Koordinovat regulaci systémového a ledvinového metabolismu tryptofanu transportéry léků OAT1 a OAT3

Jeffry C. Granados¹, Anne Richelle², Jahir M. Gutierrez¹, Patrick Zhang³, Xinlian Zhang⁴, Vibha Bhatnagar⁵, Nathan E. Lewis^1,2,6a Sanjay K. Nigam^2,7,*

^{Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com}

cistanche zkušenost

Klíčovou otázkou je, jak orgány vnímají cirkulující metabolity. Zde ukazujeme, že multispecifické transportéry organických aniontů léků, OAT1 (SLC22A6 nebo NKT) a OAT3 (SLC22A8), hrají roli v orgánovém smyslu. Metabolomické analýzy séra Oat1 a Oat3 knockout myší odhalily změny v derivátech tryptofanu zapojených do metabolismu a signalizace. Některé z těchto metabolitů jsou odvozeny ze střevního mikrobiomu a jsou zapojeny jako uremické toxinychronickýledvinachoroba. Přímá interakce s transportéry byla podpořena buněčnými transportními testy. Pro posouzení dopadu ztráty funkce OAT1 nebo OAT3 na ledviny, orgán, kde jsou tyto transportéry vychytávání vysoce exprimovány, byla knockoutovaná transkriptomická data mapována na výpočetní model založený na „metabolické úloze“, který hodnotí více než 150 buněčných funkcí. Navzdory změnám metabolitů tryptofanu u obou knockoutů došlo pouze u knockoutu Oat1 ke zvýšení vícenásobných buněčných funkcí souvisejících s tryptofanem. Ledviny, zbavené schopnosti přijímat kynurenin, kynurenát, antranilát a N-for-mylanthranilát prostřednictvím OAT1, reagují aktivací svých vlastních biosyntetických drah souvisejících s tryptofanem. Výsledky podporují teorii dálkového průzkumu a signalizace, která popisuje, jak „lékové“ transportéry pomáhají optimalizovat hladiny metabolitů a signálních molekul tím, že usnadňují přeslechy mezi orgány. Vzhledem k tomu, že OAT1 a OAT3 jsou inhibovány mnoha léky, data naznačují potenciál pro interakce lék-metabolit. Léčba lidí probenecidem, inhibitorem OAT používaným k léčbě dny, skutečně zvýšila cirkulující metabolity tryptofanu. Kromě toho, vzhledem k tomu, že regulační úřady doporučily léky testovat na vazbu nebo transport OAT1 a OAT3, vyplývá z toho, že tyto metabolity lze použít jako endogenní biomarkery k určení, zda kandidátní léčiva interagují s OAT1 a/nebo OAT3.

Organické aniontové transportéry OAT1 (SLC22A6, původně NKT (1)) a OAT3 (SLC22A8, původně ROCT (2)) se nacházejí v proximálním tubululedvinaa choroid plexus mozku a kontrolují fyziologickou distribuci a eliminaci mnoha léků a toxinů z prostředí, stejně jako endogenních metabolitů, jako je -ketoglutarát, prostaglandiny a uráty (3, 4). Kromě toho OAT pomáhají regulovat hladiny požitých přírodních produktů a sloučenin odvozených ze střevního mikrobiomu (např. epikatechin, 3-indoxylsulfát, p-kresolsulfát) (5, 6).

OAT1 a OAT3, členové rodiny SLC22, patří mezi nejznámější multispecifické transportéry léčiv. Tato skupina drogových transportérů zahrnuje další členy superrodin SLC (solute carrier) a ABC (ATP-binding cassette) (7, 8). Existuje rozsáhlá literatura o farmaceutických a toxikologických rolích těchto přenašečů, avšak endogenní funkce těchto evolučně konzervovaných proteinů, stejně jako regulační síť, na které se podílejí, se teprve začínají charakterizovat (9). Tyto multispecifické transportéry ovlivňují mnoho aspektů fyziologie a patofyziologie, pravděpodobně tím, že fungují v kombinaci s mono- nebo oligo-specifickými transportéry. Tři dobře charakterizované patofyziologické příklady jsou role OAT1, OAT3, URAT1 a ABCG2 u dny (10), role OAT1 a OAT3 při akumulaci uremických toxinů spojených s chronickýmiledvinaonemocnění (CKD) (11, 12) a rodiny SLC22 u akutníchledvinazranění (13).

Vzhledem k obrovskému množství malých organických aniontových sloučenin transportovaných OAT1 a OAT3 může široká škála xenobiotik a endogenních molekul pravděpodobně soutěžit o přístup a renální clearance těmito transportéry OAT (14, 15). To má důležité důsledky, protože mnoho metabolitů, včetně těch, které vznikají ze střevního mikrobiomu a jsou transportovány OAT1 a OAT3, regulují endogenní fyziologii a jsou spojovány s rozvojem klinických poruch, jako je CKD, metabolický syndrom a diabetes (14, 16, 17). Například množství kyseliny CMPF (3-karboxy-4-methyl-5-propyl-2- furanpropanové kyseliny), substrátu OAT3, v oběhu souvisí s cukrovkou. CMPF je metabolit furanové mastné kyseliny, který se nachází v rybích olejích, rostlinných olejích, másle a dalších potravinách a narušuje funkci pankreatických buněk, což vede k intoleranci glukózy (18, 19). Potenciální důsledky konkurence na úrovni transportéru mezi lékem a transportovaným endogenním metabolitem zahrnují (a) změněné intracelulární koncentrace metabolitů, protože transportovaný lék blokuje vstup metabolitu do buňky; (b) změněné sérové ​​koncentrace léčiva, metabolitu nebo obou, což vede ke zvýšeným poločasům a/nebo hladinám metabolitů; a (c) změněný systémový metabolismus vznikající z distálních kaskádových účinků na mnohočetné metabolické dráhy, které závisí na OAT1 nebo OAT3 nebo obou.

