Komplexní profilování sekretomových přípravků z fetálních a perinatálních kmenových buněk lidské plodové vody, část 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní:Již dříve jsme uvedli, že kmenové buňky odvozené z c-KIT plus htaman z amniotické tekutiny získané ze zbylých vzorků rutinní prenatální diagnostiky v Ⅱ trimestru (fetální hAFS) mají regenerační parakrinní potenciál, který podporuje přežití, antifibrotické a proliferativní účinky. mohou být také izolovány ze vzorků klinického odpadu v III. trimestru během plánovaných císařských řezů (perinatální hAFS), což nabízí snáze dostupnou alternativu ve srovnání s fetálním hAFS. Nicméně o parakrinním profilu perinatálního hAFS je známo jen málo. Zde poskytujeme podrobnou charakterizaci celkového sekretomu hAFS (tj. všech rozpustných parakrinních faktorů uvolněných buňkami v kondicionovaném médiu, hAFS-CM) a extracelulárních vezikul ( hAFS-EVs) v něm, z perinatálních buněk Ⅱtrimestru fetální versus III trimestr. Fetální a perinatální hAFS byly charakterizovány a podrobeny hypoxickému předkondicionování, aby se zvýšil jejich parakrinní potenciál. Formulace hAFS-CM a hAFS-EV byly analyzovány na obsah proteinů a chemokinů/cytokinů a náklad EV byl dále zkoumán sekvenováním RNA. Fenotyp fetálního a perinatálního hAFS spolu s jejich odpovídajícími sekretomovými formulacemi se překrývaly; přesto fetální hAFS vykazoval nezralou oxidativní fosforylační aktivitu ve srovnání s perinatálními. Profilování jejich parakrinního nákladu odhalilo určité rozdíly podle gestačního stadia a hypoxického předkondicionování. Oba buněčné zdroje poskytly formulace obohacené o neurotrofické, imunomodulační, antifibrotické a endoteliální stimulační faktory a nezralý fetální sekretom hAFS byl definován výraznějším pro-vaskulogenním, regeneračním, pro-rozlišujícím a anti-aging profilem. Malé profilování RNA ukázalo obohacení mikroRNA ve fetálním i perinatálním nákladu hAFS-EV se stabilně exprimovaným pro-rozlišovacím jádrem jako referenčním molekulárním podpisem. Zde potvrzujeme, že hAFS představuje přitažlivý zdroj regeneračních parakrinních faktorů; výběr fetálních nebo perinatálních formulací sekretomů hAFS pro budoucí parakrinní terapii by měl být zhodnocen s ohledem na konkrétní klinický scénář.

klíčová slova:plodová voda; kmenové buňky; parakrinní účinky; extracelulární vezikuly; buňkou upravené médium; chemokin; cytokiny; proteomika; sekvenování RNA; mikroRNA

Kliknutím sem se dozvíte více

1. Úvod

Regenerativní medicína se v poslední době rozvinula jako nově vznikající obor poskytující funkční obnovu poraněné tkáně pomocí několika strategií. Jak přístupy tkáňového inženýrství v posledních letech výrazně pokročily, výzkum parakrinních účinků kmenových buněk se současně stále více zintenzivňuje. Obecně se ukázalo, že terapeutický potenciál transplantovaných kmenových buněk je většinou zprostředkován jejich sekretovanými rozpustnými faktory, které mohou organizovat proregenerativní mikroprostředí v hostitelské tkáni a zároveň spouštět aktivaci endogenních mechanismů funkční obnovy [1,2]. Proto sekretom kmenových buněk, který zahrnuje všechny parakrinní trofické molekuly uvolňované buňkami, stejně jako membránově vázané extracelulární vezikuly, byly stále více navrhovány jako inovativní terapeutický léčivý přípravek v mnoha nezávislých předklinických studiích zaměřených na kardiovaskulární, neurologické a/nebo zánětlivé choroba. V souladu s tím lze kmenové buňky považovat za biologické továrny na využití jejich terapeutického sekretomu tím, že nabízejí regenerační ošetření připravené k použití a běžně dostupné. Aplikací takové strategie založené na buňkách, avšak bez buněk, lze překonat mnoho omezujících aspektů spojených s kanonickou buněčnou terapií, přičemž je stále možné zajistit příznivé účinky.co je cistancheV této perspektivě byly mezenchymální stromální buňky (MSC) rozsáhle testovány jako předpokládaní buněční kandidáti? MSC a kmenové/progenitorové buňky byly vytvořeny a/nebo stimulovány různými prekondicionačními strategiemi, aby se zvýšila jejich regenerační kapacita a sekreční potenciál [3,4] s explicitním zájmem o biologickou relevanci jejich secernovaných extracelulárních vezikul (EV).

