Analýza složení a imunologické aktivity oligosacharidů izolovaných z Cistanche Deserticola

Jak zlepšit paměť bez léků?

Pro více informací prosím kontaktujteali.ma@wecistanche.com

Ying Bai1, Hai-yan Li1, Shi-xian Chen1 1College of Food Science And Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Čína

Abstraktní:Oligosacharid (CDOS) byl získán zCistanche deserticolaextrakcí alkálií (pH {{0}}), srážením ethanolem a frakcionací na dvě purifikované frakce (tj. CDOS-1 a CDOS-2) pomocí Sephadexu G-100 a Sephadex G-25 kolonová filtrační chromatografie. Monosacharidové složení CDOS bylo testováno vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Bylo zjištěno, že CDOS-1 se skládal pouze ze sacharózy a CDOS-2 se skládal hlavně ze sacharózy, rhamnózy a mannitolu, s molárním poměrem 1:0,73:3,61. Imunologické testy ukázaly, že CDOS vykazuje významný účinek na index myší sleziny, zvyšuje aktivitu fagocytózy makrofágů a stimuluje proliferaci buněk produkujících protilátky. Očekává se, že CDOS se rozvine ve funkční potraviny nebo léky.

klíčová slova:Cistanche deserticola, oligosacharid, purifikace, složení, imunologické aktivity.

Kliknutím zobrazíte produkty s obsahem extraktu cistanche

1. Úvod

Cistanche deserticolaYCMa.(RodinaOrobanchaceae) je krátká parazitická rostlina pocházející ze severozápadu Číny. Celá sušená rostlina (bez květů) je známá jako tonikum a nazývá se „Rou Congrong".V orientální medicíně je klasifikován jako chuťově sladký a slaný, teplé povahy a připisuje se kanálkům ledvin a tlustého střeva, s funkcí povzbuzení ledvin a doplnění esence, zvlhčení střeva a uvolnění střev [1] -[3]. Moderní farmakologická studie ukázala, že může urychlit syntézu DNA a oddálit proces senility, zvýšit antioxidační [4], předcházet a léčit kardiovaskulární onemocnění [3]. -zánětlivé účinky [5], zlepšují učení a paměť indukcí nervových růstových faktorů.Některé studie to ukázalyC. deserticola extrakty by mohly aktivovat fagocytární funkci intraabdominálních makrofágů u myší [7]-[9] a posílit imunitu těla. Podle předchozích studií tato rostlina obsahuje více aktivních složek, které zahrnují fenylethanoidní glykosidy, iridoidy, lignany, sacharidy, alkaloidy atd. [11]C. deserticola fenylethanoidové glykosidy a polysacharidy jsou uznávány jako hlavní aktivní složky, řada studií se v posledních desetiletích zaměřila na jejich struktury a biologické aktivity [12]-[17]. Pokud jde o cenné oligosacharidy vC. deserticola, zprávy jsou poměrně omezené. Oligosacharidy, sacharid s krátkým řetězcem obsahující homo- nebo hetero-cukry, jsou dobře známé pro své příznivé účinky na lidský život a jsou již dlouhou dobu široce využívány [18]. Funkční oligosacharidy, které mají fyziologickou funkci, jako je nízká kariogenita a růstový faktor bifidobakterií [19], zlepšují zdraví lidí a zvířat. Používaly se jako potravinová složka. Nedávno byly popsány nové funkce oligosacharidů, které mají schopnost modulovat imunitní systém u lidí, zvířat a ryb [20]. V tomto článku uvádíme první část výsledků výzkumného programu, frakcionaci z celkových oligosacharidů získaných z alkalického extraktuC. deserticolakombinací ultrafiltrace a gelové permeační chromatografie a analýzou jejich složení pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Kromě toho také prezentujeme imunologické aktivityC. deserticolaoligosacharidy. Pokud je nám známo, existuje jen málo publikovaných zpráv o studiích imunostimulační aktivityC. deserticola oligosacharidy.