Použili jsme přístup systémové biologie, který využíval metabolomická a transkriptomická data z myší Oat1 a Oat3knockout (KO) k analýze hlavních metabolických funkcí, které jsou ovlivněny OAT1 a OAT3. Metabolomická data v séru od Oat1 a Oat3 KO myší reprezentovala dopad těchto transportérů na endogenní systémový metabolismus. Použili jsme transkriptomická data zledvina, což je místo exprese kódujících transportních genů, k vyhodnocení aktivity stovek metabolických funkcí pomocí analýzy metabolických úloh. Tím jsme byli schopni doplnit znalosti o změnách extracelulárních metabolitů v důsledku ztráty transportéru OAT1 nebo OAT3 s analýzou ovlivněných intracelulárních metabolických drah.

Zde použitý multi-omický přístup a analýza systémové biologie společně poskytují portrét lokálních a systémových metabolických a signálních drah modulovaných samostatně a společně OAT1 a OAT3. Ukazujeme, že OAT1 nejen reguluje metabolismus tryptofanu systémově, ale také hraje klíčovou roli v metabolických drahách tryptofanu uvnitř tkáně, kde se nachází. Naše výsledky tedy naznačují, že studie nových lékových entit by neměly brát v úvahu pouze účinky interakce lék-metabolit (DMI) v séru, ale také hodnotit potenciální posuny v buněčném metabolismu v důsledku ztráty přílivu metabolitů prostřednictvím konkurence na úrovni transportéru. Na podporu významu naší práce pro člověka ukazujeme, že mnoho změn v sérových hladinách metabolitů tryptofanu pozorovaných u knockoutovaných myší je také pozorováno u lidí po podání probenecidu, léku používaného k léčbě dny, který inhibuje OAT1 a OAT3.

\

cistanche mužské výhody

Výsledek

Shrnutí celkového přístupu

Rodina genů SLC22 (OATs, OCTs, OCTNs) kóduje transportéry, které se podílejí na příjmu mnoha jedinečných sloučenin v několika tkáních, ačkoli velká část výzkumu se zaměřila na několik členů (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8), kteří mnoho běžných léků (20, 21). Tyto geny jsou však vysoce konzervované, s ortology v mouchách, červech, rybách a ježovkách (22); to znamená, že mají kromě manipulace s drogami důležitou fyziologickou roli. Abychom určili endogenní role OAT1 a OAT3 při řízení metabolismu na úrovni tkáně a organismu nezávisle na jejich dobře známých rolích jako transportérů léků a toxinů, analyzovali jsme tkáňově specifická transkriptomická data a data sérové ​​metabolomiky (obr. 1). Porovnali jsme údaje od myší geneticky deficientních v Oat1 nebo Oat3 a jejich kontrol divokého typu. Tyto soubory dat byly již dříve zkoumány z chemoinformatického hlediska (23) a aby poskytly široký přehled postižených drah (24), ale zde klademe důraz na jejich specifickou roli v rozložení metabolitů tryptofanu. Protože tyto dva transportéry se nacházejí vledvina, analyzovali jsmeledvinatranskriptomická data využívající Metabolic Task Analysis, metodu systémové biologie, která seskupuje geny podle jejich koordinovaných rolí v biosyntéze omezeného souboru klíčových metabolitových meziproduktů z různých metabolitových vstupů (další podrobnosti viz část Metody). Tyto studie jsme podpořili v rámci testů transportu in vitro; klinickou relevanci našich zjištění podporujeme také údaji o lidské metabolomice.

Známé vlastnosti myší Oat1 KO a Oat3 KO Téměř všechny vlastnosti myší s deficitem Oat1 nebo Oat3 jsou podobné jako u myší divokého typu (25–27) (tabulka 1). Knokautované myši jsou životaschopné s přežitím srovnatelným s přežitím myší divokého typu. Navíc nevykazují žádné zjevné vývojové nebo růstové abnormality a histologické a fyziologické vyšetření těchto různých knockoutů (ve věku ~2–8 měsíců) odhalilo malé nebo žádné rozdíly od divokého typu, kromě myší Oat3 KO s mírně nižším krevním tlakem ( 28). Trend k ukládání lipidů v játrech v Oat1 KO byl také zaznamenán, ale pouze u velmi starých myší (29).

Tyto myši s knockoutem transportéru byly také charakterizovány z farmakologického a toxikologického hlediska (tabulka 2). OAT1 a OAT3 hrají důležitou roli při manipulaci s různými drogami a toxiny, a to jak z prostředí, tak endogenně produkovaných [30–38]. Obě knockoutované myši mají změněné reakce na smyčková a thiazidová diuretika kvůli neschopnosti těchto léků dostat se do lumen nefronu – proces závislý na vychytávání zprostředkovaném OAT1-nebo OAT3- do buňky proximálního tubulu . Zvířata Oat1 KO jsou chráněna proti nefrotoxicitě vyvolané rtutí kvůli nedostatkuledvinapříjem konjugátů rtuti. Obě myši akumulovaly uremické toxiny v séru a vykazovaly sníženou sekreci kyseliny močové. Ex vivo analýza tkání z myší Oat1 KO nebo Oat3 KO ukazuje snížený příjem několika antivirotik.

Uvedli jsme, že zvířata s nedostatkem ovsa1- mohla mít sníženou expresi OAT3 (39). Řada studií však ukázala, že funkční dopad toho je v bazálním stavu přinejlepším mírný. Například knockout Oat1ledvinymají výrazně snížený transport PAH, ale žádnou zjevnou ztrátu transportu substrátu OAT3, estronsulfátu (26). Chemoinformatická analýza identifikovala soubory molekulárních vlastností, které odlišují metabolity změněné v Oat1 ve srovnání s myšmi s deficitem Oat3 (23). Dále embryonálníledvinaorgánové kultury z obou linií myší transportovaly různé sady antivirotik (36–38). Existují také rozdíly v typech uremických toxinů nalezených v Oat1 oproti Oat3 KO (34).

