCherry (56). (D) Volná energie 12-meru a relativní fluorescence. Přerušované čáry označují 95% predikční interval a plné čáry označují regresní čáru. Hodnota dG sg trcSL1c2 nemohla být získána pomocí mFold, a proto byla vyloučena z analýzy. (A–D) Všechny chybové úsečky označují standardní odchylku (n=3).

Modularita laditelného systému CRISPRi

Náš přístup využívající specifické varianty sgRNA k udržení určité úrovně exprese pro cílovou DNA má potenciál být použit jako modulární systém. Abychom demonstrovali proveditelnost laditelného systému CRISPRi pro zacílení různých protospacerů, zkonstruovali jsme dva fúzní geny (lacI{{0}}mCherry a araC33-mCherry) přidáním 33 bps sekvencí z lacI a araC do 5 -konce mCherry (56). Genom E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) obsahuje dvě kopie sekvence protospacer pro lacI33- mCherry a jednu kopii pro araC33-mCherry. Tyto chromozomální sekvence však nemají sekvence PAM, a proto nemohou být cíleny komplexem dCas9-sgRNA (43). Když byly siRNA navrženy tak, aby cílily na každý protospacer, účinnost represe byla konzistentně udržována pro všechny protospacery z lacI33, araC33 a mCherry (obrázek 3C). Tato zjištění naznačují, že náš laditelný systém CRISPRi může účinně regulovat genovou expresi na určité úrovni bez ohledu na sekvenci protospaceru. Jedním z potenciálních vysvětlení pozorovaného vztahu mezi tvorbou komplexu RNP a účinností represe je změna volné energie, když se komplex tvoří. Umělý tetraloop linker a jeho přilehlá oblast obsahují dva páry bází A: U a G: C Watson-Crick a pár bází A: G non-Watson-Crick (44). Protože vazba crRNA a tracrRNA je klíčová pro tvorbu komplexu, mutace zacílené na tetraloop by ovlivnily vazebnou afinitu mezi dCas9 a sgRNA. Tuto afinitu lze vypočítat z rozdílu volné energie mezi ohraničeným a neohraničeným stavem. Výpočet volné energie vázaných stavů je však náročný (57). Předpokládali jsme, že celková struktura a stabilita ohraničeného stavu se nemění, protože sgRNA vytříděné z knihovny zcela nenarušily jeho funkci. Navíc, tetraloop a jeho přilehlá oblast mají malý kontakt s dCas9 (44). Vazebná afinita mezi dCas9 a sgRNA by tedy byla ovlivněna především stabilitou sekundární struktury tetraloop a její lemující sekvence. Na základě této myšlenky jsme vypočítali volnou energii tetraloopu a jeho přilehlých sekvencí pomocí formy (58). Rozdíl ve volné energii skládání v důsledku mutací je definován jako rozdíl mezi volnou energií mutovaných sekvencí a sekvencí divokého typu. Dalo by se přímo vypočítat z volné energie skládání mutantů, protože energie skládání sekvence divokého typu je konstantní –4,3 kcal/mol. Jak se volná energie skládání zvyšovala, zvyšoval se fluorescenční signál (obrázek 3D). Účinnost represe byla nejvyšší, když energie skládání oblasti obsahující tetraloop byla blízko nebo pod 0 kcal/mol a lineárně se snižovala, když energie skládání přesáhla 0 kcal/mol. Toto pozorování naznačuje, že účinnost tvorby komplexu mezi dCas9 a sgRNA je určena sekundární strukturou oblasti tetraloop, což pomáhá vysvětlit modularitu našeho systému. Pro další ověření tohoto vztahu byla měřena účinnost represe dalších 85 sgRNA s různými 12-merními sekvencemi z knihovny. Ukázala také korelaci pozorovanou z variant sg trcSL1 (obrázek 3D a doplňkovou tabulku S7), což naznačuje, že tetraloop linker hraje klíčovou roli při vytváření komplexu RNP a že mutace v této oblasti mohou ovlivnit účinnost systému CRISPR. Tento vztah navíc ukazuje možnost počítačově založeného návrhu variant sgRNA s požadovanou účinností represe.

