Srovnání dvou diagnostických testů pro detekci sérum neutralizujících protilátek proti viru prasečí epidemie průjmu

Abstraktní:

Laktogenní imunita je důležitá pro ochranu selat proti mnoha patogenům včetně viru prasečího epidemického průjmu. Cirkulující hladiny neutralizačních protilátek v séru prasnic mohou pomoci určit, zda by detekovatelná imunitní odpověď mohla poskytnout ochranu selatům. Neutralizační protilátky lze detekovat pomocí různých diagnostických testů. Tato studie hodnotila diagnostické charakteristiky dvou neutralizačních protilátek pro protilátky neutralizující virus prasečího epidemického průjmu v séru exponovaných prasniček. Čtyři léčebné skupiny, kontrolní, nevakcinované, vakcinované před expozicí a vakcinované po expozici, se skládaly z 20 prasniček. Vzorky séra byly odebrány z každé prasničky před a po čelenži virem epidemického průjmu prasat. Vzorky byly hodnoceny na přítomnost neutralizačních protilátek pomocí fluorescenčního fokusového neutralizačního testu a vysokovýkonného neutralizačního testu. Diagnostická senzitivita a specifičnost pro fluorescenční fokus neutralizační a vysoce výkonné neutralizační testy pro tuto studii byly optimalizovány na hranici ředění 80 a 80% snížení fluorescence v daném pořadí a prokázaly střední shodu na základě kappa statistiky. Zaměření fluorescenční neutralizace a vysoce výkonné neutralizační testy mohou být použity k monitorování stavu neutralizačních protilátek u zvířat nebo populace zvířat. Vysokovýkonný test má oproti fokusovému fluorescenčnímu testu výhody v tom, že má vyšší specifitu na uvedené hranici a povaha výsledků umožňuje větší rozlišení mezi jednotlivými výsledky.

cistanche doplněk výhody-zvyšuje imunitu

Klíčová slova: PEDV; neutralizační protilátka; diagnostický test

1. Úvod

Virus prasečí epidemické diarey (PEDV) je alfakoronavirus, který se po svém objevení ve Spojených státech v roce 2013 stal endemickým v Americe [1–3]. Opatření biologické bezpečnosti se zaměřují na udržení patogenů, jako je PEDV, mimo stáda prasat, aby se zmírnil dopad onemocnění [4]. Sérologické testování je užitečným nástrojem k určení, zda prasata byla dříve vystavena patogenu a infikována tímto patogenem. K expozici může dojít přirozeně (např. pozřením virem nasyceného materiálu) nebo záměrně (např. smícháním s vylučováním secích zvířat, orální-nazální inokulací nebo výplachem žaludku). Pro účely této studie bylo expozice dosaženo záměrnou expozicí PEDV-pozitivním tkáňovým homogenátem z potvrzeného klinického vzplanutí PEDV. Song a kol. [5] prokázali, že titry neutralizačních protilátek v séru se nelišily mezi prasnicemi, kterým byla podána orální nebo intramuskulární vakcína PEDV DR13 atenuovaná Vero buňkami. Tato studie také prokázala, že orálně očkované prasnice měly nižší mortalitu selat ve srovnání s intramuskulární vakcinací. Kromě toho de Arriba a kol. [6] prokázali korelaci mezi buňkami sekretujícími protilátky IgA a IgG (ASC) v krvi a lymfatické tkáni asociované se střevem. Difuzní, epiteliochoriální placenta prasnic zabraňuje přenosu imunitních buněk a protilátek na selata in utero, což prasatům při narození způsobuje agamaglobulinemii [7]. Mateřská imunita se přenáší z prasnic na jejich selata prostřednictvím sekretů mléčné žlázy a hraje klíčovou roli v ochraně proti střevním patogenům, jako jsou PEDV, TGEV a rotavirus. Selata proto spoléhají na ochranu před těmito patogeny na mlezivo a mléčné protilátky. Sérové ​​imunoglobuliny jsou velkým přispěvatelem do kolostra, zatímco imunoglobuliny v mléce jsou produkovány v mléčné žláze [8]. Testy neutralizačních protilátek tedy mohou pomoci určit, zda detekovatelná imunitní reakce v sérech prasnic před porodem může poskytnout ochranu selatům. Mechanismy neutralizačních protilátek zahrnují agregaci, inhibici vstupu viru do cílové buňky a inhibici replikace viru v cílové buňce [9]. Pro detekci neutralizačních protilátek proti PEDV byly vyvinuty diagnostické testy, včetně virové neutralizace (VN), fluorescenční fokusové neutralizace (FFN) a vysoce výkonného neutralizačního testu (HTNT) [2,10–13]. Jak popsal Sarmento et al. [2] je test FFN vylepšením testu VN, protože test je citlivější, protože test je založen na detekci virových antigenů exprimovaných na povrchu infikovaných buněk Vero, zatímco test VN je založen na vyvolaném cytopatickém účinku. virem. Kromě toho lze výsledky FFN získat rychleji než výsledky VN, protože pozorování cytopatického účinku trvá déle ve srovnání s připojením viru k FFN. Test HTNT je dalším vylepšením testu FFN, protože test HTNT se při získávání výsledků spoléhá spíše na digitální obrazovou cytometrii než na technickou interpretaci. To umožňuje odečíst celou destičku za méně než 3 minuty, čímž se získá kvantitativní měření intenzity fluorescence a možnost ukládat snímky pro kontrolu. Zdá se tedy, že HTNT je vhodný pro použití v komerčních stádech prasat. Tato studie porovnávala diagnostické charakteristiky (senzitivita a specificita) a pozitivní a negativní prediktivní hodnoty dvou stanovení neutralizačních protilátek pro stanovení PEDV, FFN a HTNT. Toto staví na práci Sarmenta et al. [2] testováním naivních, infikovaných a očkovaných zvířat s cílem pomoci ověřit test pro použití ve vysoce výkonné diagnostické laboratoři. Na základě výsledků Sarmenta et al. [2], naší nulovou hypotézou je, že neexistuje žádný rozdíl v diagnostických charakteristikách těchto dvou testů k detekci neutralizujících protilátek proti PEDV v séru prasniček infikovaných PEDV.