Metabolismus tryptofanu je u Oat1 a Oat3 KO myší systémově změněn

Publikované metabolomické analýzy myší Oat1 KO a Oat3 KO naznačují fyziologicky důležité změny v zacházení s endogenními metabolity a produkty střevního mikrobiomu, včetně některých uremických toxinů (34, 35). Zde jsme analyzovali 731 metabolitů známé identity v séru odebraném z kontrolních a Oat1 KO myší. Podobně bylo detekováno 611 metabolitů známé identity v séru kontrolních a Oat3 KO myší.

U myší Oat1 KO jsme zjistili, že 63 metabolitů v aminokyselinové superdráze (doplňková tabulka S1) bylo významně zvýšeno (p menší nebo rovno 0.05, 54 metabolitů, mezi nimi 12 metabolitů měly násobné změny vyšší než 3) nebo směřovaly k významně zvýšenému (0.05 Menší nebo rovno p Menší nebo rovno 0,10, devět metabolitů), což naznačuje, že jde buď o substráty OAT1, nebo že jejich koncentrace v séru závisí na OAT1. U myší Oat3 KO jsme zjistili, že deset metabolitů v Amino Acid Superpathway bylo významně zvýšeno, zatímco 11 mělo tendenci k významně zvýšenému (doplňková tabulka S2). Jako doplněk k hodnotám p jsme také vypočítali Cohenovo d, které vykazovalo velké velikosti účinku (v rozmezí od 1,76 do 4,17) pro metabolity tryptofanu. V souladu s dalšími farmakologickými a fyziologickými údaji získanými od OAT1 a OAT3 knockout myší nebo jejich tkání, které naznačují důležité funkční rozdíly (23, 36, 38), srovnání změn v sérových metabolitech způsobem Amino Acid Superpath mezi Oat1 KO (63 metabolitů) a Myši Oat3 KO (21 metabolitů) odhalily v těchto podskupinách pouze deset překrývajících se metabolitů (doplňková tabulka S3).

Každý metabolit byl klasifikován pomocí softwaru Metabolon do jedné z osmi supercest (aminokyseliny, sacharidy, kofaktory a vitamíny, energie, lipidy, nukleotidy, peptidy, xenobiotika) a jedné z 90 podcest. Ze 17 metabolitů, které se významně akumulovaly v séru zvířat s Oat1 KO a Oat3 KO, patřily čtyři k subpathway metabolismu tryptofanu, což naznačuje, že tyto dva transportéry mají důležitou sdílenou roli v regulaci systémového metabolismu tryptofanu (obr. 2). . Nezávisle na tom, tryptofanový metabolismus patřil mezi nejvíce obohacené Sub dráhy pro oba knockout modely (obr. 3). Šestnáct Obrázek 3. Metabolismus tryptofanu je jednou z nejvíce změněných drah u obou knockoutovaných myší. Graf sopky pro Oat1 KO (n=5) ​​ukazuje metabolity tryptofanu proti všem ostatním měřeným metabolitům. B, metabolismus tryptofanu je druhou nejvíce obohacenou cestou pro významně zvýšené metabolity. C, graf sopky pro Oat3 KO (n=3) ukazující metabolity tryptofanu proti všem ostatním měřeným metabolitům. D, metabolismus tryptofanu je nejvíce obohacenou cestou pro významně zvýšené metabolity na základě analýzy metabolonových subdráh. Role OAT1 a OAT3 v metabolismu tryptofanu 4 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575metabolity tryptofanu byly měřeny v séru obou myší a 12 bylo významně změněno alespoň v jedné skupině. Oat1 KO myši měly 11 zvýšených metabolitů, včetně jednoho (N-formylant hranilát), který nebyl měřen v séru Oat3 KO (tabulka 3). Analýza Oat3 KO odhalila, že šest ze 16 metabolitů bylo významně změněno nebo směřovalo k významné změně. O některých z těchto metabolitů, včetně metabolitů pocházejících z bakterií ve střevní mikroflóře, je známo, že mají distální účinky na několik dalších orgánů. Například 3-indoxylsulfát je spojen s progresíledvinaonemocnění a uremický syndrom (12, 40). Data naznačují, že OAT1 a OAT3 spolupracují na regulaci systémového metabolismu tryptofanu, a přesto mají také specifické funkce v metabolismu tryptofanu tím, že manipulují s odlišnými sadami metabolitů ovlivňujících různé biochemické reakce.

Hodnocení interakcí lék-metabolit u lidí zahrnujících lék inhibující OAT a metabolity tryptofanu

Probenecid, lék používaný k léčbě dny, byl podáván lidem za účelem stanovení krátkodobého dopadu léku vázajícího se na OAT s vysokou afinitou na hladiny cirkulujících metabolitů. Probenecid má tři dobře zavedené cíle: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 a OAT3, z nichž všechny jsou blízce příbuzné geny ve skupině transportérů organických aniontů rodiny SLC22 přenašečů rozpuštěných látek. URAT1 je transportér kyseliny močové umístěný na apikální membráně (strana směřující k moči) proximálního tubulu, takže se očekává, že OAT1 a OAT3, které jsou multispecifické a exprimované na straně proximálního tubulu přivrácené ke krvi, budou působit hlubší vliv na sérový metabolom. Srovnání metabolických měření v krvi před a 5 hodin po dávce ukazuje velké změny v metabolické subdráze tryptofanu (tabulka 4). Kvůli různým platformám bylo v této dílčí dráze 22 metabolitů, z nichž 16 bylo významně změněno. Čtrnáct metabolitů bylo měřeno na všech třech platformách a odhalilo několik společných rysů mezi knockout myší a lidmi léčenými probenecidem (obr. 4). Například zvýšení 3-indoxylsulfátu, kynureninu, N-acetylkynureninu a indollaktátu bylo pozorováno jak u skupin knockoutovaných myší, tak u lidí. Mezi myší Oat1 KO a lidmi léčenými probenecidem však došlo k většímu překrývání. Všech osm metabolitů, které byly významně zvýšené v Oat1 KO, byly také významně zvýšeny u lidí léčených léky. Pouze serotonin, který byl zvýšen u myší Oat3 KO, nebyl u lidí změněn.