Aplikace laditelného systému CRISPRi pro redistribuci toku v biosyntetické dráze violaceinu v E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-násobek) ve srovnání s jinými geny při výpočtu ze standardních křivek. Naproti tomu exprese jiných neregulovaných enzymů ve violaceinové dráze (vioA, vioB a vioE) zůstala nezměněna. Tyto výsledky naznačují, že náš systém může specificky cílit a modulovat expresi jednotlivých genů bez ovlivnění jiných genů v dráze. Přímá kvantifikace PV a PDV nebyla možná kvůli nedostatku komerčně dostupných standardů pro HPLC analýzu. Změřili jsme tedy titry v libovolných jednotkách pomocí plochy píku HPLC. Titr produktu dosáhl maxima 8 hodin po indukci a poté se postupně snižoval (doplňkový obrázek S8), pravděpodobně v důsledku konverze produktu na jiné vedlejší produkty, jako jsou chromoviridany, neznámým mechanismem (42, 64). Pozorované menší píky na spektru HPLC indikovaly přítomnost dalších minoritních vedlejších produktů. Předchozí výzkum ukázal, že logaritmus titru každého produktu v libovolných jednotkách lze předpovědět lineárními kombinacemi síly promotoru každého genu zapojeného do biosyntetické dráhy violaceinu (42). Tento log-lineární regresní model byl také platný v našem systému a zvýšené přepisy vioD byly spojeny se zvýšenou produkcí PV (obrázek 4B). Je známo, že sestrojení promotoru nebo 5 -UTR každého genu zapojeného do biosyntetické dráhy violaceinu umožnilo redistribuci toku a optimalizaci dráhy (65,66). Náš systém by mohl fungovat jako alternativní metoda ilustrující kontrolu transkripce bez manipulace s promotory zapojenými do dráhy pomocí syntetických sgRNA, které jsou krátké a lze je sestavit pomocí jednokrokových metod. Screening prostřednictvím laditelného systému CRISPRi umožňuje přesměrovat cestu s předvídatelným tokem před přímou manipulací s hostitelskými kmeny nebo genovými kazetami, což potenciálně urychluje proces.

Použití laditelného systému CRISPRi pro vyrovnání toku uhlíku v E. coli produkující lykopen

Efektivní produkce cenných sloučenin v metabolickém inženýrství vyžaduje vyrovnání toku uhlíku. Dráha methylerythritolu 4-fosfátu (MEP) je metabolická dráha, která využívá jednoduché prekurzory, jako je pyruvát a glyceraldehyd 3-fosfát (GAP) k výrobě isoprenoidních stavebních bloků, dimethylallylpyrofosfátu a isopentenylpyrofosfátu (67,68) . Tyto molekuly syntetizují geranylpyrofosfát, který se přeměňuje na farnesylpyrofosfát (FPP) (67,68). Lykopen, vysoce ceněný karotenoid se silnými antioxidačními vlastnostmi a rozmanitými aplikacemi v různých průmyslových odvětvích (69), je syntetizován z FPP řadou enzymatických reakcí z crtE, crtB a crtI (obrázek 4C) (22,70). Prekurzor GAP je nezbytný nejen pro dráhu MEP, ale také pro dráhu glykolýzy (22). Bylo prokázáno, že snížená exprese genu gapA, který kóduje glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (GAPDH) v dráze glykolýzy, zvyšuje produkci lykopenu zvýšením zásoby GAP (22). Proto jsme se zaměřili na gapA s pěti variantami, včetně tří variant sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 a sg trcSL1c6), které vykazovaly různou účinnost represe, sg PC a sg WT. GapA je však esenciální gen, který nelze zcela zničit (71,72). Pokusy potlačit gapA konvenčním CRISPRi pomocí sg WT byly neúspěšné i při nízké propustnosti dcas9 pod tet promotorem (73). Na druhou stranu bylo dosaženo víceúrovňové represe exprese genu gapA pomocí laditelného systému CRISPRi bez růstového defektu a vedla k 2.{26}}násobnému zvýšení produkce lykopenu s sg trcSL1c6 ve srovnání s kmenem plně exprimujícím gen gapA po 15 hodinách kultivace (obrázek 4D a doplňkový obrázek S9). Bylo hlášeno, že pouze 10 % přirozené exprese genu gapA vede ke zvýšenému množství GAP bez významné změny v následných metabolitech v dráze glykolýzy, jako je 2-fosfoglycerát a 3-fosfoglycerát ( 22). Souhrnně tyto výsledky ukazují, že laditelné CRISPRi může přesně potlačit genovou expresi na více úrovních bez chromozomového inženýrství.

