Kombinace infuze adoptivních NK buněk s peptidem uvolňujícím dopamin redukuje senescentní buňky u starých myší
Jun 17, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
ÚVOD
Stárnutí je jedním z hlavních rizikových faktorů mnoha onemocnění [1] a vývoj metod, jak zasáhnout do stárnutí, významně sníží riziko řady onemocnění souvisejících s věkem, jako jsou kardiovaskulární a cerebrovaskulární onemocnění [2, 3], rakovina [4] a Alzheimerova choroba [5]. Senescentní buňky (SNC) se postupně hromadí ve tkáních během procesu stárnutí a jsou považovány za hlavní příčinu onemocnění souvisejících s věkem [6-8]. Bylo prokázáno, že odstranění SNC na myších modelech zabraňuje nebo oddaluje dysfunkci tkání a prodlužuje zdravý život [9, 10]. Naproti tomu transplantace malého množství SNC způsobuje fyziologickou dysfunkci u mladých myší [1]. Tyto studie otevřely dveře pro vývoj metod, které se zaměřují na odstranění SNC ke zmírnění chronických onemocnění souvisejících s věkem.
Cílená clearance SNC, nazývaná „senolytika“, byla první chemoterapií úspěšně testovanou v preklinickém in vivo modelu a v současnosti existuje několik senolytik [12]. Mnoho z těchto léků se zaměřuje na up-regulované antiapoptotické dráhy v SNC, aby selektivně vyčistily určité typy SNC, a prokázaly potenciál prodloužit životnost a zlepšit tělesné funkce [13, 14].Cistanche Extract Anti RadiationNavzdory úspěšnému zvratu patologie související s věkem na zvířecích modelech mohou existovat určité překážky pro použití senolytických léků u lidí kvůli heterogenitě SNC a vysokému riziku toxicity [15]. Proto by měla být prozkoumána alternativní metoda, která může bezpečně eliminovat širokou škálu SNC u lidí.
SNP mohou být rozpoznány a odstraněny imunitním systémem [16]. Předchozí studie ukázaly, že SNC aktivují přirozené zabíječské (NK) buňky up-regulací hlavního aktivačního ligandu proteinu A a B souvisejícího s řetězcem I. třídy histokompatibility [17]. S přibývajícím věkem však účinnost imunitního systému klesá, což může vést k imunitnímu úniku SNC [18]. V terapii rakoviny byly zkoumány způsoby, jak překonat imunitní únik způsobený sníženou imunitní funkcí [19]. Nedávný pokrok byl učiněn v adoptivním přenosu NK buněk k odstranění nádorů, což prokázalo určitou účinnost [20]; bylo tedy rozumné předpokládat, že adoptivní infuze NK buněk může vyvolat cytotoxicitu v SNC.
Nervový a imunitní systém jsou dva nejdůležitější adaptivní systémy těla. Několik studií ukázalo, že dopamin (DA) jako imunitní regulátor je klíčem k neuroimunitní komunikaci [21]. DA plní své biologické funkce interakcí a aktivací dopaminových receptorů (DR), které se dělí na 2 podskupiny, D1-like (D1 a D5) a D2-like (D2, D3, a D4). Pokud jde o jejich různé funkce, zapojení D1-jako DR stimuluje produkci cAMP, zatímco zapojení D2-jako DR produkci cAMP inhibuje [22]. Předchozí studie ukázaly, že D1-jako DR stimulace zvyšuje cytotoxicitu NK buněk jak in vitro [23], tak in vivo [24]. Hladiny DA však se zvyšujícím se věkem člověka klesají [25]. Předpokládali jsme tedy, že dopaminergní léky mohou zvýšit cytotoxicitu adoptivní infuze NK buněk.
Cistanche může proti stárnutí
Zde navrhujeme použití nonapeptidu Aceinu, který interagoval s enzymem konvertujícím angiotenzin (ACE I) k indukci sekrece DA [26], v kombinaci se systémovou terapií NK buňkami k eliminaci SNC. Výsledky in vitro ukázaly, že NK buňky odstranily SNC nezávisle na induktorech stárnutí a typech buněk.cistanche herbaNa modelu stárnoucích myší NK buněčná terapie v kombinaci s aceinem významně snížila počet senescencí asociovaných galaktozidázových (SA- -gal)-pozitivních buněk ve více tkáních, snížila expresi genů asociovaných se stárnutím v hlavních orgánech a sekreční fenotypy (SSP) spojené se stárnutím. Výsledky této studie poskytují pohled na možné obnovení imunitního dohledu nad chronickými SNC pomocí NK buněčné terapie v kombinaci s Ace.