cistanche doplněk výhody-zvyšuje imunitu

2. Materiály a metody

2.1. Zdroje a výběr prasat

Jak již dříve popsal Brown et al. [14], tato studie použila 4 léčebné skupiny označované jako kontrola, NV (neočkovaná), Pre (vakcinovaná před expozicí) a Post (vakcinovaná po expozici). Každá skupina byla zpočátku složena z 20 komerčních, kříženců, prasniček. Celkem 60 prasniček bylo vhodně vybráno z komerční farmy prasat v centrální Iowě, která neměla žádnou historii PEDV. 20 prasniček v kontrolní skupině bylo znovu použito pro skupinu NV. Skupina NV se skládala pouze z 18 prasat, protože dvě prasničky byly ze studie odstraněny kvůli komplikacím, které nesouvisely s PEDV provokací.

Jako další důkaz negativního stavu PEDV bylo odebráno 12 ml krve pomocí jugulární venepunkce pomocí 16-měřidla, 1,{3}} palcové jehly a 12ml injekční stříkačky. Sérum bylo odebráno ze vzorků krve centrifugací při 1500 x g po dobu 8 minut (min), rozděleno do 1 ml alikvotů a skladováno při -80 °C. Vzorky séra byly testovány pomocí wv-ELISA ve Veterinární diagnostické laboratoři Iowa State University (ISU-VDL, Ames, IA, USA) [15].

2.2. Přiřazení zvířat do léčebných skupin

Šedesát prasniček bylo rovnoměrně rozděleno do 3 skupin, každá sestávala z 20 komerčních kříženců. Pro vytvoření čtyř léčebných skupin bylo použito 20 prasniček postupně pro dvě léčebné skupiny, CONTROL a NV. Opětovné použití 20 prasniček umožnilo vývoj a kontrolu skupiny PEDV-pozitivních prasniček, které byly vystaveny PEDV, a snížilo celkový počet zvířat použitých ve studii. Zbývajících 40 prasniček zahrnovalo skupiny PRE a POST, přičemž v každé skupině bylo 20 prasniček. Časová osa událostí podle léčebné skupiny je popsána v Brown et al. [14]. Stručně řečeno, jednotlivé vzorky krve byly odebírány jednou týdně v každé léčebné skupině po expozici. Další rozpracování je diskutováno v částech 2.4 a 2.5. Ošetřovaná skupina prasniček "PRE" byla očkována před příjezdem do zařízení mimo pracoviště. Léčebná skupina "POST" prasniček nebyla vakcinována až po expozici.

2.3. Ustájení a péče o prasata

Po příjezdu do výzkumného zařízení byly prasničky ve skupině umístěny v ošetřované skupině: všech 20 prasniček v ošetřované skupině bylo v jednom kotci s ad libitním krmivem a vodou. Všechny kotce byly ve stejné místnosti. Jedno pero bylo ponecháno prázdné mezi skupinami NV PRE a POST, aby se minimalizovala kontaminace. Krmivo, voda, nejvyšší a nejnižší teploty v místnosti a vysoké a nízké hodnoty vlhkosti byly sledovány, aby byla zajištěna konzistence s výrobními standardy. Zdravotní pozorování byla prováděna a zaznamenávána jednou denně za účelem posouzení chůze, letargie, konzistence stolice a dalších klinických příznaků onemocnění. Ušní značka (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, USA) byla umístěna do pravého ucha každé prasničky pro individuální identifikaci zvířete.

2.4. Ústní výzva

Po 4-denním aklimatizačním období byla každá prasnička v CONTROL orálně vystavena PEDV pomocí tkáňového homogenátu odebraného z potvrzeného klinického propuknutí PEDV na komerční farmě. Homogenát byl sekvenován Veterinární diagnostickou laboratoří Iowa State University a bylo zjištěno, že jde o americký prototypový kmen, genoskupinu G2b. Deset mililitrů homogenátu bylo smícháno s 590 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku a 30 ml směsi bylo ironicky podáno každé prasnici. Inokulum bylo potvrzeno jako PEDV pozitivní pomocí polymerázové řetězové reakce s reverzní transkriptázou v reálném čase s hodnotou CT 19,6 a 14,23 × 107 genomových kopií na ml a rozvojem průjmu u prasniček po expozici. Jednotlivé vzorky krve byly odebírány každých 7 dní po expozici pomocí jugulární venepunkce, jak je popsáno výše, až do dne 42 po provokaci. Sérum bylo sklizeno a skladováno, jak je popsáno výše, a vzorky byly předloženy ISU VDL pro detekci neutralizačních protilátek pomocí fokusového fluorescenčního neutralizačního testu a vysokovýkonného virového neutralizačního testu. 60. den po počátečním testu CONTROL bylo zbývajících 40 prasniček převezeno do výzkumného zařízení a 18 z CONTROL prasniček se stalo NV. Dvě prasničky byly odebrány z CONTROL kvůli podmínkám nesouvisejícím se studií. Po 3-denním aklimatizačním období po příjezdu bylo 18 prasniček znovu vystaveno (NV) a 40 prasniček (PRE a POST), byly odebrány vzorky krve, odebráno sérum a vzorky odeslány k testování, jak je zde popsáno .