Obrázek 4. Aplikace laditelného systému CRISPRi pro biosyntetickou dráhu violaceinu. (A) Biosyntetická dráha violaceinu a konstrukce plazmidu. Pět genů (vioA, vioB, vioC, vioD a vioE) odpovědných za produkci violaceinu bylo klonováno do plazmidu exprimujícího dCas9-. Vyrábí se čtyři hlavní produkty (violacein, proviolacein, deoxyviolacein a prodeoxyviolacein). sg WT pro vioC a pět variant sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 a sg trcSL1c9) pro vioD, vykazující různé účinnosti represe, byly klonovány do jiného plazmidu. Trp: L-tryptofan, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoxyviolacein, DV: deoxyviolacein, PDVA: kyselina protodeoxyviolaceinová, PVA: kyselina protoviolaceinová. (B) Vztah mezi vioD transkripty, fluorescencí mCherry a titrem PDV a PV. Osa x ukazuje relativní vioD RNA získanou z RT-qPCR, osa y vlevo ukazuje relativní fluorescenci mCherry z obrázku 3 a osa y vpravo ukazuje poměr plochy HPLC. Vzorky s nejvyšší hodnotou vioD RNA byly pro normalizaci nastaveny na 100 %. (C) Biosyntetická dráha lykopenu a konstrukce plazmidu. Tři geny (crtE, crtB, crtI) zodpovědné za produkci lykopenu byly klonovány do plazmidu exprimujícího dCas{20}}. gapA byl cílen variantami sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) a sg PC byl klonován do druhého plazmidu. Glc: Glukóza, GAP: glyceraldehyd 3-fosfát, 1,3-BPG: 1,3-bisfosfoglycerát, DMAPP: dimethylallylpyrofosfát, IPP: isopentenylpyrofosfát, FPP: farnesylpyrofosfát. (D) Vztah mezi přepisy gapA, fluorescencí mCherry a produkcí lykopenu. Osa x ukazuje relativní mezeru RNA získanou z RT-qPCR, osa y vlevo ukazuje relativní fluorescenci mCherry z obrázku 3 a osa y vpravo ukazuje titr lykopenu. (B, D) Všechny chybové úsečky označují standardní odchylku (n=3).

ZÁVĚR

Navrhli jsme laditelný systém CRISPRi, který by mohl přesně řídit genovou expresi na požadované úrovni. Mutací tetraloopu a jeho přilehlé oblasti by syntetické sgRNA zacílené na různé protospacerové sekvence mohly regulovat gen na určité úrovni. Úspěšně jsme použili tento systém k přesměrování zájmového metabolického toku v biosyntetické dráze violaceinu k produkci indolových derivátů v předvídatelném poměru. Navíc jsme ukázali, že použití laditelného CRISPRi vedlo k 2.{1}}násobnému zvýšení produkce lykopenu, což podtrhuje všestrannost našeho systému pro zlepšení produkce dalších cenných sloučenin. Tento systém by urychlil procesy optimalizace toku před trvalou manipulací s genetickou informací hostitele, jako je nahrazení promotoru nebo 5-UTR sekvencí.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

REFERENCE

1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. a Siksnys, V. (2011) Systém Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas zajišťuje imunitu u Escherichia coli. Nucleic Acids Res., 39, 9275-9282.