EV jsou částice o nano velikosti ohraničené lipidovou dvojvrstvou a aktivně vylučované všemi typy buněk. EV zahrnují velmi malé (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); fungují jako kritické biologické přenašeče mezibuněčné signalizace tím, že doručují svůj molekulární náklad z rodičovské buňky k odpovědi/cílové [5,6]. Vzhledem k tomu, že jejich zvláštní parakrinní potenciál ve vyvíjení příznivých účinků je srovnatelný s jejich původními buňkami, se EV s kmenovými buňkami objevily jako atraktivní terapeutické možnosti v preklinických modelech onemocnění, jako je ischemie, zánět nebo poranění, jak je podrobně uvedeno v [{{3 }}]. Z translačního hlediska jsou kromě modulačního potenciálu buněk klíčovými aspekty ideálního zdroje terapeutických EV a rozpustných faktorů také proveditelnost izolace a zvýšená sebeobnova. V takovém scénáři mohou fetální a perinatální MSC nabídnout zajímavou možnost vzhledem k jejich proliferačnímu potenciálu a vývojově nezralému profilu s přechodnými rysy mezi embryonálními a dospělými somatickými progenitory [10,11]. Fetální MSC lze izolovat z extraembryonálních příloh během gestace jako zbylý vzorek získaný během prenatálního screeningu (tj. choriové klky [12-14] a plodová voda [15,16]) nebo získat jako perinatální progenitory při narození, z klinického odpadu (tj. amniotické a placentární membrány [17-21], složky pupeční šňůry [22-24] a termín plodová voda [25,26]).

Cistanche může proti stárnutí

Zejména kmenové buňky lidské plodové vody (hAFS) byly zdůrazněny jako slibné terapeutické strategie v regenerativní medicíně. a bylo prokázáno, že jsou široce multipotentní in vitro a in vivo [16,27,28], přispívají k hematopoetické linii po transplantaci in utero [29] a přihojení do poraněných orgánů, přičemž mají imunomodulační účinky [26,30] a aktivují endogenní reparativní odpovědi, jak je podrobně popsáno v [31]. Náš tým a další dále prokázali, že hAFS uvolňuje sekretom vysoce obohacený o bioaktivní trofické molekuly schopné zacílit různé reparační mechanismy. Bylo popsáno, že parakrinní faktory hAFS poskytují stimuly pro přežití se zhášením zánětu [32], poskytují kardioprotekci proti dlouhodobé ischemii [33,34] a kardiotoxicitu [35] a stimulují lokální angiogenezi s opětovným vstupem do buněčného cyklu kardiomyocytů [ 34,36]. Protože se ukázalo, že většina z těchto účinků je rekapitulována samotným podáváním hAFS-EV, nezávislé studie se zaměřily na rozbor jejich regeneračního profilu na různých patologických pozadích, včetně poškození kosterního a srdečního svalu, onemocnění ledvin, osteoartrózy, osteoporózy, nekrotizující enterokolitidy a neurodegenerativní modely [34,37-44].