2.5. Očkování prasniček

Čtyřicet prasniček zůstalo na farmě původu a byly přivezeny do výzkumného zařízení 8,5 týdne po příjezdu CONTROL. Dvacet prasniček bylo očkováno 5 a 2 týdny před expozicí, jak doporučuje společnost vyrábějící vakcínu, komerčně dostupnou usmrcenou vakcínou PEDV, genoskupina G2b, (Vakcína proti epidemii prasat, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ , USA) zahrnující skupinu PRE. Zbývajících dvacet bylo očkováno stejnou vakcínou 1 a 3 týdny po stimulaci PEDV zahrnující POST skupinu. Osmnáct z původních dvaceti prasniček CONTROL zůstalo ve studii a zahrnovalo skupinu NV a nebyly očkovány proti PEDV

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

2.6. Neutralizační protilátky

2.6.1. Postup neutralizace fluorescenčního ohniska (FFN).

FFN byla provedena Veterinární diagnostickou laboratoří Iowa State University, standardní operační postup 9.5324 [16]. Stručně, buňky Vero 76 byly připraveny promytím a inkubací s kyselinou trypsin-ethylendiamintetraoctovou (EDTA) po dobu 5 minut při 37 °C. Bylo připraveno ředění buněk a buněčného propagačního média 1:20 a 200 ul přidáno do každé jamky 96-jamkové destičky a inkubováno po dobu 48 hodin. Destičky byly vylity a opláchnuty virovým inokulačním médiem. Vzorky séra byly tepelně inaktivovány ve vodní lázni při 56 °C po dobu 30 minut a poté naředěny 2-násobným sériovým ředěním počínaje 1:10 na destičce. Zásobní virus byl naředěn na 100–200 jednotek tvořících ložiska na 100 µL a 100 µL přidáno do každé jamky a inkubováno po dobu 60 minut při 37 °C s 5 % oxidem uhličitým (CO2). Testovací destička byla vylita, opláchnuta a 150 ul směsi séra/viru přidáno do odpovídajících jamek a inkubováno po dobu 60 minut při 37 °C. Směsi séra/viru byly odstraněny a jamky byly promyty virovým inokulačním médiem. Do každé jamky bylo přidáno 150 ul virového inokulačního média a inkubováno po dobu 24 hodin při 37 °C a 5 % CO2. Médium bylo odstraněno z destičky a buňky byly fixovány přidáním 80% acetonu, který byl chlazen v ledové lázni, po dobu 15 minut. Aceton byl odstraněn a deska byla vysušena na vzduchu. Bylo připraveno ředění 1:100 FITC konjugované PEDV NP monoklonální protilátky zředěné v PBS (pH 7,2) a 50 ul bylo přidáno do všech jamek a inkubováno při 37 °C po dobu 60 minut. Destička byla promyta PBS a poté odečtena pomocí fluorescenčního mikroskopu (Olympus BX51, 10X objektiv, FITC filtr). Pozitivní jamky nevykazují fluoreskující plaky a negativní ukazují zelené plaky. Titry neutralizačních protilátek byly vyjádřeny jako nejvyšší ředění séra s 90% snížením replikace viru ve srovnání s kontrolou viru. Vzorky s titrem vyšším nebo rovným 20 byly klasifikovány jako pozitivní na protilátky neutralizující PEDV. Vyšší titr indikuje vyšší koncentraci neutralizačních protilátek ve vzorku. Příklady pozitivních a negativních vzorků sér jsou k dispozici v doplňkových materiálech.