2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. a Siksnys, V. (2012) Cas9-crRNA ribonukleoproteinový komplex zprostředkovává specifické štěpení DNA pro adaptivní imunitu u bakterií. Proč. Natl. Akad. Sci. USA, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini, LA a kol. . (2013) Multiplexní genomové inženýrství pomocí systémů CRISPR/Cas. Science, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA a Zhang, F. (2013) Genomové inženýrství pomocí systému CRISPR-Cas9. Nat. Protoc., 8, 2281–2308.

5. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,JA and Charpentier,E. (2012) Programovatelná duální RNA řízená DNA endonukleáza v adaptivní bakteriální imunitě. Věda, 337, 816–821.

6. Anders,C., Niewoehner,O., Duerst,A. a Jinek,M. (2014) Strukturální základ rozpoznávání cílové DNA závislé na PAM endonukleázou Cas9. Příroda, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP a Lim, WA (2013) Repurposing CRISPR jako RNA řízená platforma pro sekvenčně specifickou kontrolu genové exprese. Cell, 152, 1173–1183.

8. Larson,MH, Gilbert,LA, Wang,X., Lim,WA, Weissman,JS a Qi,LS (2013) CRISPR interference (CRISPRi) pro sekvenčně specifickou kontrolu genové exprese. Nat. Protoc., 8, 2180–2196.

9. McGlincy,NJ, Meacham,ZA, Reynaud,KK, Muller,R., Baum,R. and Ingolia,NT (2021) Knihovna CRISPR interferenčních průvodců v genomovém měřítku umožňuje komplexní fenotypové profilování v kvasinkách. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon, J. a Woo,HM (2018) CRISPR interferencemi zprostředkované metabolické inženýrství Corynebacterium glutamicum pro produkci homo-butyrátu. Biotechnol. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto,S., Jensen,JV, Wendisch,VF and Lu,TK (2016) Corynebacterium glutamicum metabolické inženýrství s interferencí CRISPR (CRISPRi). ACS Synth. Biol., 5, 375-385.

12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. a Zou,HB (2021) Zlepšení mikrobiální produkce aminokyselin: od konvenčních přístupů k současným trendům. Biotechnol. Bioproc. E, 26, 708-727.

13. Kim,SK, Seong,W., Han,GH, Lee,DH a Lee,SG (2017) CRISPR interferencí řízená multiplexní represe genů endogenních kompetitivních drah pro přesměrování metabolického toku u Escherichia coli. Microb. Cell Fact., 16, 188.

14. Ellis,NA, Kim,B., Tung,J. a Machner, MP (2021) Multiplexní interferenční nástroj CRISPR pro dotazování genu virulence u Legionella pneumophila. Commun. Biol., 4, 157.

15. Siu, KH a Chen, W. (2019) Riboregulovaná toehold-gated gRNA pro programovatelnou funkci CRISPR-Cas9. Nat. Chem. Biol., 15, 217-220.

16. Reis,AC, Halper,SM, Vezeau,GE, Cetnar,DP, Hossain,A., Clauer,PR a Salis,HM (2019) Simultánní represe více bakteriálních genů pomocí neopakujících se extra dlouhých polí sgRNA. Nat. Biotechnol., 37, 1294-1301.

17. Tian,T., Kang,JW, Kang,A. a Lee,TS (2019) Přesměrování metabolického toku prostřednictvím kombinatorické multiplexní represe zprostředkované CRISPRi pro produkci isopentenolu v Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 8, 391-402.

18. Gauttam,R., Seibold,GM, Mueller,P., Weil,T., Weiss,T., Handrick,R. a Eikmanns, BJ (2019) Jednoduchý duálně indukovatelný interferenční systém CRISPR pro cílení více genů v Corynebacterium glutamicum. Plazmid, 103, 25-35.