2. Experimentální

2.1. Materiály

TheC. deserticola byl kultivován a sbírán z Alexa League (Vnitřní Mongolsko, Čína). Myši Kunming (Grade II, šest týdnů staré) byly zakoupeny z Farmakologického experimentálního centra Univerzity Vnitřního Mongolska. Sephadex G-100, Sephadex G-25, kyselina trifluoroctová (TFA), 1-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon (PMP), D-glukóza, D- galaktóza, D-fruktóza, D-xylóza, D-manóza, D-galakturonová kyselina, D-glukuronová kyselina, sacharóza, rhamnóza, mannitol, fukóza, rhamnóza, byly zakoupeny od Sigma (St. Louis, MO, USA). Střední RPMI{12}} bylo zakoupeno od společnosti Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, USA). Všechny ostatní chemikálie byly analytické čistoty.

2.2. Extrakce oligosacharidů

Vysušená tělaC. deserticola byly nakrájeny na menší kousky a dále rozemlety na prášek v mlýně byly extrahovány bezvodým ethanolem (3x5000 ml) při 70 stupních po dobu 3 hodin za atmosférického tlaku. K odstranění lipidů byl upevněn zpětný chladič. Zbylý zbytek byl poté třikrát extrahován alkálií (pH =10) při 60 stupních (vždy 2 hodiny). Po centrifugaci (2000 g po dobu 15 minut, při 20 stupních) byl supernatant zakoncentrován na jednu desetinu objemu v rotační odparce za sníženého tlaku při 50 stupních a zfiltrován. Poté byl filtrát deproteinován pomocí činidla Sevag [21] a odbarven aktivním uhlím.

2.3. Izolace a purifikace oligosacharidů

Lyofilizované surové oligosacharidy byly rozpuštěny v destilované vodě, odstředěny a poté byl supernatant přečištěn na koloně Sephadex G-100 (1x50 cm), ekvilibrované ultračistou vodou. Po nanesení vzorku byla kolona eluována ultračistou vodou při průtoku 5 ml/min. Různé frakce byly sbírány pomocí zkumavek. Celkový obsah sacharidů v každé zkumavce byl měřen při 490 nm pomocí fenolu-H₂TAK₄metoda [22]. Vodou eluovaný roztok byl rozdělen na dvě frakce CDOS-1 a CDOs-2. Dvě frakce byly dále purifikovány na koloně Sephadex G-25 (2,7 x 85 cm) za použití ultračisté vody (při průtoku 1 ml/min). Po shromáždění purifikované frakce byla lyofilizována.

2.4. Analýza monosacharidů složení

Monosacharidové složení CDO bylo dosaženo analýzou HPLC. CDO (2 mg) byly hydrolyzovány nejprve bezvodým methanolem obsahujícím 2 M HC1 při 80 stupních po dobu 16 hodin v atmosféře dusíku a poté 2 M TFA při 120 stupních po dobu 1 hodiny. Poté, co byla TFA odstraněna odpařením, byly hydrolyzáty následně derivatizovány pomocí PMP podle popsané metody [23] a analyzovány pomocí HPLC. HPLC separace byla provedena na systému EF-2002 HPLC (společnost KNAUER, Německo). Deriváty PMP byly chromatografovány za použití objemu Sugar-PAK (6,5 x 300 mm, glass of water company, America) a absorbance byla měřena při 245 nm. Objem nástřiku byl 20 ul a mobilní fáze, složená z PBS (rozpouštědlo A) a acetonitrilu (rozpouštědlo B), byla použita pro isokratickou eluci v objemovém poměru 82 procent (A) ku 18 procentům (B). Celková doba běhu HPLC byla 40 minut a rychlost průtoku byla 0,5 ml/min.