2.6.2. Postup testu vysokovýkonné fluorescenční neutralizace (HTNT).

HTNT provedla Veterinární diagnostická laboratoř Iowa State University, standardní operační postup 9.5324 verze 2 [17]. Vzorky séra byly tepelně inaktivovány ve vodní lázni při 56 ◦C po dobu 30 minut. Zásoba viru byla sériově naředěna 10-krát ve virovém inokulačním médiu (DMEM s 2 ug/ml Trypsin-TPCK), přenesena do buněk Vero 81 (ATTC® CCL-81™) a inkubována při 37 ◦C s 5% CO2 po dobu 5 dnů. Poslední ředění, ve kterém byl pozorován cytopatický efekt, bylo použito ke stanovení střední infekční dávky pro tkáňové kultury (TCID50) pomocí Spearmanovy a Karberovy metody [18]. Sto mikrolitrů buněčného roztoku (Cell propagation Medium, Trypsin-EDTA a Vero 81 cells) bylo zředěno 100 ul média pro množení buněk (DMEM s 10% FBS a 1% penicilin-streptomycin), aby se vytvořilo ředění 1:1 . Hemocytometr byl použit k počítání a výpočtu ředění tak, aby bylo 5 x 104 buněk/jamku a přidán do každé jamky černé 96-jamkové destičky s čirým dnem (Coring 96jamková CellBind microplate, Sigma) a inkubován po dobu 48 hodin při 37 ◦C s 5 % CO2, aby se buňky spojily (100 % splývaly). Každá destička měla jamky pro pozitivní kontrolu, negativní kontrolu a virovou kontrolu. Poté bylo pět mikrolitrů tepelně inaktivovaných kontrol a vzorků umístěno do duplicitních jamek, aby se vytvořilo ředění 1:40 nejprve 1:20 přidáním 95 ul virového inokulačního média, poté 100 ul 1:10 zředěného viru PEDV (3,16 × 105 TCID50/ml). Směs séra/viru byla inkubována po dobu 1 hodiny při 37 °C s 5% CO2. Všechny buněčné jamky testovací destičky byly 3krát promyty 150 ul buněčného promývacího média (DMEM s 1% penicilin-streptomycin) a 150 ul směsi sérum/virus a virové kontroly byly přeneseny na testovací destičku a inkubovány po dobu 90 minut. při 37 ◦C. Směs séra/viru byla odstraněna a destičky byly jednou promyty médiem pro promývání buněk, jak je popsáno výše, a poté jednou médiem pro inokulaci viru. Do každé jamky bylo přidáno virové inokulační médium (150 ul) a inkubováno po dobu 24 hodin při 37 °C s 5 % CO2. Virové inokulační médium bylo odstraněno a destička byla promyta PBS pH 7,4. Buňky byly fixovány přidáním 4 °C, 80% acetonu do každé jamky a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Aceton byl poté odstraněn a deska byla sušena na vzduchu po dobu 30 minut. Každá jamka byla promyta PBS pH 7,4. Do každé jamky bylo přidáno 50 ul FITC-konjugované PEDV NP monoklonální protilátky (SD6-29 klon, Medgene Labs) zředěné 1:100 v PBS pH 7,4 a inkubováno po dobu 60 minut při 37 °C. Destička byla čtyřikrát promyta PBS pH 7,4, poslední promývání bylo ponecháno na destičce po dobu 5 minut, poté zlikvidováno a nahrazeno 100 ul PBS pH 7,4. Destičky byly poté odečteny pomocí SpectraMax i3× s použitím SoftMax Pro 6.5 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) s použitím expozičního času 30 ms a 20 um ohniskových úprav pro 541 vlnových délek. Vzorky s celkovým snížením fluorescence (%FR) vyšším nebo rovným 85 % byly klasifikovány jako pozitivní na neutralizační protilátky [2]. Celkové snížení fluorescence bylo vypočteno jako 100 − ([Průměrný vzorek celková intenzita fluorescence/průměrná celková intenzita fluorescence negativní kontroly]) × 100). Vyšší celkové snížení fluorescence indikuje vyšší koncentrace neutralizačních protilátek ve vzorcích. Příklady pozitivních a negativních vzorků sér jsou k dispozici v doplňkových materiálech.

2.7. Diagnostické charakteristiky: Senzitivita a specificita a pozitivní a negativní prediktivní hodnoty

Diagnostická senzitivita a specificita byly vypočteny pro HTNT s použitím %FR cut-off 70, 75, 80, 85 a 90 a FFN s použitím cut-off ředění vzorku 20, 40, 80 a 160 pro stanovení optimalizovaného cut-off. Optimalizovaný byl definován jako mez, kdy je diagnostická specificita maximalizována s minimální ztrátou diagnostické specificity. Podskupina sedmdesáti šesti známých PEDV-negativních vzorků byla vybrána z prvních dvou vzorkovacích bodů pro skupiny CONTROL a POST. Z posledních dvou odběrových míst pro skupinu NV bylo vybráno 36 známých PEDV-pozitivních vzorků. Pro definování pozitivních vzorků byla použita hranice větší než 85 v souladu se standardním operačním postupem ISU VDL pro test [17]. Diagnostická citlivost byla odhadnuta vydělením počtu známých pozitivních vzorků, které byly testovány jako pozitivní, celkovým počtem známých pozitivních vzorků. Diagnostická specificita byla odhadnuta vydělením počtu známých negativních vzorků, které byly testovány jako negativní, počtem známých negativních vzorků. Pro srovnání testu byla vybrána hranice, která optimalizovala diagnostickou specificitu a citlivost. Pro účely této studie byla maximalizována diagnostická specificita (DSp) a senzitivita (DSe), kde absolutní hodnota rozdílu mezi hodnotami senzitivity a specificity je nejmenší. Pozitivní prediktivní hodnota (PPV) byla odhadnuta vydělením počtu známých pozitivních vzorků, které byly testovány jako pozitivní (TP) celkovým počtem pozitivních vzorků testu (TP plus falešně pozitivní [FP]). Negativní prediktivní hodnota (NPV) byla odhadnuta vydělením počtu známých negativních vzorků (TN), které byly testovány jako negativní, celkovým počtem negativních vzorků testu (TN plus falešně negativní [FN]).

cistanche tubulosa - zlepšení imunitního systému

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. Statistická analýza

V této studii nebyly žádné neurčité výsledky nebo chybějící údaje. Všechna data byla analyzována pomocí SAS verze 9.4 (SAS Instit. Cary NC). Bylo použito 609 pozorování od 6{{10}} prasat patřících do jedné ze 4 skupin. Byly zváženy dvě možné mezní hodnoty (40 a 80) pro test FFN a porovnány s limitem 85 pro HTNT. Pro každý byl použit lineární model smíšených účinků, aby vysvětlil účinek skupiny na shodu testů FFN a HTNT s náhodným účinkem specifickým pro prase. Byly provedeny všechny párové srovnávací analýzy skupin. Dále, pro dvě ze tří hraničních hodnot použitých pro test FFN, byl vypočten Cohenův Kappa koeficient, aby se určila celková shoda testů FFN a HTNT. Koeficienty kappa byly interpretovány následovně: méně než 0.0, "špatná" shoda; mezi 0.0 a 0.20, "mírná" dohoda; mezi 0.21 a {{30}}.40, "férová" dohoda; mezi 0,41 a 0,60, "umírněný" souhlas; mezi 0,61 a 0,80, "podstatná" shoda; a mezi 0,81 a 1,0, "téměř dokonalá" shoda [19]. Významnost byla nastavena na p menší nebo rovna 0,05. Krabicové a vousaté grafy byly vyvinuty pomocí softwaru R.