19. Yao,L., Cengic,I., Anfelt,J. a Hudson, EP (2016) Vícenásobná genová represe u sinic pomocí CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207-212.

20. Lim,HG, Noh,MH, Jeong,JH, Park,S. a Jung,GY (2016) Optimální vyvážení dráhy produkce kyseliny 3-hydroxypropionové z glycerolu v Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 5, 1247-1255.

21. Yang.Y., Lin.Y., Li.L., Linhardt.RJ a Yan.Y. (2015) Regulace metabolismu malonyl-CoA prostřednictvím syntetických antisense RNA pro zvýšenou biosyntézu přírodních produktů. Metab. Eng., 29, 217–226.

22. Jung,J., Lim,JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK and Jung,GY (2016) Přesné vyvažování prekurzorů pro produkci izoprenoidů jemným řízením exprese gapA v Escherichia coli. Metab. Eng., 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL a Jun,S. (2016) tCRISPRi: laditelná a reverzibilní, jednokroková kontrola genové exprese. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG and Carothers,JM (2018) Regulovaná exprese sgRNAs ladí CRISPRi v E. coli. Biotechnol. J., 13, e1800069.

25. Kim,NM, Sinnott,RW a Sandoval,NR (2020) Biosenzory založené na transkripčních faktorech a indukovatelné systémy v nemodelových bakteriích: současný pokrok a budoucí směry. Curr. Opin. Biotechnol., 64, 39–46.

26. Kundert,K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann,C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. a kol. (2019) Řízení CRISPR-Cas9 pomocí ligandem aktivovaných a ligandem deaktivovaných sgRNA. Nat. Commun., 10, 2127.

27. Ferreira,R., Skrekas,C., Hedin,A., Sanchez,BJ, Siewers,V., Nielsen,J. a David, F. (2019) Modelem podporované jemné ladění centrálního metabolismu uhlíku v kvasinkách prostřednictvím regulace založené na dCas9-. ACS Synth. Biol., 8, 2457-2463.

28. Su.T., Guo.Q., Zheng.Y., Liang.Q., Wang.Q. a Qi,Q. (2019) Jemné ladění hemB pomocí CRISPRi pro zvýšení produkce kyseliny 5-aminolevulové v Escherichia coli. Přední. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . a kol. (2017) Profilování specificity single-guide RNA odhaluje jádrovou sekvenci citlivou na neshodu. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang,W., Bikard,D., Cox,D., Zhang,F. a Marraffini, LA (2013) RNA řízená editace bakteriálních genomů pomocí systémů CRISPR-Cas. Nat. biotechnologie,

31, 233–239. 31. van Gestel,J., Hawkins,JS, Todor,H. a Gross, CA (2021) Výpočetní potrubí pro navrhování vodících RNA pro mismatch-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins,JS, Silvis,MR, Koo,BM, Peters,JM, Osadník,H., Jost,M., Hearne,CC, Weissman,JS, Todor,H. a Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi odhaluje různý vztah exprese-vhodnosti esenciálních genů v Escherichia coli a Bacillus subtilis. Cell Syst., 11, 523–535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR a Martin, SE (2019) Zacílení na více genů a tolerance nesprávného párování mohou zmást analýzu genomu- široké sdružené obrazovky CRISPR. Genome Biol., 20, 21.

34. Rozen,S. a Skaletsky,H. (2000) Primer3 na WWW pro běžné uživatele a pro programátory biologů. Metody Mol. Biol., 132, 365-386.

35. Zhou,K., Zhou,L., Lim,Q., Zou,R., Stephanopoulos,G. and Too,HP (2011) Nové referenční geny pro kvantifikaci transkripčních odpovědí Escherichia coli na nadměrnou expresi proteinu pomocí kvantitativní PCR. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak,KJ a Schmittgen,TD (2001) Analýza dat relativní genové exprese pomocí kvantitativní PCR v reálném čase a metody 2(-Delta Delta C(T)). Methods, 25, 402–408.

37. Andrews,S. (2010) FastQC: Nástroj pro kontrolu kvality pro vysoce výkonná sekvenční data. v0.11.9 ed.

38. Langmead,B., Trapnell,C., Pop,M. a Salzberg,SL (2009) Ultrarychlé a paměťově efektivní zarovnání krátkých sekvencí DNA k lidskému genomu. Genome Biol., 10, R25.

39. Daneček, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM et al. (2021) Dvanáct let SAMtools a BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea,G., Mortazavi,A., Kwan,G., van Baren,MJ, Salzberg,SL, Wold,BJ and Pachter,L. (2010) Sestavení a kvantifikace transkriptů pomocí RNA-Seq odhaluje neanotované transkripty a přepínání izoforem během buněčné diferenciace. Nat. Biotechnol., 28, 511-515.

41. Trapnell,C., Hendrickson,DG, Sauvageau,M., Goff,L., Rinn,JL and Pachter,L. (2013) Diferenciální analýza genové regulace při rozlišení transkriptu s RNA-seq. Nat. Biotechnol., 31, 46–53.

42. Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ a Dueber, JE (2013) Optimalizace na úrovni exprese multienzymové dráhy v nepřítomnosti vysoce výkonného testu. Nucleic Acids Res., 41, 10668-10678.

43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S., Agarwala,V., Li,Y., Fine,EJ, Wu,X., Shalem,O. a kol. (2013) DNA zacílení specificita RNA-řízených Cas9 nukleáz. Nat. Biotechnol., 31, 827-832.

44. Nishimasu,H., Ran,F., Hsu,P., Konermann,S., Shehata,S., Dohmae,N., Ishitani,R., Zhang,F. a Nureki, O. (2014) Krystalová struktura Cas9 v komplexu s Guide RNA a cílovou DNA. Cell, 156, 935–949.

45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO and Skok,JA (2016) Scaffoldy CRISPR-dCas9 a sgRNA umožňují dvoubarevné živé zobrazování satelitních sekvencí a opakovaně obohacené jednotlivé lokusy. Nat. Commun., 7, 11707.

46. ​​Khosravi,S., Schindele,P., Gladilin,E., Dunemann,F., Rutten,T., Puchta,H. a Houben, A. (2020) Aplikace aptamerů zlepšuje živé zobrazování rostlinných telomer na bázi CRISPR. Přední. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen, AA a Voigt, CA (2014) Genetické obvody CRISPR/Cas s více vstupy, které propojují hostitelské regulační sítě. Mol. Syst. Biol., 10, 763.

48. Lee,YJ, Hoynes-O'Connor,A., Leong,MC a Moon,TS (2016) Programovatelné řízení exprese bakteriálního genu pomocí 44, 2462–2473.

49. Vigouroux,A., Oldewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. a van Teeffelen, S. (2018) Vyladění schopnosti dCas9 blokovat transkripci umožňuje robustní, nehlučné knockdown bakteriálních genů. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.

50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. a šel. (2012) Vývoj a aplikace arabinózou indukovatelného expresního systému usnadněním vychytávání induktoru v Corynebacterium glutamicum. Appl. Environ. Microbiol., 78, 5831-5838.

51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. a Keasling, JD (2018) Izolace a charakterizace nových mutací v původu pSC101, které zvyšují počet kopií. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. a Polen, T. (2020) Laditelný L-arabinózou indukovatelný expresní plazmid pro bakterii kyseliny octové Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 9267-9282.

53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR a Park,S. (2021) In vivo charakterizace indukovatelného promotorového systému 3-hydroxypropiondehydrogenázy u Pseudomonas denitrificans. Biotechnol Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty,NS, Graham,AE, Studena,L. a Ledesma-Amaro,R. (2020) Multiplexované technologie CRISPR pro úpravu genů a regulaci transkripce. Nat. Commun., 11, 1281.