2.5. Imunobiologické Činnosti

2.5.1. Fagocytární funkce monocytů-makrofágů

Šedesát myší Kunming (Grade II, šest týdnů staré) bylo zakoupeno od Farmakologického experimentálního centra Univerzity Vnitřního Mongolska a před použitím byly aklimatizovány po dobu 1 týdne. Všechny myši byly náhodně rozděleny do čtyř skupin, skládajících se z kontrolní skupiny s fyziologickým roztokem, skupiny s vysokou dávkou CDO, skupiny se střední dávkou a skupiny s nízkou dávkou CDO. Myším byl intraperitoneálně injikován roztok 0,5 ml oligosacharidů jednou denně po dobu 5 dnů. Skupina s vysokou, střední nebo nízkou dávkou CDO obdržela 1 0{{10}}, 50 nebo 25 mg/kg/BW CDO, v daném pořadí; a 0,5 ml fyziologického roztoku bylo injikováno kontrolní skupině. Sedmý den byl proveden experiment clearance uhlíkových částic podle Hou [24] a byl měřen index sleziny a index brzlíku. Krátce, 0,05 ml/10 g/bw inkoustu bylo injikováno každé myši přes vena caudalis, poté bylo získáno 20 ul krve z vena orbitalis posterior 3 a 7 minut po injekci. Vzorky krve byly umístěny do zkumavek s 2 ml 0,1 procenta Na₂CO₃a hodnoty OD byly měřeny při 600 nm. Index clearance (K), fagocytární index ( ) a index imunitního orgánu byly vypočteny následovně(1), t₂a t₁znamená 7 minut a 3 minuty.

2.5.2. Buňka produkující protilátky proliferace

Skupiny myší Kunming (pět na skupinu) byly imunizovány intraperitoneální injekcí 2 x 10⁷SRBC v 1,{1}} ml PBS přidán s 50 ug testovaných materiálů (žádný v kontrole). O týden později splenocyty (10⁶buňky na 2 ml na jamku) z myší Kunming byly kultivovány s testovacími materiály nebo bez nich po dobu 72 hodin v 10% médiu RPMI 1640 pod 5% CO₂ve vzduchu, trojmo pro každou kulturu. Počet PFC proti SRBC na 10⁶byly stanoveny splenocyty.

2.6. Statistický analýza

Data byla vyjádřena jako střední hodnoty ± SD. Rozdíl mezi testovanými skupinami a kontrolou byl analyzován Studentovým t-testem. P < 0.05="" bylo="" považováno="" za="">

3. Výsledky a Diskuse

3.1. Izolace a purifikace oligosacharidů

CDO byly izolovány z alkalického extraktu vysušených tělC. deserticola o výnos 3.{14}}7 procent Dvě frakce CDOS-1 a CDOS-2 byly izolovány z eluátu destilované vody pomocí kolony Sephadex G-100 (obr. 1). Purifikované frakce CDOS-1 a CDOS-2 vykazovaly jediný pík na koloně Sephadex G-25, což ukazuje, že ve vzorku nebyly přítomny žádné další oligosacharidy. Výsledky složení monosacharidů ukázaly, že CDOS-1 se skládal pouze ze sacharózy (obr. 2) a CDOS-2 se skládal hlavně ze sacharózy, rhamnózy a mannitolu (obr. 3) s molárním poměrem z 1:0,73:3,61.

3.2. Imunobiologické aktivity CDO

Mnoho důkazů in vivo a in vitro prokázalo, že přirozené oligosacharidy vykazují imunomodulační funkci stimulací jak buněčné, tak humorální imunitní odpovědi [27], [28]. V tomto článku 100 mg/kg/bw CDO zvýšilo index myší sleziny, ale nebyly žádné významné rozdíly v indexu thymu mezi léčenými skupinami a kontrolními skupinami (tabulka 1). Makrofágy jsou důležitou složkou obrany hostitele proti virové infekci inhibicí intracelulární replikace virů a zabíjením virem infikovaných buněk [29]. Při aktivaci se z makrofágů uvolňují různé kyslíkové nebo dusíkové meziprodukty a cytokiny a účastní se různých důležitých biologických funkcí, jako jsou protizánětlivé a protinádorové aktivity [30]-[32]. Proto je fagocytární aktivita makrofágů důležitým ukazatelem imunitních funkcí organismu. V této studii střední a vysoké dávky CDO zvýšily aktivitu fagocytózy makrofágů (tabulka 1). Buněčná proliferace produkující protilátky indukovaná CDO byla studována zkoumáním zvýšení hemolytického PFC ve slezinách myší Kunming, které byly imunizovány SRBC plus testovaný vzorek. Výsledky ukázaly, že střední a vysoké dávky CDO významně zvyšují proliferaci buněk produkujících protilátky (Tabulka 2). Vysoké dávky CDO způsobily vysoce významné zvýšení počtu PFC (P <>

Reference

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Rozpoznávání smíšených biologických signálů na základě analýzy vlnek. In: Y. Jiang, et al (eds).Proč. britsko-čínského sportovního inženýrského workshopu. Liverpool: Světová akademická unie. 2007, str. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao a kol. Účinky prvků vzácných zemin na růstCistanche deserticolabuňky a produkci fenylethanoidových glykosidů.JB io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian a kol. Nový přírodní produkt odCistanche deserticolaYCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioxidační působení glykosidůCistanchev tkáni myší.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRAntinociceptivní a protizánětlivá aktivita způsobenáCistanche deserticolau hlodavců.J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Měsíc, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Oh, MSCistanches Herbazlepšuje učení a paměť indukcí nervového růstového faktoru.Behaviorální výzkum mozku. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Srovnání meziCistanche deserticolaYC Ma a C,tubulosa(Shenk) Wight na některé farmakologické akce.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ a kol. Studie zvýšení sexuální potenceC. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL a kol. Srovnání meziCistanche deserticolaYC Ma a C. tubulosa ovlivňují některé farmakologické účinky.J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Imunomodulační účinky polysachariduCistanche deserticolaYC Ma.J Zhejiang Univ, Med Sci.2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Song Yuanyuan, Zhang Hongquan. Pokroky ve výzkumu chemických složek a léčivé aktivity Cistanche.Čínské divoké rostlinné zdroje, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Izolace a identifikace fenylethanoidových glykosidů zCistanche deserticola.

Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Stanovení fenylethanoidových glykosidů vCistanche deserticolapomocí makrovezikulární pryskyřice - spektrofotometrie.Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Inhibice oxidu dusnatého fenylethanoidy v aktivovaných makrofázích.

Evropský žurnál farmakologie, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan a kol. Strukturální analýza ve vodě rozpustného polysacharidu SPA izolovaného ze stonku Cistanche Deserticola Ma.Chemický žurnál čínských univerzit, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Studium imunitní farmakologie a absorpčního charakteru polysacharidůCistanche deserticola. 2011, č. S1,Medicína a zdravotní vědy, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotektivní aktivita fenylethanoidů zCistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (vyd. The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (ed.) Proceedings of the 5^čtKonference o zubním kazu a spojovacím cukru (v japonštině), Národní institut zdraví, Tokio (1980)

[20] Kodo Otaka. Funkční oligosacharid a jeho nový aspekt jako imunitní modulace.J. Biol. Macromol. 2006, 6

(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polysacharidy z horkovodních extraktů z pražených zrn Coffea arabica: Izolace a charakterizace. Carbohydr.Polym.1999, 40:71–81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimetrická metoda pro stanovení cukrů a příbuzných látek.Anální. Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analýza monosacharidových složek v polysacharidech Angelica pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie.Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan a kol. Extrakce a čištění lektinu z červených fazolí a předběžné studie imunitní funkce lektinu a čtyř čínských bylinných polysacharidů.Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ a A. Szenberg. Další vylepšení plakové techniky pro detekci jednotlivých buněk tvořících protilátky.Imunologie.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura a kol. Imunobiologické aktivity porinové frakce izolované z Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infekce a imunita. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Imunomodulační aktivita CVT-E002: patentovaný extrakt ze severoamerického ženšenu (Panax quinque folium).J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Struktury a vztahy mezi strukturou a aktivitou tří mitogenních a komplement fixujících pektické arabinogalaktany z malijských protivředových rostlinCochlospermum tinctoriumA. Bohatý aVernonia kotschyanaSch Bip. ex Walp.Biomakromolekuly. 2006, 7:71–79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim a J.-K. Hwang, Imunomodulační aktivita Arabinogalaktanu a Fucoidanu in vitro.Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian a kol. Hodnocení a srovnání imunoregulační aktivity čtyř ve vodě rozpustných frakcí Angelica Sinensis in vitro na peritoneálních makrofázích u ICR myší.Mezinárodní imunofarmakologie. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park a kol. Exprese prozánětlivého cytokinového genu a regulace oxidu dusnatého ve vodném extraktu Astragali radix v makrofágových buňkách RAW 264.7.Journal of Ethnopharmacology. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee a YJ Jeon. Polysacharid izolovaný z Poria cocos sklerotium indukuje aktivaci NF-κB/Rel a expresi iNOS v myších makrofázích.Mezinárodní imunofarmakologie. 2003, 3(10-11):1353–1362.