Myši ošetřené lékem inhibujícím OAT vykazují změny v metabolismu tryptofanu

Jako meziprodukt mezi našimi knockout myšími modely a lidmi jsme léčili myši divokého typu probenecidem, dobře zavedeným lékem inhibujícím OAT. Tato medikamentózní léčba vedla ke zvýšení šesti metabolitů tryptofanu, včetně kynureninu, kynurenátu a indolelaktátu (obr. 5). Tyto metabolity byly zvýšeny v jednom nebo obou knockout experimentech au lidí léčených probenecidem.

Celkové výsledky u lidí a myší léčených probenecidem, stejně jako u knockout myší, tedy podporují úlohu OAT1 a OAT3 při regulaci cirkulujících hladin metabolitů tryptofanu.

Metabolity tryptofanu interagují s lidským OAT1 a OAT3 in vitro transportní testy Abychom potvrdili naše zjištění, provedli jsme in vitro transportní testy s použitím buněk nadměrně exprimujících lidský OAT1 a OAT3. Mnoho metabolitů v této dílčí dráze bylo testováno proti těmto transportérům (tabulka 3), ale jiné metabolity zůstávají neprozkoumané. Transportní testy pro kyselinu indoloctovou (ILA) odhalily, že ILA interaguje s OAT1 a OAT3 (IC50=229.1 ± 74,56 μM, resp. 74,49 ± 23,29 μM) (obr. 6). Kromě toho serotonin, který byl jedinečně zvýšený v Oat3 KO, interagoval pouze s OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (data neuvedena). Hodnoty IC50 byly poté integrovány se známými hodnotami Km pro výpočet inhibičních konstant. Inhibiční konstanta (Ki) pro ILA s OAT1 byla 119,3 uM.

Analýza metabolomických úloh knockout ledvin ukazuje klíčovou roli OAT1 při snímání metabolitů tryptofanu v proximálních tubulech

Použili jsme data microarray zledvinyOat1 KO, Oat3 KO a jejich kontroly divokého typu, aby se zjistilo, jak změny transportéru ovlivňujíledvinametabolické funkce. Za tímto účelem jsme použili metodu systémové biologie (analýza metabolických úloh (41) z nástroje CellFie), která předpovídá, jak změny v genové expresi ovlivňují předem definovaný seznam 175 metabolických úloh (doplňková tabulka S4), které pokrývají obecné metabolické systémy buňky (energie, nukleotid, sacharidy, aminokyseliny, lipidy, vitaminy a kofaktory a metabolismus glykanů). Jak je popsáno v části Metody, výpočet "skóre metabolického úkolu" bere transkriptomická data a přiřazuje skóre genové aktivity pro každý gen. Model metabolismu v měřítku genomu se používá k sestavení seznamu reakcí potřebných ke splnění každého ze 175 metabolických úkolů. Transkriptomickou analýzu lze tedy přímo použít ke kvantitativnímu srovnání relativní aktivity každé metabolické funkce za různých podmínek (např. divoký typ versus Oat1 KO, divoký typ versus Oat3 KO).

Zjistili jsme, že metabolické úkoly související s tryptofanem byly běžné u těch s velkým rozdílem mezi ovesným KO a myší divokého typu. Nečekané však bylo, želedvinametabolické úlohy související s tryptofanem byly závislé na OAT1, ale ne na OAT3. U myší Oat1 KO měla syntéza kynureninu, kynurenátu, antranilátu a N-for-mylantranilátu z tryptofanu zvýšené skóre metabolických úkolů, zatímco každý z těchto úkolů měl snížené skóre metabolických úkolů v Oat3 KO. To je v souladu se sérovými metabolomickými analýzami, které ukazují významné zvýšení hladin kynureninu, kynurenátu, antranilátu a N-for-mylantranilátu v KO Oat1.

Diskuse

OAT1 a OAT3 jsou uznávány pro svou roli při eliminaci stovek léků (42). Studie OAT1 a OAT3 in vivo a in vitro však ukázaly, že tyto proteiny se podílejí na transportu mnoha endogenních a střevních mikrobů odvozených metabolitů, uremických toxinů, signálních molekul, požitých živin, průmyslových toxinů a přírodních produktů (9, 24, 26, 34, 35, 43). Zdá se, že to platí i pro jiné multispecifické transportéry léčiv, což naznačuje, že jejich příspěvek k endogennímu metabolismu je značně nedoceněný (44).

Tyto multispecifické transportéry léčiv jsou vysoce exprimovány téměř ve všech tkáních a hrají zvláště kritickou roli na obrázku 4. Metabolity tryptofanu byly zvýšeny u myší s knockoutem ovsa au lidí léčených probenecidem. Vennův diagram významně změněných metabolitů tryptofanu u knockoutovaných myší a lidí léčených probenecidem. Ze 14 metabolitů společných pro všechny tři platformy bylo 12 významně zvýšeno alespoň v jednom z experimentů. Čtyři metabolity byly významně zvýšené v každém experimentu. B, chemické struktury metabolitů zvýšené v každém experimentu: 3-indoxylsulfát, indolelaktát, kynurenin a N-acetylkynurenin. C, boxgrafy pro každý metabolit u lidí léčených probenecidem (n=20), myší Oat1 KO (n=5) a myší Oat3 KO (n=3). Čáry v boxplotech označují medián. Role OAT1 a OAT3 v metabolismu tryptofanu. Biol. Chem. (2021) 296 100575 7epiteliální a endoteliální bariéry mezi krví a jinými tělesnými tekutinami/kompartmenty (např. hematoencefalická bariéra, hematoencefalická bariéra, hematoencefalická bariéra, noso-mozková bariéra, hemato-močová bariéra). Jako regulátory systémového metabolismu, stejně jako lokálního metabolismu v jejich expresivní tkáni, může typ studií a analýz, které jsme zde popsali, pokud jsou prováděny pro všechny "lékové" transportéry, radikálně změnit naše fyziologické názory na tyto evolučně konzervované proteiny.