VÝSLEDEK
Adoptivní infuze NK buněk snižuje senescentní CD3 plus T buňky v periferní krvi
Do studie bylo přijato 26 dobrovolníků, kteří dostali infuzi NK buněk. Charakteristiky a vlastnosti NK buněk dobrovolníků jsou uvedeny v tabulce 1. Časový interval pro odběr krve po transfuzi NK buněk byl přibližně 37 (25-57) dní. Podíl (obr. 1A) a absolutní počet (obr. 1B) NK buněk v periferní krvi byly nepřímo úměrné věku dobrovolníků. Překvapivě čistota produktu NK buněk reinfundovaného do každého jedince také nepřímo korelovala s věkem dobrovolníků (obr. 1C).cistanche růst penisuTo může být způsobeno postupným snižováním počtu NK buněk s rostoucím věkem. Aby se projevil anti-aging účinek podávání NK buněk, byly před a po infuzi NK buněk detekovány četné senescentní markery v CD3 plus T buňkách periferní krve, které do značné míry odrážejí fenotyp těla související s věkem [27]. Ve srovnání s markery stárnutí a faktorem SASP CD3 plus T buněk v periferní krvi před a po autologní infuzi NK buněk byl podíl SA- -gal-pozitivních T buněk po infuzi významně snížen (obr. 1D). Hladiny mRNA P16, P21 a inhibitoru aktivátoru plazminogenu 1 (Pai1) byly významně sníženy, zatímco změny v hladinách mRNA monocytového chemoatraktantního proteinu-1 (MCP-1) a IL-6 nebyly významné (obr. 1E). Nebyl žádný významný rozdíl v biochemických indexech (doplňková tabulka 1) v periferní krvi.
Lidské NK buňky snižují markery stárnutí tukové tkáně a sekreci prozánětlivých cytokinů
Od tří obézních jedinců byla odebrána tuková tkáň, protože obezita má tendenci způsobovat akumulaci SNC [28]. Kromě toho byla tuková tkáň kultivována v upraveném médiu z SNC, aby se dále indukovalo stárnutí tukové tkáně. Tuková tkáň kultivovaná v upraveném médiu z non-SNC byla považována za kontrolu. Exprese perforinu (obr. 2A) a CD69 (obr. 2B) v NK buňkách byla významně zvýšena po společné inkubaci se senescentní tukovou tkání ve srovnání se společnou inkubací s kontrolní tukovou tkání. Exprese senescentních markerů p16 a p21in
senescentní tuková tkáň byla významně snížena po léčbě NK buňkami (obr. 2C, doplňkový obr. 1A, B). Zjistili jsme také, že klíčová složka SASP v kondicionovaném médiu po společné inkubaci s NK buňkami v senescentní skupině byla významně snížena (obr. 2D). Tyto výsledky naznačují, že NK buňky by mohly eliminovat SNC z tukové tkáně a redukovat fenotyp SASP.