I když důkazy mohou podporovat klinickou translaci hAFS-EV pro budoucí parakrinní terapii, je důležité vzít v úvahu, že většina těchto studií zkoumala především modulační potenciál fetálního hAFS získaného během Ⅱ trimestru prenatálního screeningu Skutečně, úplný profil sekretomu z perinatální má protějšek (tj. císařské řezy z III. trimestru) dosud nebylo podrobně prozkoumáno. Perinatální hAFS ve třetím trimestru prokázaly výrazné imunitní regulační vlastnosti ve srovnání s těmi v me- a II-trimestru [26], při zachování relevantního endoteliálního regeneračního potenciálu [25].kolik cistanche vzítZa zmínku stojí, že nedávná zpráva o heterogenní morfologii fetálních hAFS[45] poskytla nový pohled na jejich kmen a profil genové exprese.bioflavonoidyTo zcela vrhlo nové světlo na regenerační hodnotu různých buněčných frakcí hAFS[46]. Komplexní charakterizace různých subpopulací hAFS proto přitahuje rostoucí pozornost. Již dříve jsme uvedli, že 24hodinová hypoxická a bezsérová stimulace představuje účinnou strategii k posílení parakrinního potenciálu fetálního hAFS ve Ⅱ trimestru [34,35,37]. Protože o složení sekretomu z hAFS III trimestru je známo jen málo, zde uvádíme komplexní srovnání hAFS v Ⅱ versus Ⅲ trimestru a jejich frakcí sekretomů (včetně klobouků-EV), abychom se zabývali vlivem gestačního stadia a hypoxických buněk preconditioning na buněčných a sekretomových charakteristikách.

2. Výsledky

2.1. Perinatální hAFS představuje blízkou fenotypovou shodu s fetálním has

Nebyl zjištěn žádný statisticky významný rozdíl ve věku dárce mezi vzorky plodové vody v Il trimestru plodu a v perinatálním III trimestru. Fetální c-KIT* hAFS (f-hAFS ze vzorků plodové vody II trimestru) a perinatální c-KIT* hAFS (p-hAFS z klinického odpadu plodové vody III trimestru) potvrdily podobné rysy s fibroblasty podobnou a oválnou kulatou morfologií (obrázek 1A) a mezenchymální stromální fenotyp (data nejsou uvedena), jak bylo dříve uvedeno [16,25]. Jak f-hAFS, tak p-hAFS kultivované in vitro až do pasáže 5 vykazovaly zanedbatelné úrovně stárnutí z aktivace- -galaktosidázy (SA- -Gal) spojené se stárnutím asi u 4 procent buněk (obrázek 1B) . Jak f-hAFS, tak p-hAFS vykazovaly vysokou úroveň společné exprese mezenchymálních markerů CD107a a CD146, o kterých bylo nedávno publikováno, že definují vysoce sekreční fenotyp [47]. CD107at CD146* buňky představovaly většinu populace f-hAFS (přibližně 64 procent,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Obrázek 1. Fetální a perinatální mají fenotypové hodnocení. (A) Reprezentativní snímky fetálního hAFS (f-hAFS, levý panel) a perinatálního hAFS (p-hAFS, pravý panel) kultivovaných in vitro za standardních podmínek; měřítko: 20}0 um. (B) Analýza senescentního markeru beta-galaktosidázy (SA- -Gal, modře) pomocí cytochemického barvení na f-hAFS a p-hAFS po 5 pasážích v kultuře; reprezentativní obrázky jsou uvedeny v levém panelu, měřítko: 200 um. Odpovídající procento -Gal-pozitivních buněk/pole je uvedeno v grafu v pravém panelu (f-hAFS:4,12±0,58 procenta a p-hAFS:3,88±2,10 procenta;p=0.1424,n{ {24}} experimenty). (C) Imunofenotyp hAFS exprimující CD146 a CD107a mezenchymální markery. Reprezentativní grafy průtokové cytometrie f-hAFS a p-hAFS (levý panel) a odpovídající hodnoty vztahující se k dvojitě pozitivním buňkám CD107a plus CD146 plus; CD107a plus CD146* f-hAFS:63,68±5,82 procenta,*p=0,016v porovnání se zbývajícímg36,32±5,82 procenta f-hAFS (jiné);CD107atCD146 plus p-hAFS:52,07±47,76 procent se zbývajícími 93±56,76 procent p-hAFS (jiné); CD107a plus CD146 plus f-hAFS vs. CD107a plus CD146 plus p-hAFS p=0.2403,n=4 experimentů. Jiné: celkové množství zbývajících CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS a CD107 na CD146-hAFS. Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± sem nezávislých experimentů. SA- -Gal: Galaktosidáza spojená se senescencí{75}.