Klinický farmaceutický význam těchto transportérů je obrovský a regulační orgány doporučily screening nových lékových jednotek proti nejméně sedmi multispecifickým lékovým transportérům (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP), aby se omezila možnost lékové interakce (DDI) – případy, kdy dvě nebo více léků soutěží o přístup ke stejnému transportéru. DDI zprostředkované transportérem mohou změnit koncentraci léčiv v krvi, což může vést k nežádoucím klinickým účinkům (45). Vzhledem k počtu substrátů pro OAT1 a OAT3 se může podobný jev vyskytnout mezi léčivy a metabolity v oběhu. Tyto DMI mají také potenciál ovlivnit funkci tkáně, protože metabolity a signální molekuly nemusí být schopny vstoupit do buňky a uplatnit svůj účinek na normální buněčnou fyziologii. Současná studie tuto možnost podporuje.

V našich metabolomických analýzách séra knockoutovaných myší Oat1 a Oat3 došlo k výrazným změnám v metabolitech souvisejících s tryptofanem. Zvýšení systémových hladin metabolitů v důsledku nepřítomnosti těchto transportérů na krevním rozhraní s metabolityledvinazvýšilo možnost snížené intracelulární koncentrace vledvinabuňky proximálního tubulu. Jak mohou tyto buňky reagovat? K řešení této otázky jsme použili analýzu metabolických úloh založenou na transkriptomice. Identifikovali jsme několik lokálních (ledvinových) metabolických úkolů souvisejících s tryptofanem ovlivněných nepřítomností přenašečů. Tyto změny ve skóre metabolických úkolů jsou způsobeny kompenzačním zvýšením exprese genů spojených s metabolickými úkoly v kontextu deficitu OAT1. Zatímco mnoho metabolických drah bylo zkoumáno jak metabolomickou, tak transkriptomickou analýzou metabolických úloh, použití obou přístupů nám poskytlo jedinečný pohled na to, jak se určité transportéry léčiv podílejí na komunikaci mezi tkání a extracelulárním prostředím. Zatímco tedy metabolity tryptofanu byly regulovány oběma transportéry na systémové úrovni, metabolické úlohy související s tryptofanem v ledvinách byly primárně závislé na OAT1.

Výsledky naznačují, že proximální tubulledvina, kde se OAT nacházejí, není pouze kanálem pro renální eliminaci metabolitů tryptofanu; snímá metabolity tryptofanu a reaguje na změny v jejich intracelulárním množství. Souhrnně údaje podpořily názor, že OAT1 hraje klíčovou roli nejen při odstraňování metabolitů souvisejících s tryptofanem z oběhu tím, že podporuje jejich vychytáváníledvinaale také, že tento přenašeč reguluje intracelulární metabolismus, zejména metabolismus tryptofanu.

To podporuje názor, že transport kynureninu, kynurenátu, antranilátu a N-pro-mylanthranilátu je důležitý proledvinafunkce (obr. 8). Tyto čtyři metabolity patří do kynureninové podcesty degradace tryptofanu a kromě kynurenátu se podílejí na produkci buněčné energie prostřednictvím syntézy NAD plus (46). Je tedy možné, že nedostatek OAT1 vede ke zhoršenému buněčnému metabolismu, který může být, alespoň částečně, obnoven produkcí těchto metabolitů.

Téměř veškerý požitý tryptofan je metabolizován do tří hlavních podcest: kynurenin, serotonin a indol (47, 48). Kromě své role při produkci NAD plus produkuje kynureninová subdráha metabolity, které mají různé funkce ve zdravých i nemocných stavech (46, 49). Serotoninová dráha produkuje neurotransmiter, serotonin, který hraje roli v mnoha fyziologických procesech, zejména jako regulátor funkce CNS (50). Indolová subdráha, která je zprostředkována střevním mikrobiomem, produkuje signální molekuly, které se účastní komunikace hostitel-mikrobiální (51). Systémově OAT1 a OAT3 modulují biologickou dostupnost metabolitů tryptofanu z každé ze tří podcest, ačkoli většina metabolitů pochází z kynureninových a indolových podcest.

Vezmeme-li v úvahu nesčetné množství signálních rolí, které mají zvýšené metabolity, existuje potenciál, aby OAT1 a OAT3 ovlivňovaly mnoho aspektů fyziologie. Například kynurenát aktivuje GPR35, lékový cíl, a GPCR zapojený do zánětlivých reakcí a kardiovaskulárních onemocnění (52). Mnohé z významně pozměněných metabolitů tryptofanu jsou také zavedenými nebo domnělými ligandy arylového uhlovodíkového receptoru (AhR) (tabulka 3), regulátoru transkripce exprimovaného téměř ve všech tkáních, které reagují na xenobiotika (53).

Metabolomické studie dvou knockoutovaných myší ukázaly, že klíčovou endogenní funkcí OAT1 a OAT3 je regulovat systémové hladiny metabolitů tryptofanu. Lze tedy očekávat, že lék zacílený na OAT1 a OAT3 bude mít podobný dopad na metabolom. Jak bylo předpovězeno, translační potenciál našich knockoutovaných myší jako modelů DMI byl silně podpořen výsledky od lidí léčených probenecidem, lékem inhibujícím OAT, který se celosvětově používá k léčbě dny. Několik metabolitů tryptofanu bylo zvýšeno jak v séru lidí, tak u knockoutovaných myší.

Existuje tedy potenciál pro použití sloučenin zvýšených ve studiích na lidech a hlodavcích jako biomarkery pro nové lékové entity, které mohou inhibovat OAT1 a OAT3. Zatímco modely knockoutovaných myší (které mají normální očekávanou délku života) a lidé léčení probenecidem byli zdraví, některé ze zvýšených metabolitů jsou známé uremické toxiny, které jsou zvýšené v séru lidí trpících chronickým selháním ledvin a jsou spojeny s negativními výsledky (54 , 55). Překrývání metabolitů zapojených do aspektů CKD a naše studie naznačily, že OAT mohou hrát klíčovou roli v projevech CKD nebo jeho progresi, i když je také možné, že koncentrace metabolitů mohou být zvýšeny v důsledku ztráty sekrece v důsledku tkáně poškození (56, 57). CKD může také vést k multiorgánovému selhání, částečně kvůli akumulaci uremických toxinů, a to může být částečně způsobeno vychytáváním do jiných tkání prostřednictvím SLC a ABC transportérů léků (12, 58).

Metabolismus tryptofanu vyžaduje koordinovanou funkci několika orgánů. Tryptofan je absorbován střevem, modifikován játry nebo jinými orgány a metabolity jsou nakonec transportoványledvina, částečně prostřednictvím funkce OAT1 a OAT3. Obvykle se na to pohlíží jednoduše jako na eliminační cestu. Naše výsledky, které naznačují, že buňkyledvinareagovat na nepřítomnost těchto metabolitů a signálních molekul tím, že se soustředí na jejich produkci, naznačují opak. Přestože jejich specifická role vledvinaproximální tubulus je špatně definován, je zřejmé, že mnoho produkovaných meziproduktů jsou neurotransmitery a mají důležitou roli ve funkci CNS (46, 49, 59, 60). Metabolismus tryptofanu kromě meziorgánové komunikace odráží také meziorganismovou komunikaci mezi hostitelem a střevním mikrobiomem. Sérum bezmikrobních myší skutečně snížilo hladiny 3-indoxylsulfátu, indolepropionátu a serotoninu (61). Kromě toho předchozí studie ukázaly, že v renálních OAT1-pozitivních buňkách 3-indoxylsulfát funguje v buněčné signalizaci aktivací AhR a regulací jejich vlastní sekrece prostřednictvím OAT1 (62). Naše zjištění, že metabolity pocházející ze střeva byly zvýšeny v séru myší Oat1 KO a Oat3 KO – spolu s naší demonstrací, že některé jsou ligandy in vitro, poskytují další podporu pro důležitost těchto transportérů při regulaci komunikace mezi hostitelem a komenzálem. organismy. Celkově jsou naše výsledky v souladu s teorií dálkového průzkumu a signalizace, která navrhuje, aby se transportéry léků a enzymy metabolizující léky podílely na meziorgánové a meziorganizmové komunikaci prostřednictvím transportu a modifikace malých molekul k udržení homeostázy (63, 64). Je tedy zásadní porozumět rozsahu endogenních fyziologických funkcí transportérů léčiv systémově a lokálně.

Se zlepšenými metabolomickými údaji jsme identifikovali metabolity ovlivněné nepřítomností OAT1 a OAT3 v modelech hlodavců a metabolity ovlivněné inhibicí OAT1 a OAT3 u lidí léčených léky inhibujícími OAT. Naše skupina již dříve používala metabolické rekonstrukční sítě k predikci metabolických funkcí a uvedla několik sdílených a jedinečných drah regulovaných OAT1 a OAT3 (43, 65). Tyto studie však byly omezeny ranými verzemi rekonstrukčních nástrojů a velmi malým množstvím metabolomických dat. Zde pomocí odlišného přístupu položila Metabolic Task Analysis mnohem větší důraz na roli OAT1 v intracelulárním metabolismu tryptofanu.ledvina. Náš přístup lze použít ke zkoumání endogenních funkcí dalších členů rodiny SLC a ABC a k vybudování samostatných, ale překrývajících se sítí pro všechny tyto transportéry léků, které se nacházejí nejen u myší, ale také v plném rozsahu a červů (20, 66). Taková reprezentace také usnadní pochopení plného rozsahu DMI pro léky interagující s OAT1, OAT3 nebo oběma, které pravděpodobně přesahují jednoduchou konkurenci na úrovni přepravce.

Experimentální postupy

Zvířata

Všechny experimentální protokoly zahrnující použití zvířat byly schváleny UCSD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Se všemi zvířaty bylo zacházeno v souladu s Institucionálními směrnicemi pro použití živých zvířat pro výzkum. Dospělí samci WT, Oat1 KO a Oat3 KO byli chováni odděleně v 12-hodinovém cyklu světlo-tma a byl jim poskytnut ad libitum přístup k potravě a vodě. Tato zvířata byla popsána v předchozích publikacích (26, 27). Myším léčeným probenecidem byla podávána denně intraperitoneální injekce 200 mg/kg probenecidu nebo PBS po dobu 3 dnů před usmrcením. Poslední injekce byla podána 2 hodiny před usmrcením. Soubory dat použité pro tuto analýzu byly také částečně popsány (23, 24). Soubor dat Oat1 KO byl částečně studován z chemoinformatického hlediska, ale podrobná analýza dráhy nebyla provedena (23). Soubor dat Oat3 KO byl znovu analyzován a byly porovnány pouze dvě skupiny (24).

Studie na lidech s probenecidem

Všechny experimentální protokoly byly přezkoumány a schváleny Institutional Review Board a jsou v souladu s Helsinskou deklarací etických zásad. Vzorky plné krve byly odebrány od 20 jedinců (14 žen, šest mužů). Průměrný věk byl 30,85 ± 10,98 a průměrný BMI byl 24,18 ± 3,52. Účastníci, kteří neužívali žádné léky a byli na vegetariánské stravě po dobu trvání studie. Byla podána perorální dávka 1 gramu probenecidu a po 5 hodinách byla znovu odebrána plná krev. Každý vzorek byl až do metabolomické analýzy uchováván zmrazený při -80 stupních.

Metabolomika Vzorky lidského séra byly okamžitě skladovány při -80 stupních a odeslány na suchém ledu společnosti Metabolon Inc. Vzorky myšího séra byly odebrány a analyzovány, jak bylo popsáno dříve (23, 24). Pro stručnou rekapitulaci pro každý vzorek provedla společnost Metabolon Inc. cílené metabolomické profilování. K přípravě každého vzorku byl použit systém MicroLab STAR od společnosti Hamilton Company a pro kontrolu kvality bylo přidáno několik standardů výtěžnosti. Sérum bylo vysráženo methanolem a mícháno s Glen Mills GenoGrinder 2000, aby se odstranily proteiny ze séra a uvolnily se molekuly navázané na tyto proteiny. Výsledný roztok byl rozdělen na čtyři menší vzorky. Dva byly analyzovány pomocí ultravýkonné kapalinové chromatografie (UPLC) s reverzní fází (RP) hmotnostní spektrometrií (MS) s elektrosprejovou ionizací v pozitivním iontovém módu (ESI). Jeden vzorek byl analyzován pomocí RP/UPLC-MS/MS s negativním iontovým módem ESI. Jeden vzorek byl analyzován pomocí HILIC/UPLC-MS/MS. Organické rozpouštědlo bylo odstraněno umístěním každého vzorku na TurboVap (Zymark).

Statistika

U lidských i myších vzorků byly surové hodnoty normalizovány na objem, logaritmicky transformovány a chybějící hodnoty byly nahrazeny nejnižší pozorovanou hodnotou pro každou sloučeninu. Ve vzorcích lidského séra byla stanovena statistická významnost pomocí kontrastů ANCOVA, které zahrnují BMI a věk. U vzorků myšího séra byla významnost stanovena pomocí Welchova dvouvzorkového t-testu s metabolity, které dosáhly statistické významnosti (p menší nebo rovno 0.05), jakož i s těmi, které se blíží významnosti ( 0.05 Menší nebo rovno p Menší nebo rovno 0,10) zahrnuté v následných analýzách. Obohacení bylo stanoveno pomocí rovnice 1, kde k je počet významně změněných metabolitů v dílčí dráze, m je počet metabolitů v dílčí dráze, n je počet významně změněných metabolitů v celkovém souboru dat a N je počet měřené metabolity v celkovém souboru dat.

Analýza úlohy metabolismu

Ke kvantifikaci jsme použili analýzu metabolických úloh implementovanou v modulu CellFie v GenePatternledvinymetabolické funkce a vliv změn transportéru OAT z dat genové exprese (41) (tj. dat z mikročipů z ledvin Oat1 KO, Oat3 KO a jejich kontrol divokého typu). Tato analýza předpovídá aktivitu upraveného souboru stovek úkolů pokrývajících sedm hlavních metabolických aktivit buňky (generování energie, nukleotidy, sacharidy, aminokyseliny, lipidy, vitaminy a kofaktory a metabolismus glykanu) přímo z transkriptomických dat pomocí genomu. zmenšené modely lidského metabolismu. Přesněji řečeno, výpočet relativní aktivity metabolického úkolu (tj. skóre metabolického úkolu) spoléhá nejprve na předběžné zpracování dostupných transkriptomických dat a přiřazení skóre genové aktivity pro každý gen (67). Model lidského metabolismu v měřítku genomu se dále používá k identifikaci seznamu reakcí potřebných ke splnění každého metabolického úkolu a tím k identifikaci seznamu genů, které mohou přispět k získání metabolické funkce na základě pravidel GPR (tj. , pravidla Gene Protein Reaction). Proto se skóre metabolického úkolu vypočítá jako průměrné skóre aktivity všech genů přispívajících k metabolické funkci. Díky tomu lze transkriptomická data přímo použít ke kvantifikaci relativní aktivity každé metabolické funkce v konkrétním stavu.

In vitro transportní testy

Lidské embryonálníledvina(HEK)-293 buňky, které stabilně nadměrně exprimují lidský OAT1 a OAT3 (Solvo Biotechnology), byly pěstovány do konfluence v Dulbeccově modifikovaném Eagle'sMedium (Invitrogen) doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra a 1 procentem penicilinu/streptomycinu a udržovány v 5 procenta CO2 při 37 °C. Buňky exprimující OAT1- byly selektovány v přítomnosti blasticidinu a buňky exprimující OAT3- byly selektovány v přítomnosti puromycinu. Obě buněčné linie byly testovány negativně na kontaminaci Mycoplasma. Před funkčními testy byly buňky naneseny na 96-jamkové destičky, inkubovány po dobu 24 hodin a doplněny médiem. Experimenty s kompetitivním vychytáváním byly prováděny inkubací buněk v roztoku pufru s pevnou koncentrací 10 μM6-karboxyfluoresceinu a sériově zředěnou koncentrací navrhovaného substrátu začínající na 2 mM. Pufr byl odstraněn po 10-minutové inkubaci při teplotě místnosti a buňky byly třikrát promyty DPBS. Fluorescence FL pak byla hodnocena pomocí čtečky fluorescenčních destiček FL. Hodnoty IC50 byly stanoveny pomocí GraphPad Prism 8.

Hodnoty intenzity fluorescence byly normalizovány tak, že nejnižší hodnota byla nastavena na 0 procent a nejvyšší hodnota byla nastavena na 100 procent . Po normalizaci byla data přizpůsobena nelineárnímu modelu a IC50 byla určena pomocí rovnice 2.

Ki byla poté vypočtena pro každý metabolit pomocí Cheng-Prusoffovy rovnice (rovnice 3), přičemž Km pro buňky hOAT1 HEK293 odvozené z předchozích experimentů (68).

Dostupnost dat

Všechny relevantní metabolomické údaje jsou obsaženy v článku a doplňkovém materiálu. Transkriptomická data jsou k dispozici na vyžádání od snigam@health.ucsd.edu. hypotézu, dohlížel na projekt, navrhoval experimenty a psal a upravoval článek.

Financování a další informace—Tato práce byla podpořena grantem od National Institutes of Health (NIH) pro SKN od National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (R01GM132938). Podpora pro JCG pochází z grantu na školení uděleného Národním institutem biomedicínského zobrazování a bioinženýrství (NIBIB) (T32EB009380) a dodatkem k R01GM132938. Tato práce byla částečně financována štědrým financováním od NIGMS pro NEL (R35GM119850), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) pro NEL (UH2AI153029), stipendiem LIFA pro AR a stipendiem pro JMG od vlády Mexika ( CONACYT) a Institut Kalifornské univerzity pro Mexiko a Spojené státy (UC-MEXUS). Za obsah zodpovídají výhradně autoři a nemusí nutně představovat oficiální názory NIH. Některé obrázky byly vytvořeny pomocí Biorendru. Tento článek je věnován památce Vibha Bhatnagar, MD, MPH.

Střet zájmů—Autoři prohlašují, že nejsou v žádném střetu zájmů s obsahem tohoto článku.

Zkratky—Použité zkratky jsou: AhR, aryl uhlovodíkový receptor; CKD, chronicledvinachoroba; DMI, interakce lék-metabolit; ESI, elektrosprejová ionizace; HEK, lidský embryonálníledvina; ILA, kyselina indoloctová; KO, knockout; RP/UPLC/MS, ultravýkonná kapalinová chromatografie na reverzní fázi – hmotnostní spektrometrie.

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Z 1Katedry bioinženýrství, 2Katedry pediatrie, 3Katedry biologie, 4Katedry biostatistiky a bioinformatiky, Kliniky rodinného lékařství a veřejného zdraví, 5Katedry rodinné a preventivní medicíny, 6NovoNordisk Foundation Center for Biosustainability na UC San Diego of, 7Depart Medicine Kalifornská univerzita SanDiego, La Jolla, Kalifornie, USAUpraveno

od Mike Shipston

Reference

1. LopezNieto, CE, You, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR a Nigam, SK (1997) Molekulární klonování a charakterizace NKT, genového produktu souvisejícího s rodinou transportérů organických kationtů, která je téměř výhradně vyjádřeno vledvina. J. Biol. Chem. 272, 6471–6478

2. Brady, KP, Dushkin, H., Fornzler, D., Koike, T., Magner, F., Her, H., Gullans, S., Segre, GV, Green, RM a Beier, DR (1999 ) Nový domnělý transportér mapuje mutaci osteosklerózy (oc) a není exprimován v OC mutantní myši. Genomika 56, 254–261

3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E. a Schwab, M. (2012) Organické aniontové transportéry a jejich implikace ve farmakoterapii. Pharmacol. Rev. 64, 421–449

4. Ahn, SY a Bhatnagar, V. (2008) Aktualizace molekulární fyziologie transportérů organických aniontů. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 17, 499-505

5. Nigam, SK (2018) Rodina transportérů SLC22: paradigma pro vliv transportérů léků na metabolické dráhy, signalizaci a onemocnění. Annu. Rev. Pharmacol. 58, 663–687

6. Lowenstein, J. a Grantham, JJ (2016) Znovuzrození zájmu o renální tubulární funkci. Dopoledne. J. Physiol. Renal 310, F1351–F1355

7. Govindarajan, R., and Sparreboom, A. (2016) Drogové transportéry: Pokroky a příležitosti. Clin. Pharmacol. Ther. 100, 398-403

8. You, GF, and Morris, ME (2014) Předmluva. In Drug Transporters Molecular Characterization and Role in Drug Disposition, 2nd Edition. Wiley Ser Drug Disc, Hoboken, NJ. Xix

9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, MP, Blantz, RC a Bhatnagar, V. (2015) Manipulace s drogami, metabolity a uremickými toxinyledvinatransportéry léčiv pro proximální tubuly. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2039–2049

10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX a Nigam, SK (2016) Analýza ABCG2 a dalších urátových transportérů v kyselině močové homeostáze u chronickýchledvinanemoc: Potenciální role dálkového průzkumu Země a signalizace. Clin.ledvinyJ. 9, 444–453 Role OAT1 a OAT3 v metabolismu tryptofanu

12 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575

11. Nigam, SK a Bhatnagar, V. (2018) Systémová biologie přenašečů kyseliny močové: Úloha dálkového průzkumu Země a signalizace. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 27, 305–313

12. Nigam, SK a Bush, KT (2019) Uremický syndrom chronickýchledvinanemoc: Změněný dálkový průzkum Země a signalizace. Nat. Rev. Nephrol. 15, 301–316

13. Saito, H. (2010) Patofyziologická regulace renálních transportérů organizace SLC22A u akutníchledvinaporanění: Farmakologické a toxikologické důsledky. Pharmacol. Terapeut. 125, 79–91

14. Lepist, EI a Ray, AS (2017) Beyond drug-drug treatment: Účinky inhibice transportéru na antibiotika, živiny a toxiny. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 13, 1075–1087

15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Welsh, WJ, and You, GF (2012) Silné inhibitory lidských transportérů organických aniontů 1 a 3 z klinických lékových knihoven: Objev a molekulární charakterizace . Mol. Pharmaceut. 9, 3340–3346

16. Evers, R., Piquette-Miller, M., Polli, JW, Russel, FGM, Sprowl, JA, Tohyama, K., Ware, JA, de Wildt, SN, Xie, W., Brouwer, KLR a Konsorcium, IT (2018) Změny v transportérech léků související s nemocemi mohou ovlivnit farmakokinetiku a/nebo toxicitu léků: Bílá kniha od International Transporter Consortium. Clin. Pharmacol. Ther.104, 900–915

17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH, and Lowenstein, J. (2014) Theledvinaa odstranění uremického toxinu: Glomerulus nebo tubulus? Semin. Nephrol. 34, 191–208

18. Liu, Y., Prentice, KJ, Eversley, JA, Hu, C., Batchuluun, B., Leavey, K., Hansen, JB, Wei, DW, Cox, B., Dai, FHF, Jia, WP a Wheeler, MB (2016) Rychlé zvýšení CMPF může působit jako bod zlomu ve vývoji diabetu. Cell Rep. 14, 2889–2900

19. Prentice, KJ, Luu, L., Allister, EM, Liu, Y., Jun, LS, Sloop, KW, Hardy, AB, Wei, L., Jia, WP, Fantus, IG, Sweet, DH, Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF a Wheeler, MB (2014) Metabolit furanové mastné kyseliny CMPF je u diabetu zvýšený a vyvolává dysfunkci beta-buněk. Cell Metab. 19, 653–666

20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R. a Nigam, SK (2020) Analýza systémové biologie odhaluje osm podskupin transportérů SLC22, včetně OAT, OCT a OCTNs.Int. J. Mol. Sci. 21, 1791