Myší NK buňky mohou být aktivovány proti SNC a projevovat cytotoxicitu
Nejprve jsme indukovali senescenci myších tukových progenitorových buněk ozářením nebo Adriamycinem, jak bylo popsáno dříve [29]. Aby se určilo, zda byly NK buňky specificky aktivovány SNC, byly neozářené kontrolní buňky nebo ozářené SNC společně inkubovány s NK buňkami po dobu 24 hodin. Průtoková cytometrie ukázala, že hladiny exprese CD69 (obr. 3A) a IFN-y (obr. 3B) v NK buňkách byly významně up-regulovány v cílových buňkách SNC ve srovnání s kontrolními cílovými buňkami. Mezitím po společné inkubaci s NK buňkami byla apoptotická hladina SNC významně vyšší než u kontrolních buněk (obr. 3C). Dále jsme detekovali expresi NK buněk aktivujících a inhibičních ligandů v SNC. Výsledky qPCR ukázaly, že hladina exprese aktivačních ligandů v NK buňkách byla významně up-regulována ve srovnání s kontrolními buňkami a hladina exprese některých inhibičních ligandů, jako je beta 2 mikroglobulin (2m), byla downregulována ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. .3D). Také jsme zkoumali schopnost NK buněk eliminovat SNC in vivo.výhody cistanche salsyKontrolní buňky značené DiR a SNC značené DiR byly transplantovány do břišní dutiny myší a NK buňky byly podávány přes ocasní žílu. Výsledky zobrazování in vivo ukázaly, že intenzita fluorescence u myší s transplantovanými SNC po ošetření NK buňkami byla významně slabší než u myší s transplantovanými kontrolními buňkami (obr. 3E). To naznačuje, že schopnost NK buněk zabíjet SNC byla významně vyšší než schopnost SNC in vivo. Dále jsme určili, zda cytotoxicita NK buněk proti SNC byla závislá na dávce a buněčně specifická. Současně jsme také použili doxorubicinem indukovanou senescenci k určení, zda byla cytotoxicita NK buněk proti SNC omezena na indukci záření. Výsledky ukázaly, že NK buňky měly významnou cytotoxickou aktivitu proti SNC způsobem závislým na dávce, ale malou cytotoxicitu proti kontrolním buňkám. Různé metody stimulace stárnutí neměly žádný vliv na schopnost NK buněk zabíjet SNC (obr. 3F). Tyto výsledky naznačují, že NK buňky by mohly být specificky aktivovány SNC a produkovat významnou cytotoxicitu proti SNC in vitro a in vivo.
DA zvyšuje cytotoxicitu myších NK buněk proti SNC prostřednictvím receptorů podobných D1-
S ohledem na důležitou neuroimunitní komunikační funkci DA [30] jsme hodnotili, zda DA může zvýšit cytotoxicitu myších NK buněk proti SNC. NK buňky byly koinkubovány s radiací indukovanými SNC a do média byly přidány různé koncentrace DA. Výsledky ukázaly, že DA může zvýšit cytotoxicitu NK buněk proti SNC (obr. 4A, B). Aby se charakterizovala signální dráha, kterou DA zesilovala zabíjející účinek NK buněk na SNC, byly hodnoceny změny v expresi DR, obsahu cAMP a fosforylaci proteinu vázajícího protein (CREB) odezvy na cAMP v NK buňkách. V NK buňkách koinkubovaných s SNC spolu s DA byl obsah cAMP (obr. 4C) a hladina fosforylace CREB (obr. 4D, doplňkový obr. 2A) významně zvýšeny ve srovnání s NK buňkami a koinkubací SNC bez DA. Abychom objasnili, proč DA zvyšuje zabíjející aktivitu NK buněk proti SNC, porovnali jsme změny DR na NK buňkách poté, co byly NK buňky koinkubovány s SNC nebo kontrolními buňkami. Výsledky ukázaly, že hladina exprese D1 a D5 DR byla významně upregulována poté, co byly NK buňky koinkubovány s SNC ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 4E). Dále DA a D1-jako antagonisté receptorů nebo D{16}}jako
V koinkubačním systému NK buněk a SNC byly společně přidány antagonisty receptoru. Ve srovnání s přidáním samotného DA byla hladina apoptózy SNC snížena po přidání DA plus SCH-23300 (antagonista receptoru podobného D1-) (obr. 4F, G). Mezitím obsah cAMP (obr. 4H) a hladina fosforylace CREB (obr. 41, doplňkový obr. 2B) v NK buňkách byly downregulovány. Naproti tomu přidání DA plus haloperidol (antagonista receptoru D2) významně nezměnilo hladinu apoptózy SNC, obsah cAMP a fosforylaci CREB v NK buňkách ve srovnání s přidáním samotného DA. Tyto výsledky prokázaly, že DA zvýšila zabíjející aktivitu myších NK buněk proti SNC prostřednictvím D1-jako Drs.