2.2. Fetální hAFS vykazuje odlišný metabolismus od perinatálního hAFS

Pro vyhodnocení, zda gestační stadium může ovlivnit mitochondriální metabolismus, byly f-hAFS a p-hAFS analyzovány ve standardních kultivačních podmínkách in vitro pomocí biochemických analýz. Hodnocení aerobního metabolismu ukázalo, že rychlost spotřeby kyslíku (OCR) a syntéza ATP byly nižší u f-hAFS ve srovnání s p-hAFS, obojí při stimulaci pyruvátem plus malátem (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Hypoxická příprava neovlivňuje fetální a perinatální životaschopnost a udržuje jejich sekreční aktivitu

Aby se definovaly formulace sekretomu hAFS, byly buňky kultivovány v podmínkách bez séra, aby se zabránilo jakékoli kontaminaci z FBS. Již dříve jsme ukázali, že 24h bezsérové ​​(SF) a 1% O2 hypoxické kultivační podmínky významně nezměnily životaschopnost Ⅱtrimestrálního fetálního hAFS (f-naděje), zatímco podporovaly uvolňování regeneračních parakrinních faktorů v jejich buněčně upraveném médiu. (hAFS-CM) a v extracelulárních vezikulách (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Zde jsme kromě profilování frakcí sekretomu p-hAFS poprvé hodnotili, zda p-vykazovaly podobné chování ve stejném režimu předběžné úpravy s použitím normoxických podmínek kultivace jako kontroly. Životaschopnost f-hAFS a p-hAFS byla analyzována po 24 hodinách v následujících nastaveních: normoxický (20 procent O2) stav v kultivačním médiu kompletní kontroly (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo a Ctrl p-hAFSnormo), normoxický stav v médiu SF (SF f-hAFSnormo a SF p-hAFSnormo), hypoxický (1 procento O2) stav v kompletním kontrolním médiu (Ctrlf-má hypo a Ctrl p-hAFSnypo) a hypoxický stav v SF médiu (SF f-má hypo a SF p -má hypo, obrázek 3A). Potvrdili jsme, že životaschopnost f-má se nezměnila v podmínkách Ctrl i SF a při hypoxické stimulaci, přičemž více než 80 procent (až téměř 88 procent) celkových buněk nebylo ovlivněno. Časné a pozdní apoptotické buňky se pohybovaly od ca. 13 až 18 procent v podmínkách SF, bez jakékoli statisticky významné relevance. Podobně perinatální životaschopnost byla v rozmezí 80-92 procent a časné a pozdní apoptotické buňky představovaly až 18 procent v podmínkách SF. p-hAFS byly okrajově ovlivněny pouze za kombinovaných hypoxických a SF podmínek; skutečně, zatímco předkondicionování neovlivnilo přežití buněk, když byly p-hAFS kultivovány v kompletním médiu, odpovídající stav SF vykazoval zvýšení o cca. 4-přehnout (* str<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Obrázek 2. Metabolická charakterizace fetálního a perinatálního AFS. (A) Rychlost spotřeby kyslíku (OCR), syntéza ATP prostřednictvím F1-F.ATP syntázy a poměr P/O v f-have a-have v přítomnosti pyruvátu plus malátu (P/M) nebo sukcinátu (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustrálieSrovnání procenta inhibice OCR a syntézy ATP u f-a-hAFS v důsledku výše uvedených inhibitorů je uvedeno ve spodním panelu B. Pro experimenty OCR: hAFS plus Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Poté jsme hodnotili výtěžek sekretomových frakcí získaných z f-hAFS versus p-hAFS na základě obohacení proteinů. Celkový obsah má sekretom, protože celek parakrinních faktorů sekretovaných buňkami je zde reprezentován hAFS-CM. Koncentrace proteinu f-hAFS-CM a p-hAFS-CM v médiu SF po předkondicionování hypoxických buněk vs. kontrolní normoxický stav jako výchozí hodnota (jmenovitě f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo a p -hAFS-CMHypo,) byl hodnocen BCA testem a měřen jako na 10§ buněk.cistanchZískané výsledky naznačují, že f-has-CM a p-hAFS-CM vykazovaly stejně pozitivní trend v obohacení proteinů po hypoxické primární aktivaci (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 buňky stupně;p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 buňky stupně） oproti jejich normoxickým protějškům (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 ug/10 stupňů buněk; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 stupňů buněk） Podobně byla koncentrace povrchových proteinů hAFS-EVs měřena v f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo a p-hAFS-EVShypo EV vykazovaly srovnatelný výtěžek, když byly získány z f-hAFS nebo p-hAFS. Pokud jde o formulace hAFS-CM, pozitivní trend ve zvýšení obsahu proteinů u f-hAFS-EV a p-hAFS. EV byly oceněny po hypoxické stimulaci během odpovídající normoxický stav （f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 stupňů buněk a p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 stupňů buněk;f-have-EVsnormo∶1,28±0,36 ug/10 stupňů buněk -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 stupňů buněk, obrázek 3C).