55. Yan, Q. a Fong,SS (2017) Studium in vitro transkripčních vazebných účinků a šumu pomocí konstitutivních promotorů kombinovaných se sekvencemi UP elementů v Escherichia coli. J. Biol. Angličtina, 11, 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. a Jung,GY (2013) Prediktivní návrh oblasti iniciace translace mRNA pro kontrolu účinnosti prokaryotické translace. Metab. Eng., 15, 67–74. 57. Kappel,K., Jarmoskaite,I., Vaidyanathan,PP, Greenleaf,WJ, Herschlag,D. a Das, R. (2019) Slepé testy predikce vazebné afinity RNA-protein. Proč. Natl. Akad. Sci. USA, 116, 8336–8341.

58. Zuker, M. (2003) Mfold webový server pro skládání nukleových kyselin a predikci hybridizace. Nucleic Acids Res., 31, 3406-3415.

59. Xiong, B., Zhu, Y., Tian, ​​D., Jiang, S., Fan, X., Ma, Q., Wu, H. a Xie, X. (2021) Flux redistribuce centrálního metabolismu uhlíku pro účinnou produkci l-tryptofanu v Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao,R., Li,J., Feng,L., Zhang,X. a Hu,H. (2019) (13)C metabolické inženýrství Escherichia coli řízené analýzou metabolického toku pro zlepšení produkce acetolu z glycerolu. Biotechnol. Biopaliva, 12, 29.

61. Duran,N. a Menck,CF (2001) Chromobacterium violaceum: přehled farmakologických a průmyslových perspektiv. Crit. Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar, CJ a Walsh, CT (2006) In vitro biosyntéza violaceinu z L-tryptofanu pomocí enzymů VioA-E z Chromobacterium violaceum. Biochemistry, 45, 15444–15457.

63. Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY a Lee, JW (2021) Adaptivní laboratorní evoluce pro produkci violaceinu s pomocí biosenzoru. Int. J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez,C., Brana,AF, Mendez,C. a Salas, JA (2006) Přehodnocení biosyntetické dráhy violaceinu a její vztah k biosyntéze indolokarbazolu. Chem. Bio. Chem., 7, 1231-1240.

65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ and Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a kombinatorický přístup pro transkripční vyvažování metabolických drah. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang,Y., Chen,H., Zhang,Y., Yin,H., Zhou,C. a Wang, Y. (2021) Přímé RBS inženýrství biosyntetického genového klastru pro efektivní produktivitu violaceinů v E. coli. Microb. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) Nemevalonátová cesta biosyntézy izoprenoidních prekurzorů. J. Biol. Chem., 282, 21573-21577.

68. Rohmer,M. (1999) Objev mevalonátově nezávislé cesty pro biosyntézu izoprenoidu v bakteriích, řasách a vyšších rostlinách. Nat. Prod. Rep., 16, 565–574.

69. Muller,L., Caris-Veyrat,C., Lowe,G. a Bohm, V. (2016) Lykopen a jeho antioxidační role v prevenci kardiovaskulárních onemocnění – kritický přehled. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura,Y., Kondo,K., Saito,T., Shimada,H., Fraser,PD and Misawa,N. (1998) Produkce karotenoidů lykopen, beta-karoten a astaxanthin v potravinářských kvasinkách Candida utilis. Appl. Environ. Microbiol., 64, 1226-1229.

71. Goodall,ECA, Robinson,A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA and Henderson,IR (2018) Základní genom Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba,T., Ara,T., Hasegawa,M., Takai,Y., Okumura,Y., Baba,M., Datsenko,KA, Tomita,M., Wanner,BL and Mori,H. (2006) Konstrukce jednogenových knockout mutantů Escherichia coli K-12 v rámci: sbírka Keio. Mol. Syst. Biol., 2, 2006,0008.

73. Bertram,R. a Hillen, W. (2008) Aplikace Tet represoru v prokaryotické genové regulaci a expresi. Microb. Biotechnol., 1, 2–16.