Ace v kombinaci s myšími NK buňkami významně zvyšuje clearance SNC in vivo
Předchozí studie ukázala, že dopamin u lidí klesá s věkem [22]. Nejprve jsme měřili hladinu periferního dopaminu u mladých a starých myší. Výsledky ukázaly, že hladiny dopaminu v plazmě u starých myší byly nižší než u mladých myší (obr. 5A). Dále bylo zkoumáno periferní uvolňování dopaminu po intraperitoneální injekci aceinu u starých myší. Zjistili jsme, že hladiny dopaminu v plazmě se významně zvýšily po injekci 10 mg/kg aceinu (obr. 5B, doplňkový obr. 3). S ohledem na to jsme provedli myší NK buňky kombinované s aceinem k léčbě starých myší. Zjistili jsme stav NK buněk v periferní krvi myší po léčbě a zjistili jsme, že počet NK buněk v periferní krvi infuze samotných NK buněk nebo NK buněk v kombinaci s aceinem byl významně vyšší než u skupiny léčené Ace a PBS, zatímco počet NK buněk se významně nelišil mezi skupinou ošetřenou NK buňkami a NK buňkami kombinovanými se skupinou ošetřenou aceinem (obr. 5C, D).cistanche tubulosa dávkování redditDalší detekce hladiny aktivace NK buněk ukázala, že hladina exprese CD69 v NK buňkách periferní krve v kombinované léčené skupině byla významně upregulována ve srovnání se skupinou léčenou NK buňkami (obr. 5E). Dále jsme hodnotili SNC v tkáni. Zjistili jsme, že infuze samotných NK buněk snížila expresi některých senescentních markerů ve srovnání se skupinou léčenou PBS a skupinou léčenou aceinem, zatímco infuze NK buněk v kombinaci s aceinem významně snížila SA- -gal-pozitivní buňky (obr. 5F ) a také hladiny exprese P16 a P21 (obr. 5G, doplňkový obr. 4A, B) v tukové tkáni ve srovnání s léčbou samotnými NK buňkami. Počet Ki67BrdUbuněk v tukové tkáni byl také významně zvýšen (obr. 5H), což dále dokazuje, že obsah SNC v tukové tkáni byl nižší v kombinované léčené skupině. SA- -gal barvení jater, plic, ledvin a tukových řezů také ukázalo nejnižší hladinu SNC v kombinované léčené skupině (doplňkový obrázek 5A-D). Tyto výsledky ukázaly, že NK buňky v kombinaci s aceinovou terapií zvýšily hladinu aktivace NK buněk u myší a způsobily významnou eliminaci SNC in vivo.
Ace v kombinaci s NK buňkami snižuje fenotypy související s věkem u starých myší
Pro další potvrzení fenotypů souvisejících s věkem u myší byly odebrány tkáně jater, plic, ledvin, tuku a oka, aby se detekovaly různé senescentní markery včetně faktorů P16, P21 a SASP. Tyto vzorky byly vybrány, protože u těchto tkání je pravděpodobnější stárnutí s věkem [31]. V každé tkáni byly po samotné infuzi NK buněk hladiny mRNA faktorů P16, P21 a SASP významně nižší než hladiny v kontrolní skupině, zatímco hladiny markerů stárnutí v jaterních, tukových a večerních tkáních u kombinovaně léčených skupina byla dále snížena ve srovnání se skupinou léčenou samotnou infuzí NK buněk (obr. 6A). Podobně jsme také detekovali hlavní faktor SASP v séru myší a výsledky byly v souladu s výsledky ve tkáních (obr. 6B). Kromě toho jsme také zkoumali hladiny NAD v játrech a tukové tkáni, které jsou spojeny se stárnutím [32]. Zjistili jsme, že infuze NK buněk samostatně nebo v kombinované terapii významně zvýšila obsah NAD v játrech a tukové tkáni, přičemž úroveň zlepšení byla významně vyšší ve skupině s kombinovanou terapií (obr. 6C). Některé sérové biochemické indexy včetně ALT, AST, CREA, UA, CHOL a BUN jsou spojeny s úrovněmi stárnutí [33]. Zjistili jsme, že pouze UA byla významně snížena v séru myší ve skupině léčené kombinací, zatímco ostatní klíčové biochemické indexy nebyly
MATERIÁL A METODY Infuze lidských NK buněk
Autologní infuzi NK buněk provedla Shanghai Mengchao Cancer Hospital (Shanghai, Čína) a všechny protokoly byly schváleny jejich etickou komisí (č. 05, 2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital). Všichni dobrovolníci poskytli podepsaný informovaný souhlas s odběrem periferní krve. Stručně řečeno, od každého jedince bylo extrahováno 50 ml periferní krve, poté byly izolovány mononukleární buňky periferní krve (PBMC) a přeneseny do baňky T75 s ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA) obsahujícím 1×Cloudz CD2/NKp46. , Rekombinantní lidský IL-2(27 ng/ml), rekombinantní lidský L-12 (10 ng/ml), rekombinantní lidský IL-18 (10 ng/ml a rekombinantní lidský L{{ 13}}(10 ng/ml) (R&D Systems, USA) po dobu 48 hodin a poté nahrazeno aktivovaným médiem (270 ng/ml rekombinantního lidského IL-2, 20 ng/ml rekombinantního lidského IL-12 , 20 ng/ml rekombinantního lidského IL-18 a 20 ng/ml rekombinantního lidského IL-21) pro další kultivaci. Hustota buněk byla udržována na 1×10 stupňů buněk/ml. 28. den kultivace bylo odebráno malé množství autologních NK buněk pro kontrolu kvality a intravenózně reinjektováno spolu s autologními NK buňkami v hustotě 4,15×10 stupňů (3.76-5,87×10) buněk, s dobou infuze 30 minut Experimentální proces byl proveden v souladu se správnou klinickou praxí. Časový interval pro druhý odběr krve byl asi 37 (25-57) dnů.
Izolace T buněk a NK buněk lidské periferní krve Čerstvá krev byla získána od zdravých dobrovolníků po poskytnutí informovaného souhlasu a protokol byl schválen institucionálním kontrolním výborem Čínské farmaceutické univerzity (číslo povolení: SYXK{0}}). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Kanada) byl použit k izolaci lidských PBMC. Lidské CD3 plus T buňky byly získány z PBMC s použitím magnetických kuliček pro třídění lidských CD3 T buněk (Miltenyi Biotec, Německo) v souladu s protokolem výrobce. NK buňky byly izolovány z periferní krve pomocí RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) podle protokolu výrobce
Separace a expanze myších NK buněk in vitro
NK buňky myší sleziny byly izolovány pomocí NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, byly získány myší sleziny, buňky sleziny byly filtrovány pomocí 70μm buněčného filtru a lymfocyty sleziny byly získány centrifugací v hustotním gradientu pomocí soupravy pro separaci lymfocytů myší sleziny (Solarbio, Čína). Lymfocyty sleziny byly shromážděny za účelem získání vysoce čistých NK buněk pomocí magnetických kuliček k oddělení myších NK buněk. Izolované NK buňky sleziny byly kultivovány v udržovacím RPMI-1640 médiu doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS), 1 procenta L-glutaminu, 1 procenta penicilinu/streptomycinu, 1 procenta minimálního esenciálního média (MEM) esenciální aminokyselina, 1% kyselina pyruvát sodný a 50 uM merkaptoethanol (vše od Life Technologies, USA). Kromě toho bylo přidáno 200 IU/ml rekombinantního interleukinu 2 (RL-2) (PeproTech, USA) a 10 ng/ml myši I-15(ml-15)(PeproTech) střední. Poté byly odebrány 10stupňové NK buňky a 10stupňové ozářené slezinné lymfocyty a 5 ml amplifikačního média (udržovací médium doplněné 1000 IU/ml rlL-2, 10ng/ml ml-15 a 30ng/ml anti -NKp46 protilátka (PA5-46986,Invitrogen,USA)).
Obr. 3 SNC aktivují NK buňky a byly zabity NK buňkami. Průtoková cytometrie pro detekci exprese (A) CD69 a (B) IFN-y byla provedena po 24 hodinách společné inkubace s myšími NK buňkami a preadipocyty nebo ozářením indukovanými preadipocyty. n =3. Data jsou prezentována jako průměr ± SD. Rozdíly byly hodnoceny dvoustranným nepárovým neparametrickým t-testem. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">
Extrakce preadipocytů a svalových satelitních buněk
Preadipocyty byly extrahovány, jak bylo popsáno dříve [11]. Stručně řečeno, lidský nebo myší tuk byl odstraněn za sterilních podmínek a nařezán na kousky 1-2 mm, dvakrát promyt PBS a štěpen kolagenázou II (Solarbio) při 37 stupních po dobu 1 hodiny. Poté byly buňky filtrovány 100 μm buněčným filtrem, centrifugovány při 300 g po dobu 5 minut a shromážděny. Adherující buňky byly kultivovány v a-MEM doplněném 20 procenty FBS po dobu 12 hodin a štěpeny trypsinem, aby se shromáždily adherentní buňky. Svalové satelitní buňky byly izolovány, jak bylo popsáno dříve [34]. Čtyřhlavý sval byl nařezán na kousky 1-2 mm a bylo přidáno 5 ml kolagenázy II pro trávení při 37 °C po dobu 12 minut. Směs byla promíchána pipetou a po dalším štěpení po dobu 12 minut bylo přidáno 5 ml kompletního média. Buňky byly filtrovány pomocí 70 μm buněčného filtru a centrifugovány při 300 g po dobu 5 minut. Pak byly buňky
kultivovány s 5 ml média přidávaného denně po dobu 4 dnů. Přilnuté buňky byly odfouknuty pipetou a centrifugovány při 2000 x g po dobu 5 minut. Po štěpení trypsinem při 37 stupních po dobu 5 minut byly buňky centrifugovány při 2000 x g po dobu 5 minut a shromážděny. Poté bylo přidáno 5 ml F-10 Hamova média doplněného 20 procenty FBS a 4 ng/ml základního fibroblastového růstového faktoru (PeproTech).
Cytotoxicita myších slezinných NK buněk vůči SNC byla detekována testem laktátdehydrogenázy
SNC byly indukovány 0,2 μM Adriamycinem (MedChemExpress, USA) po dobu 24 hodin nebo pokračující kultivací po dobu 20 dnů po 10 Gy rentgenovém záření. Poté bylo 5000 SNC umístěno na misku a byly přidány NK buňky sleziny (životaschopnost buněk: 93.5-97,1 procenta) v poměru efektoru k cíli 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25: 1,3,125:1 a 1,563:1. Supernatanty byly shromážděny po společné kultivaci při 37 °C po dobu 24 hodin a pro detekci byla použita souprava pro detekci laktátdehydrogenázy (LDH) Cytotoxicity (Cayman Chemical, USA). Cytotoxicita byla vypočtena podle následujícího vzorce: cytotoxicita (procenta)=(experiment se směsí buněk – spontánní cílová buňka – spontánní efektorová buňka)/(maximální počet cílových buněk – spontánní cílová buňka) × 100.
Živé zobrazování
Dvanáct 10-týdenních myší C57BL/6 bylo zakoupeno od Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Čína). Poté 1×10 stupňů 1,1'-oktadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindokarbocyanin jodid (DiR) (Invitrogen)-značená kontrola
preadipocyty nebo radiací indukované senescentní preadipocyty byly resuspendovány ve 200 ul fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a injikovány do břišní dutiny myší jehlou 22 gauge. Po třech dnech bylo do ocasní žíly injikováno 5x10 stupňů alogenních NK buněk (životaschopnost buněk: 93.6-96,2 procenta) ve 100 ul PBS. Desátý den byly myši anestetizovány isofluranem. Fluorescence byla detekována pomocí MS 100 Series In Vivo Imaging System (PerkinElmer, MA, USA).
Průtoková cytometrie
K detekci apoptózy SNC koinkubovaných s DiR-značenými slezinnými NK buňkami (životaschopnost buněk: 91.8-93,2 procenta ), byly 1×10 stupňů SNC štěpeny s přesností při 37 stupních po dobu 10 minut a poté obarveny s Annexin V a Propidium jodid (PI) Apoptosis Stained Kit (Multisciences Biotech Co, Ltd., Čína) podle protokolu výrobce. SNC byly hradlovány v DiR-negativní pozici. Pro testování aktivace NK buněk byly myší NK buňky shromážděny a obarveny mNK1.{11}}alofykocyaninem (APC)(S17016D) a myším shlukem diferenciace 69-R-fykoerythrin-cyaninem7 (mCD{{{{101} 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) při 4 stupních po dobu 30 minut. Poté byly buňky zpracovány pomocí soupravy CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, USA) a obarveny myším interferonem gama-brilliant violet 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) při 4 stupních po dobu 30 minut. Perforin-APC(S16009A) barvení lidských NK buněk bylo provedeno pomocí stejného protokolu, jaký byl použit pro extracelulární barvení (CD56-fluorescein isothiokyanát [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) a intracelulární barvení (perforin-APC) (Biolegend).
Pro detekci NK buněk periferní krve bylo odebráno 100 ul antikoagulační krve. Pro periferní krev myší byly přidány CD3-FITC, NK1.1-APC a CD69-PE-Cy7. Pro lidskou periferní krev byly přidány CD3-BV421 (OKT3) a CD56-FITC a inkubovány po dobu 20 minut při pokojové teplotě.
Poté bylo přidáno 400 ul 1× erytrocytového lyzátu (BD Biosciences) a inkubováno po dobu 3 minut, poté následovaly tři promytí PBS. Pro detekci buněčné proliferace v tukové tkáni bylo myším intraperitoneálně injikováno 200 ul 10 mg/ml bromodeoxyuridinu (BrdU) 24 a 72 hodin před eutanazií. Po eutanazii byly depoty tříselného tuku odstraněny a rozřezány na fragmenty, štěpeny při 37 °C po dobu 30 minut kolagenázou II a DNázou a filtrovány pomocí 100 um buněčného filtru. Buňky byly zpracovány pomocí soupravy Cytofix/Cytoperm Plus Kit a obarveny BrdU-FITC (3D4) a Ki67-PE (16A8). Průtoková cytometrie byla prováděna na průtokovém cytometru CytoFLEX. K vyloučení mrtvých buněk ve všech experimentech byla použita sada LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). Data byla analyzována pomocí softwaru FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).
Reverzní transkripčně-kvantitativní PCR
RNA byla extrahována pomocí činidla Trizol a obrácena a transkribována do cDNA pomocí soupravy Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Yepsen Biotechnology, Čína). Kvantitativní PCR (qPCR) byla provedena pomocí reakční směsi SYBR Green (Yepsen Biotechnology) na systému ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), přičemž GAPDH sloužil jako vnitřní kontrola. Data byla analyzována pomocí metody 2-△ACT. Seznam sekvencí primerů je uveden v doplňkovém materiálu (tabulka 2-3).
Barvení galaktozidázou spojené se stárnutím
Pro barvení buněk byly buňky jednou promyty PBS, fixovány v roztoku galaktosidázy (SA- -gal) spojené se stárnutím (Cell Signaling Technology, USA) při teplotě místnosti po dobu 15 minut, třikrát promyty PBS a inkubovány přes noc v roztoku barvení SA- -gal při 37 °C. Destička byla utěsněna parafilmem, aby se zabránilo odpařování barvícího média. buňky
byly promyty PBS a pozorovány mikroskopem. Pro barvení zmrazených řezů byly řezy sušeny při 37 stupních po dobu 30minut a fixovány při pokojové teplotě v roztoku SA- -gal fixace po dobu 15 minut. Řezy byly třikrát promyty PBS a inkubovány přes noc v roztoku pro barvení SA- -gal při 37 °C. Poté byly barveny eosinem po dobu 1 minuty a oplachovány vodou po dobu 2 minut. Data barvení SA- -gal byla analyzována pomocí softwaru Image-Pro Plus 6.0.
Explantáty lidské tukové tkáně
Tuková tkáň od tří jedinců byla získána liposukcí. Jeden ze subjektů byl muž a dva byly ženy. Průměrný věk subjektů byl 57.{1}}±7,6 let (průměr ±SD: rozsah, 50-65). Průměrný BMI byl 40,5±5,1 kg/m2（průměr ± SD; rozsah, 36.{10}}.2）. Experimentální schéma schválila etická komise Shanghai Mengchao Cancer Hospital (č. 05, 2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital). U všech dobrovolníků byl získán informovaný souhlas. Tuková tkáň byla nařezána na malé kousky o průměru asi 2 mm. Do každé jamky 96-jamkové destičky bylo umístěno pět kousků tkáně a 200 ul buď preadipocytů nebo kondicionovaného média z radiací indukovaných senescentních preadipocytů, doplněných 10 procenty lidského AB séra, 1 procenta L-glutaminu, 1 procent penicilinu/streptomycinu, 1 procento MEM neesenciálních aminokyselin a 1 procento kyseliny pyruvátu sodného bylo přidáno do společné kultury na 24 hodin. Poté bylo médium nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím 5×10 stupňů autologních NK buněk (životaschopnost buněk: 92.3-95,7 procenta 6) a kultivováno dalších 48 hodin, poté byly NK buňky odebrány pro průtokovou cytometrii. Tuková tkáň byla pětkrát promyta PBS a stejné médium bylo přidáno pro další kultivaci po dobu 48 hodin; supernatant (100 ul) byl použit pro multifaktorovou detekci. Preadipocyty nebo radiací indukované senescentní preadipocyty byly odvozeny z tukové tkáně stejného jedince.
Tento článek je převzat z Cell Death and Disease (2022) 13:305