2.4. Fetální a perinatální HAFS uvolňující EV s analogickou morfologií a distribucí velikosti

Morfologická analýza pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM) zvýšila vysokou EV sekreční proliferace jak f-hAFS, tak p-hAFS (obrázek 4). Dále jsme zkoumali velikost a plochu f-hAFS-EV a p-hAFS-EV (obrázek 4B) po hypoxickém předkondicionování ve srovnání s normoxickou výchozí hodnotou. Fetální a perinatální uvolňovaly EV heterogenní velikosti, v rozsahu 40-250 nm, a proto zahrnují jak exozomy/malé EV, tak mikrovezikuly/vylučující se váčky. Průměrná velikost EV/pole v různých skupinách byla srovnatelná, fetální hAFS-EV naměřené 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97,10±10,10 nm) a perinatální naměřené 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94,60±19,53 nm; p-hAFS-EVShypo:76,43±4.86 nm, obrázek 4B, levý panel). Pokud jde o výtěžek, hAFS stimulovaný v hypoxii vykazoval pozitivní trend v nárůstu množství malých EV, i když tento nárůst nebyl statisticky významný. f-hAFS-EVStypo naměřil 40-70 nm, což byl téměř dvojnásobek ve srovnání s jejich normoxickým protějškem. Perinatal-has-EVSHypo, které naměřily 40-70 nm, 70-100 nm a 100-130 nm, byly téměř trojnásobné ve srovnání s hodnotami získanými v normoxické kultuře (obrázek 4B).

Analýza sledování nanočástic (NTA) ukázala zvýšený počet částic v přípravcích f-hAFS-EV i p-hAFS-EV a potvrdila nárůst EV v hypoxických vzorcích, jak bylo také pozorováno z předchozích analýz (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'částice/10 buňky stupně; f-have-EVshypo: 3,30±0,22×10 stupňů částice/10stupňové buňky ;p-hAFS-EVsnormo:2,43±0,80×10 stupňů částice/10 stupňů buněk;p-hAFS-EVshypo:3,05±0,62×10 stupňů částice/10 stupňů buněk, obrázek 4C).

Obrázek 4. Morfologická charakterizace fetálních a perinatálních EV. (A) Reprezentativní snímky transmisní elektronové mikroskopie (TEM) f-hAFS a p-hAFS (horní a dolní levý panel, v tomto pořadí, s černými šipkami označujícími intracytoplazmatická multivezikulární tělíska s malými EV/exozomy v nich) a f -hAFS-EVs a p-hAFS-EVs (horní a dolní pravý panel, v tomto pořadí) uvolněné v podmínkách bez séra a za normoxického versus hypoxického předběžného kondicionování (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; a f-hAFS-EVshypo, v tomto pořadí), měřítka: 200 nm. (B)Levý panel: TEM analýza distribuce velikosti hAFS-EVs; pravý panel: bylo uvažováno rozložení počtu f-hAFS-EV a p-hAFS-EV na pole velikosti intervalů od 40 nm do 250 nm; hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± sem z n=3 nezávislých experimentů. (C) Analýza sledování nanočástic pro velikost a distribuci hAFS. Levý panel: reprezentativní obrázek grafického výstupu; pravý panel: koncentrace hAFS-EVs měřená jako 10stupňové částice na 10stupňové sekreční buňky; nm: nanometr; ml: mililitr.