3. Výsledky

Tabulka 1 ukazuje diagnostickou senzitivitu a specifitu pro testy FFN a HTNT při vybraných hraničních hodnotách. Diagnostická senzitivita a specificita pro dva testy pro tuto studii byly optimalizovány při hraniční hodnotě ředění 80 a 80 % FR.

Tabulka 1. Diagnostická citlivost (DSe), diagnostická specificita (DSp), pozitivní prediktivní hodnota (PPV) a negativní prediktivní hodnota (NPV) pro testy HTNT a FFN s použitím různých mezních hodnot uvedených ve druhém řádku tabulky. Například pro test HTNT s mezní hodnotou 70, DSe=0,97 (97 %), DSP=0,91 (91 %), PPV=0,83 ( 83 %) a NPV=0,95 (95 %). U=nedefinováno.

Obrázek 1 zobrazuje krabicové a whiskerové grafy výsledků HTNT podle dnů po provokaci podle studijní léčebné skupiny. Vzorky ze skupin CONTROL a POST (n=76) byly klasifikovány jako negativní ve dnech -4, 0 a 7, jak se očekávalo vzhledem k předchozímu stavu prasat. Skupina NV po výzvě vyvinula anamnestickou odpověď. Mezi výsledky HTNT se objevila snížená variabilita, jak ukazuje pokles v rozmezí hodnot v obou očkovaných skupinách (PRE a POST) po expozici PEDV. Tuto sníženou variaci lze pozorovat na obrázku 1, protože vousy a odlehlé hodnoty POST a PRE-plochy se zkracují 14 dní po napadení. Obrázek 2 zobrazuje krabicové a whiskerové grafy přirozených log-transformovaných výsledků FFN podle dnů po provokační expozici podle léčené skupiny, které mají podobné výsledky jako test HTNT. Výsledky HTNT (obrázek 1) i FFN (obrázek 2) ukazují reakci na expozici a vakcinaci, jak je vidět se zvýšením % FR a titrů z obou testů. I když mají podobnou velikost, variace výsledků každého testu byla snížena po homologní expozici (NV). Snížená variace se objevila také po očkování (PRE a POST). Tato změna hodnot neutralizačních protilátek v týdnu po expozici se po vakcinaci a homologní expozici PEDV snižuje (obrázky 1 a 2). Ve výsledcích obou testů u vakcinovaných a homologně exponovaných léčebných skupin byla pozorována podobná tendence ve snižování variace neutralizačních protilátek. Homologní provokace PEDV a druhá vakcinace vyvolaly anamnestickou odpověď generující vyšší hladinu neutralizačních protilátek se sníženou variabilitou mezi prasaty ve srovnání s hodnotami před provokací a po vakcinaci, jak bylo měřeno oběma testy (obrázek 1). Na základě analýzy diagnostické citlivosti a specifičnosti byly vybrány mezní hodnoty 80 (titr) a 85 (%FR) pro analýzu shody testu pro testy FFN a HTNT, v daném pořadí. Kappa test prokázal "střední" shodu 0,5257 s 95% intervalem spolehlivosti 0,461, 0,5904 testů pro cut-off 80 (titr) a 85 (%FR) pro Testy FFN a HTNT.

Obrázek 1. Krabicové grafy křivek protilátkové odezvy HTNT ve dnech po provokaci pro každou léčebnou skupinu. Prostřední sloupec představuje střední hodnotu výsledků podle týdne. Panty (horní a spodní část krabice) představují první (Q1) a třetí (Q3) kvartil. Stínovaná oblast představuje mezikvartilní rozsah (IQR). Vousky jsou určeny následovně: Horní vous=Q3 + 1.5∗IQR; Spodní vous=Q1 + 1.5∗IQR. Pokud žádný datový bod není na vypočítané hodnotě, další datový bod nejblíže Q1 nebo Q3 je limitem whiskeru. Prázdné kroužky (◦) označují odlehlé hodnoty. Řez 85 je označen přerušovanou čarou 85 na ose y.

Obrázek 2. Box-and-whisker grafy křivek FFN protilátkové odezvy ve dnech po čelenži pro každou léčebnou skupinu. Prostřední sloupec představuje střední hodnotu výsledků podle týdne. Panty (horní a spodní část krabice) představují první (Q1) a třetí (Q3) kvartil. Stínovaná oblast představuje mezikvartilní rozsah (IQR). Vousky jsou určeny následovně: Horní vous=Q3 + 1.5∗IQR; Spodní vous=Q1 + 1.5∗IQR. Pokud žádný datový bod není na vypočítané hodnotě, další datový bod nejblíže Q1 nebo Q3 je limitem whiskeru. Prázdné kroužky (◦) označují odlehlé hodnoty. Řez 40 je označen přerušovanou čarou v ln(40) na ose y.

4. Diskuze

Předpokládáme, že snížená variabilita a anamnestická odpověď jsou spojeny s homogenní imunitou stáda a ochranou před onemocněním, i když klinické příznaky byly stále pozorovány ve skupině PRE, jak bylo popsáno dříve [14]. Klinický dopad a závažnost onemocnění u těchto zvířat nebyly pro účely této studie hodnoceny. Onemocnění se projevuje odlišně mezi dospělými a novorozenci se závažnějšími klinickými příznaky a úmrtím novorozenců ve srovnání s dospělými zvířaty [1,20]. Zatímco hladiny cirkulujících neutralizačních protilátek samy o sobě neposkytují ochranu [21], lze je použít k posouzení protilátkové odpovědi po záměrné expozici nebo vakcinaci ve stádech. Zatímco absence virémie je charakteristická pro PEDV, virémie byla popsána u selat do 4 týdnů věku [22,23]. Cirkulující neutralizační protilátky tedy mohou ovlivnit klinický průběh onemocnění [21]. Přesnějším měřením ochrany selat by však byla laktogenní imunita, konkrétně IgA v sekretu mléčné žlázy [21]. Testy popsané v této studii by mohly být použity k monitorování sérových neutralizačních protilátek po podání vakcinace ve skupinách prasnic nebo prasniček kromě odběru sekretů mléčné žlázy pro testování laktogenního/sekrečního IgA. Bylo by prospěšné, kdyby data získaná z těchto testů mohla předpovědět množství a stabilitu laktogenní imunity produkované po vakcinaci. To však nebylo v této studii analyzováno. Ukázalo se, že sérové ​​IgG protilátkové odpovědi po vakcinaci jsou prediktivní pro kolostrální IgG odpověď, ale mezi protilátkami neutralizujícími sérum a sekrety mléčné žlázy nebyla žádná korelace [15]. Zatímco mezi protilátkami neutralizujícími sérum a protilátkami z mléčné žlázy nebyla žádná korelace, bylo prokázáno, že vakcinovaná zvířata mají vyšší neutralizační protilátky v sekrecích mléčné žlázy ve srovnání s kontrolními zvířaty [15]. Proto, jak podporují Bjustrom-Kraft, et al. [15], pokud jsou sérové ​​neutralizační protilátky vysoké, pak mohou být zvýšeny i IgG a IgA v sekreci mléčné žlázy. Odběr vzorků séra před přesunem samic do porodnice by tedy minimalizoval stres a bolest způsobenou během periparturiního odběru krve a sekretu mléčné žlázy, které mohou negativně ovlivnit prasnici a podestýlku [24]. Pro uživatele je důležité pochopit, jak může mezní hodnota ovlivnit diagnostickou citlivost a specifičnost testu. Zvýšení mezní hodnoty sníží počet falešně pozitivních výsledků a zvýší počet falešně negativních výsledků. Naopak, snížení hraniční hodnoty zvýší počet falešně pozitivních výsledků a sníží počet falešně negativních výsledků. Tato znalost umožňuje uživateli vybrat si, jakou mezní hodnotu použít pro jeho konkrétní situaci. Pro tuto studii na základě výsledků této studie a předchozích výsledků publikovaných Sarmento et al. [2] jsme pro HTNT zvolili 80 % FR a ředění 80 FFN. Při těchto hraničních hodnotách je diagnostická specificita vyšší pro HTNT (97 %) ve srovnání s FFN (76 %) a poskytuje vyšší pozitivní prediktivní hodnotu z HTNT ve srovnání s FFN. Je třeba si také uvědomit, že prediktivní hodnoty jsou závislé na prevalenci onemocnění [25,26]. V této studii byla na základě klasifikovaných vzorků prevalence 32,1 % (36 pozitivních a 76 negativních vzorků). Jak se prevalence zvyšuje, PPV by se také zvyšovala, protože testované zvíře (vzorek) je pravděpodobněji pozitivní; s klesající prevalencí by se NPV snižovala. Obrázky 3A a B to ilustrují pro testy HTNT a FFN při různých hraničních hodnotách hodnocených v této studii podle metod popsaných Erbem [25]. Při zvažování diagnostických výsledků je proto třeba zvážit diagnostickou senzitivitu a specifičnost testu a pochopit prevalenci v rámci skupiny při použití prediktivních hodnot.

Obrázek 3. (A). Pozitivní Prediktivní hodnoty pro testy HTNT (černé čáry) a FFN (šedé čáry) při různých hraničních hodnotách. Mezní hodnota 90 není pro HTNT reprezentována. (B). Negativní prediktivní hodnoty nebo testy HTNT (černé čáry) a FFN (šedé čáry) při různých hraničních hodnotách. Mezní hodnota 20 není uvedena pro test FFN.

HTNT má ve srovnání s FFN lepší diagnostickou senzitivitu a specificitu. Při analýze výsledků protilátek je to ideální pro minimalizaci počtu falešně pozitivních a falešně negativních výsledků. Například při použití cutoff 80 pro FFN jsme pozorovali senzitivitu 97 % a specificitu 76 %. To znamená, že by bylo málo falešně negativních výsledků, ale bylo by velké množství falešně pozitivních výsledků. Pokud jsou výsledky falešně kategorizovány jako pozitivní, pak to může vést k nesprávné interpretaci, že stádo má protilátky proti PEDV, i když ve skutečnosti nemají. Vzhledem k tomu, že HTNT má vyšší diagnostiku a specificitu napříč různými hraničními hodnotami, je preferovaným testem pro detekci protilátek proti PEDV. Výsledky od Sarmento et al. [2] prokázali mnohem vyšší diagnostickou specificitu pro FFN a srovnatelnou citlivost a specificitu pro HTNT. Tyto diagnostické testy vykazovaly střední shodu podle kappa statistiky (K). Jednou slabinou κ je, že jeden test musí být považován za zlatý standard. Při porovnávání dvou nedokonalých testů to může zkreslit interpretaci κ. Pro tuto studii jsme hodnotili diagnostický výkon testů ve spojení s κ, abychom určili, že test souhlasí, ale může mít různé využití. Další výhodou HTNT oproti testu FFN je to, že výsledky HTNT jsou počítány z kontinuálních dat ve srovnání s kategorickými hodnotami (titracemi) z FFN. Kontinuální povaha dat HTNT umožňuje větší rozlišení výsledků vzorků za účelem popisu stavu neutralizačních protilátek u prasnic. Jak uvádí Sarmento et al. [2], HTNT má kratší dobu čtení z 96jamkové destičky na méně než 4 minuty, což umožňuje rychlejší obrat výsledků. Cirkulující systémové protilátky mohou přispívat k ochraně selat před infekcemi PEDV [21]. Neexistuje však žádná literatura o tom, jaké množství cirkulující neutralizační protilátky u prasnice by poskytlo ochranu PEDV selatům. Vysoké hladiny cirkulujících protilátek vedou k vyšším koncentracím v kolostru a poskytují zvýšenou ochranu. Další hodnocení je zaručeno, aby se určila souvislost mezi tím, kdy se během těhotenství odebírají vzorky, a ochranou kolostrálních protilátek proti infekci PEDV. Laktogenní a slizniční imunita je životně důležitá pro přežití prasat vystavených PEDV. Protilátky se shromažďují v mléce prostřednictvím osy gut-MG-sIGA a jsou předány selatům, aby poskytly ochranu. Langel a kol. [27] zjistili, že prasničky exponované během druhého trimestru měly významně vyšší hladiny cirkulujících IgA, IgG a neutralizačních protilátek ve srovnání s prasničkami v prvním a třetím trimestru. Kromě toho Langel a kol. [27] zjistili, že selata prasniček vystavená PEDV ve druhém trimestru měla 100% míru přežití ve srovnání s méně než 87,2 % v ostatních trimestrech, což naznačuje, že vysoké sérové ​​IgA, IgG a neutralizační protilátky jsou spojeny s přežitím selat tváří v tvář PEDV. Ačkoli sérové ​​protilátky neposkytují ochranu proti PEDV, výsledky naší studie naznačují, že hladiny sérových neutralizačních protilátek jsou spojeny s ochranou proti infekci PEDV. Jak již dříve uvedl Brown et al. [14] se PEDV po homologní expozici a vakcinaci prasniček vylučuje stolicí. V této studii byly použity vzorky od stejných zvířat jako Brown et al. [14]. dále ukazuje, že zvýšená sérová neutralizační protilátka po expozici nebo vakcinaci neovlivňuje vzorec vylučování viru, protože hladiny protilátek se zvýšily po expozici a vakcinaci. Další studie by měly potvrdit, zda množství viru vyloučeného ve stolici souvisí s množstvím neutralizačních protilátek, které jsou přítomny v séru [21].

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

5. Závěry

Nulová hypotéza této studie byla, že neexistuje žádný rozdíl v diagnostických charakteristikách dvou testů na protilátky neutralizující PEDV, FFN a HTNT. Výsledky ukazují, že tyto testy se mírně shodují na základě kappa statistiky, zatímco existují rozdíly v jejich diagnostických charakteristikách a prediktivních hodnotách na základě mezní hodnoty pro test. Tyto testy by mohly být použity k měření vakcinační reakce stáda. Neodmítnutí nulové hypotézy ukazuje, že HTNT je preferovaným testem pro detekci PEDV-neutralizačních protilátek v séru. Po očkování ve skupinách PRE i POST zjistila tato studie většinu výsledků jako pozitivní. Ve skupině PRE následovala výzva také snížená variabilita mezi výsledky. Tyto výsledky naznačují, že praktici by mohli měřit sérum-neutralizující protilátky, aby zjistili, zda jsou vakcíny PEDV ve stádě podávány správně.

Reference

1. Saif, L.; Wang, Q.; Vlasová, A.; Jung, K.; Xiao, S. Koronaviry. In Diseases of Swine, 11. vydání; Zimmerman, JJ, Ed.; Wiley Blackwell: Hoboken, NJ, USA, 2019.

2. Sarmento, LV; Poonsuk, K.; Tian, ​​L.; Mora-Diaz, JC; Main, RG; Baum, DH; Zimmerman, JJ; Gimenez-Lirola, LG Detekce protilátky neutralizující virus prasečího epidemického průjmu pomocí vysoce výkonné zobrazovací cytometrie. J. Vet. Diagn. Vyšetřování. 2020, 32, 324–328. [CrossRef]

3. Stevenson, GW; Hoang, H.; Schwartz, KJ; Burrough, ER; Sun, D.; Madson, D.; Cooper, VL; Pillatzki, A.; Gauger, P.; Schmitt, BJ; a kol. Vznik viru epidemického průjmu prasat ve Spojených státech: Klinické příznaky, léze a virové genomové sekvence. J. Vet. Diagn. Vyšetřování. 2013, 25, 649–654. [CrossRef]

4. Kim, Y.; Yang, M.; Goyal, SM; Cheeran, MC; Torremorell, M. Hodnocení opatření biologické bezpečnosti k prevenci nepřímého přenosu viru epidemického průjmu prasat. BMC Vet. Res. 2017, 13, 89. [CrossRef]

5. Píseň, DS; Oh, JS; Kang, BK; Yang, JS; Měsíc, HJ; Yoo, HS; Jang, YS; Park, BK Orální účinnost viru prasečího epidemického průjmu kmene DR13 atenuovaného buňkami Vero. Res. Vet. Sci. 2007, 82, 134–140. [CrossRef] [PubMed]

6. de Arriba, ML; Carvajal, A.; Pozo, J.; Rubio, P. Slizniční a systémové izotypově specifické protilátkové odpovědi a ochrana u konvenčních prasat vystavených virulentnímu nebo atenuovanému viru epidemického průjmu prasat. Vet. Immunol. Imunopathol. 2002, 85, 85–97. [CrossRef] [PubMed]

7. Furukawa, S.; Kuroda, Y.; Sugiyama, A. Srovnání histologické struktury placenty u experimentálních zvířat. J. Toxicol. Pathol. 2014, 27, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

8. Bourne, FJ; Curtis, J. Přenos imunoglobinů IgG, IgA a IgM ze séra do kolostra a mléka u prasnice. Imunologie 1973, 24, 157–162. [PubMed]

9. Parren, PW; Burton, DR. Antivirová aktivita protilátek in vitro a in vivo. Adv. Immunol. 2001, 77, 195–262. [CrossRef]

10. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Gimenez-Lirola, L.; Rotolo, M.; Wang, C.; Sun, Y.; Lasley, P.; Zhang, J.; Baum, D.; Gauger, P.; a kol. Detekce viru epidemie průjmu prasat (PEDV) a protilátková odpověď u komerčně rostoucích prasat. BMC Vet. Res. 2016, 12, 99. [CrossRef]

11. Oh, JS; Píseň, DS; Yang, JS; Píseň, JY; Měsíc, HJ; Kim, TY; Park, BK Srovnání enzymatického imunosorbentního testu se sérovým neutralizačním testem pro sérodiagnózu virové infekce prasečího epidemického průjmu. J. Vet. Sci. 2005, 6, 349–352. [CrossRef]

12. Okda, F.; Liu, X.; Singrey, A.; Clement, T.; Nelson, J.; Christopher-Hennings, J.; Nelson, EA; Lawson, S. Vývoj nepřímé ELISA, blokující ELISA, fluorescenční mikrosférický imunotest a fluorescenční fokus neutralizační test pro sérologické hodnocení expozice severoamerickým kmenům viru prasečí epidemie průjmu. BMC Vet. Res. 2015, 11, 180. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Q.; Li, G.; Staško, J.; Thomas, JT; Stensland, WR; Pillatzki, AE; Měřidlo, PC; Schwartz, KJ; Madson, D.; Yoon, KJ; a kol. Izolace a charakterizace virů prasečího epidemického průjmu spojených s propuknutím choroby v roce 2013 u prasat ve Spojených státech. J. Clin. Microbiol. 2014, 52, 234–243. [CrossRef]

14. Brown, J.; Rademacher, C.; Baker, S. Účinnost komerční vakcíny proti prasečímu epidemickému průjmu při zkracování doby šíření viru u prasniček. JSHAP 2019, 27, 256–264.

15. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. Protilátkové odezvy séra a sekrece mléčné žlázy u prasniček imunních proti epidemickému průjmu po vakcinaci proti epidemickému průjmu prasat. JSHAP 2018, 26, 34–40.

16. Státní univerzita v Iowě. Postup testu fluorescenčního fokusního neutralizačního testu (FFN) virem prasečí epidemie průjmu (PEDV). Sérologie 2017, 1–7.

17. Státní univerzita v Iowě. Postup pro virus epidemie průjmu prasat (PEDV) High-Throughput Virus Neutralization Test (HTNT). Sérologie 2017, 1–16.

18. Hierholzer, JC; Killington, RA; Kangro, HO; Mahy, BWJ Virology Methods Manual; Academic Press: Londýn, Spojené království, 1996; p. 21.

19. Thrusfield, M. Veterinary Epidemiology, 2. vyd.; Blackwell Science LTD: Hoboken, NJ, USA, 1995; p. 479.

20. Lee, C. Prasečí epidemický průjmový virus: Objevující se a znovu se objevující epizootický virus prasat. Virol. J. 2015, 12, 193. [CrossRef]

21. Poonsuk, K.; Gimenez-Lirola, LG; Zhang, J.; Arruda, P.; Chen, Q.; Correa da Silva Carrion, L.; Magtoto, R.; Pineyro, P.; Sarmento, L.; Wang, C.; a kol. Hraje cirkulující protilátka roli v ochraně selat proti viru prasečí epidemie průjmu? PLoS ONE 2016, 11, e0153041. [CrossRef]

22. Niederwerder, MC; Nietfeld, JC; Bai, J.; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; Anderson, J.; Kerrigan, MA; An, B.; Oberst, RD; Crawford, K.; a kol. Lokalizace ve tkáních, vylučování, přenos viru, protilátková odpověď a aerosolový přenos viru epidemického průjmu prasat po inokulaci 4-týdenních prasat na krmení. J. Vet. Diagn. Investovat. 2016, 28, 671–678. [CrossRef]

23. Madson, DM; Arruda, PH; Magstadt, DR; Burrough, ER; Hoang, H.; Sun, D.; Bower, LP; Bhandari, M.; Měřidlo, PC; Stevenson, GW; a kol. Charakterizace viru prasečí epidemie průjmu izoluje US/Iowa/18984/2013 infekce u 1-denních selat zbavených kolostra po císařském řezu. Vet. Pathol. 2016, 53, 44–52. [CrossRef]

24. Mainau, E.; Manteca, X. Bolest a nepohodlí způsobené porodem u krav a prasnic. Appl. Anim. Chovej se. Sci. 2011, 135, 241–251. [CrossRef]

25. Erb, HN Předběžná pravděpodobnost (nejlepší odhad před testem) ovlivňuje prediktivní hodnoty diagnostických testů. Vet. Clin. Pathol. 2011, 40, 154–158. [CrossRef] [PubMed]

26. Tenny, S.; Hoffman, MR Prevalence. Ve StatPearls; StatPearls Publishing: Treasure Island, FL, USA, 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; Alhamo, MA; Buckley, A.; Van Geelen, A.; Ležák, KM; Vlasová, AN; Saif, LJ Stádium březosti u prasečí epidemie průjmu Infekce březích prasat virem ovlivňuje mateřskou imunitu a laktogenní imunitní ochranu novorozených selat. Přední. Immunol. 2019, 10, 727. [CrossRef] [PubMed]