2.5. Proteomická charakterizace fetálního vs. perinatálního hAFS zdůrazňuje rozdíly ve složení jejich sekretomů podle gestačního věku a hypoxické předkondice

Proteomická charakterizace jak f-hAFS, tak i p-hAFS sekretomových formulací byla provedena pomocí platformy bez štítků shotgun, založené na spojení nano kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (nLC-HRMS). Čtyřicet osm proteomických profilů bylo získáno duplicitní analýzou tří biologických replikátů hAFS-CM a have-EVs z f-hAFS a p-hAFS podstupujících hypoxické předkondicionování buněk ve srovnání s normoxickým stavem jako kontrolou. Bylo identifikováno celkem 4179 odlišných proteinových skupin s alespoň jedním unikátním peptidem a s molekulovou hmotností v rozmezí od 2 do 3900 kDa a izoelektrickými body od 3,6 do 13. Vyšší průměrná proteinová exprese v hAFS-EVs byla pozorována ve srovnání s hAFS-CM . Porovnání všech získaných seznamů proteinů bylo provedeno na základě identifikovaných proteinů. Pro každou experimentální podmínku byl vytvořen jedinečný seznam normalizující a zprůměrující[50] hodnoty shody peptidového spektra (PSM) připisované proteinům, které představují počet hmotnostních spekter přiřazených ke každému a nepřímo reprezentují jejich množství ve vzorcích. Úplný seznam proteinů identifikovaných ve formulacích hAFS-CM a have-EV je uveden v tabulce S1.

Aplikace lineární diskriminační analýzy (LDA[51]) na tomto hlavním seznamu umožnila extrakci statisticky významných proteinů (fratio větší nebo rovno 4,5 a** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 ve formulacích hAFS-CM a have-EV posuzovaných samostatně. Zatímco asi 69,5 procenta a 69,9 procenta proteinů bylo rozděleno mezi podmínky hAFS-EV a hAFS-CM, zbývající obsah se zdál výlučný v různých poměrech, v rozmezí od 3,7 procenta do 13,4 procent, mezi formulacemi.

Ke kvantitativnímu zkoumání proteomických změn byla provedena diferenciální analýza bez označení pomocí podomácku vyrobeného softwaru MAProMa a použitím dvou algoritmů, DAve (Differential Average) a DCI (Differential Confidence Index, reprezentující poměr a spolehlivost diferenciálního vyjádření, v tomto pořadí), na PSM každého jednotlivého proteinu mezi dvěma porovnávanými termíny. Použití přísných filtrů pro DAve a DCI k maximalizaci spolehlivosti identifikace a zvážení proteinů s variací větší než násobek změny 1,5, párové srovnání f-hAFS-CM versus p-hAFS-CM a f-hAFS-EVs versus p-hAFS-EV byly vyrobeny podle buněčného gestačního stadia. Bylo nalezeno celkem 58 a 109 proteinů odlišně exprimovaných ve výše uvedených kompartmentech has-CM a have-EV (obrázek S1B, C pro vybrané podrobnosti a tabulky S2-S3 v rozšířené formě). Mezi nimi bylo 30 proteinů up-regulováno v f-hAFS-CM a 28 bylo up-regulováno v p-hAFS-CM (obrázek S1B); podobně 44 odlišných proteinů vedlo k upregulaci u f-have-EV a 65 bylo up-regulováno v p-hAFS-EV (obrázek S1C). Zejména proteiny, které vedly k up-regulaci v f-have, je třeba považovat za down-regulované v p-has a naopak.

jsou uvedeny hodnoty; viz Tabulka S2 pro úplný seznam a podrobné parametry uváděných proteinů. (C) Analýza obohacení biologických procesů proteinů identifikovaných s frekvencí alespoň 2 ve fetálním hAFS-CM (levý panel) a perinatálním have-CM (pravý panel) podle hypoxického předkondicionování buněk. Na základě nástroje FunRich jsou termíny genové ontologie zobrazeny ve sloupcových grafech udávajících procento genů obohacených pro každou kategorii (růžové sloupce pro-have-CMnormo, fialové sloupce pro f-hAFS-CMhypor světle modré sloupce pro p-hAFS-CMnormo, a modré kuličky pro p-hAFS-CMhypo).koupit cistanchePouze termíny genové ontologie s Bonferroni korigované pomocí*p<0.05 are="">

Tento článek je převzat z Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms