Cistanosid Of Cistanche Herba zmírňuje poškození mužské reprodukce způsobené hypoxií prostřednictvím potlačení oxidačního stresu-Ⅱ

Účinky Cis na životaschopnost GC-1 buněk indukovanou hypoxií in vitro.

Aby bylo možné zjistit, zda Cis může zabránit inhibičním účinkům hypoxie na životaschopnost buněk GC {{0}}, byl proveden test CCK-8. GC-1 buňky byly ošetřeny různými podtypy (Cis-A, B, C, H) a koncentračními rozsahy (0.02 μM, 0,2 μM, 2 uM) Cis po dobu 72 hodin. Srovnání modelové skupiny se skupinou DMSO ukázalo, že DMSO přímo nepodporovalo životaschopnost buněk GC{{10}} (obrázek 2A). Buněčná životaschopnost však byla výrazně obnovena (P < 0.05) pomocí léčby Cis. Ve srovnání s modelovou skupinou vykazovaly Cis-A, Cis-B, Cis-C a Cis-H určité ochranné účinky na poškození životaschopnosti GC-1 buněk vyvolané hypoxií a Cis-B vykazovaly nejvýznamnější účinek (obrázek 2A). Ochranné účinky Cis při 0,2 μM byly významně vyšší než ochranné účinky Cis při 0,02 μM, zatímco rozdíl mezi 2 μM a 0,2 μM nebyl zřejmý, což naznačuje, že obnovená Životaschopnost buněk GC-1 indukovaná Cis prokázala na dávce závislé zvýšení koncentračního rozsahu od 0,{32}},2 μM (obrázek 2A). Podle experimentálních potřeb byla proto v následujících experimentech in vitro vybrána jako optimální koncentrace 0,2 μM Cis. Pro další potvrzení, zda byly zárodečné buňky skutečně chráněny pomocí Cis, bylo provedeno barvení FCM a Ki-67, aby se vyhodnotila změna proliferace buněk GC-1 po ošetření Cis. Po ošetření Cis se snížil podíl GC-1 buněk ve fázi G1. Na rozdíl od toho do S fáze vstoupilo více buněk, což naznačuje, že léčba Cis by mohla zvýšit index proliferace zárodečných buněk (P < 0,01; obrázek 2B). Statistiky buněčného cyklu GC-1 jsou uvedeny na obrázku 2Bb. Výsledky barvení Ki-67 také ukázaly, že léčba Cis-A, Cis-B, Cis-C a Cis-H významně zlepšila poměr Ki-67-pozitivních buněk u hypoxií indukované GC{{54} } buněk in vitro (obrázek 2C).

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mechanismus Cis chrání zárodečné buňky před hypoxií in vitro.

Aby se zjistilo, zda ochranné účinky Cis na GC-1 buňky souvisely s odstraněním nadměrného ROS, bylo k detekci hladin ROS v každé skupině použito fluorescenční barvivo DCFH-DA. Jak je znázorněno na obrázcích 3A a 3B, léčba DMSO nezměnila intracelulární obsah ROS nebo hladinu LPO ve srovnání s modelovou skupinou. Nicméně hladiny ROS v GC-1 buňkách byly výrazně sníženy ve skupinách léčených Cis (obrázek 3A). Kromě toho byl pokles LPO také pozorován v GC-1 buňkách vystavených Cis (obrázek 3B).

K dalšímu prozkoumání mechanismu, kterým Cis chrání zárodečné buňky před hypoxickým poškozením, bylo provedeno barvení TUNEL a analýza Western blot pro hodnocení apoptózy. Barvení TUNEL (obrázek 3C) ukázalo významnou apoptózu v modelových a DMSO skupinách. Při léčbě Cis však bylo pozorováno méně apoptotických buněk, což naznačuje, že léčba Cis snížila apoptózu GC-1 buněk. Kromě toho byla měřena exprese PARP, kaspázy-3, Bax a Bcl-2, aby se potvrdil molekulární mechanismus. Jak je znázorněno na obrázku 3D, kaspáza-3 a PARP byly aktivovány v buňkách GC-1 při hypoxii a tato aktivace byla inhibována působením Cis. Kromě toho byl poměr Bax/Bcl-2 vyšší v modelové skupině než v kontrolní skupině a léčba Cis snížila poměr Bax/Bcl-2 (obrázek 3D). Tato data naznačují, že Cis má potenciální schopnost zmírnit poškození oxidantem vyvolané hypoxií a tohoto ochranného účinku lze dosáhnout snížením akumulace ROS a inhibicí aktivace apoptózy související s kaspázou.

Enzymatický mechanismus inhibující OS zahrnuje lapače volných radikálů, jako je glutathionreduktáza (GR), glutathionperoxidáza (GPx) a superoxiddismutáza (SOD) [23]. Enzymatický mechanismus inhibující OS hraje zásadní roli v prevenci oxidačního poškození v buňkách a tkáních [23]. Pro další ověření potenciálního mechanismu Cis inhibice hypoxií indukovaného OS v GC-1 buňkách byly měřeny aktivity GR, GPx a SOD. Výsledky ukázaly, že všechny aktivity GR, GPx a SOD významně (P < 0.01, obrázek 3E) poklesly při hypoxii ve srovnání s kontrolními skupinami a léčba Cis výrazně obnovila jejich aktivity v GC-1 buňky vystavené hypoxii (P < 0,05, obrázek 3E), což naznačuje, že tyto sloučeniny by mohly aktivovat silný endogenní antioxidační systém.

CISTANCHE TUBULOSA PRO STIMULACI PRODUKCE SPERM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Účinky Cis na reprodukci u potkanů ​​vyvolaných hypobarickou hypoxií.

Abychom určili účinky hypobarické hypoxie na samce potkanů, nejprve jsme testovali morfologické změny varlat u potkanů ​​vyvolaných hypobarickou hypoxií. Výsledky barvení HE ukázaly, že v kontrolní skupině byly normální spermatogenní buňky v různých stádiích uspořádány uspořádaným způsobem od bazální membrány k lumenu a zralé spermie byly viditelné v lumen tubulů (obrázek 4A). Ve srovnání s kontrolami byly v modelové skupině pozorovány patologické změny testikulární tkáně, bazální membrána testikulárních epiteliálních buněk byla uspořádána volně, spermatogenní epitel byl extrémně tenký a hladina a počet zárodečných buněk byly výrazně sníženy (obrázek 4A). . Léčba Cis však pozoruhodně zlepšila histologii poškození varlat vyvolaného hypobarickou hypoxií in vivo (obrázek 4A). Změřili jsme také tělesnou hmotnost, hmotnost varlat, hmotnost nadvarlat a hmotnost semenné žlázy, což vedlo k výpočtu indexu reprodukčních orgánů (poměr reprodukční orgán/tělesná hmotnost). Jak je znázorněno na obrázku 4B-D, index reprodukčních orgánů (varlata, nadvarlata a semenná žláza) byl výrazně nižší v modelové skupině (P < 0.01) než v kontrolní skupině. Účinek hypobarické hypoxie na index reprodukčních orgánů krys byl zvrácen působením Cis (obrázek 4B-D).

Dále byla také měřena aktivita akrozomového enzymu a počet živých spermií samčích potkaních spermií, aby se objasnilo poškození funkce varlat. Jak je znázorněno na obrázku 4E, 4F, aktivita akrozomového enzymu a motilita spermií byly nižší v modelové skupině potkanů ​​než v kontrolní skupině (P < 0.01). Avšak ve srovnání s krysami v modelové skupině byla aktivita akrozomového enzymu obnovena u krys léčených 8 mg/kg/d Cis (P < 0,05) (obrázek 4D). Navíc, jak je znázorněno na obrázku 4F, také ošetření Ciszvýšil počet živých spermií; všechny krysy, kterým bylo podáváno 8 mg/kg/d Cis, vykazovaly významně zvýšený počet živých spermií (55,83 ± 6.03 %, P < 0.05; 69.{101} {8}} ± 2,29 %, P < 0,01, P < 0,05 a 53,67 ± 2,25 %, P < 0,05) ve srovnání s modelem potkanů ​​(43,83 ± 4,01 %); .

Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že hypobarické hypoxické prostředí vedlo k morfologickým změnám varlat, úbytku hmotnosti reprodukčních orgánů a poškození funkce varlat u samců potkanů ​​a Cis mohl účinně chránit reprodukční orgány před poškozením vyvolaným hypoxií.

Účinky Cis na OS ve varlatech potkanů ​​vyvolaných hypobarickou hypoxií.

Hladiny ROS a LPO ve varlatech krys byly měřeny za účelem analýzy účinků Cis na OS indukovaný hypobarickou hypoxií. Analýza ROS odhalila, že ve srovnání s kontrolní skupinou byly hladiny ROS ve varlatech v modelové skupině významně zvýšené (P < 0.01 Obrázek 5A). Naopak, LPO byl dramaticky zvýšený ve varlatech (P < 0 0,01) za hypobarické hypoxie ve srovnání s normoxickými podmínkami (obrázek 5B). Léčba Cis však změnila výše uvedené změny (P < 0,05), ve kterých měl Cis-B lepší účinky než ostatní Cis (obrázek 5A, 5B). Zdá se, že Cis chrání varlata snížením OS za hypobarických hypoxických podmínek in vivo.

Kromě toho byly provedeny analýzy apoptózy, aby se dále vyhodnotil mechanismus, kterým Cis chránil proti poškození varlat vyvolané hypobarickou hypoxií. Výsledky barvení TUNEL (obrázek 5C) ukázaly, že v modelové skupině existovala významná apoptóza ve srovnání s kontrolní skupinou. Avšak po léčbě Cis (8 mg/kg/d) se objevilo méně apoptotických buněk (P < 0,05) (obrázek 5C). Data Western blot také ukázala, že hypoxie a hypobarická léčba vedly k aktivaci kaspázy-3 a PARP a zvýšenému poměru Bax/Bcl-2 v testikulární tkáni, což ukazuje na zvýšení apoptózy (obrázek 5D). Kromě toho různé druhyCis léčbavýznamně snížila apoptózu ve tkáni varlat (obrázek 5D). Podobně analýza IHC testikulární tkáně ukázala podobné výsledky (doplňkový obrázek 1).

Pro ověření mechanismu Cis-redukovaného OS spouštěného hypobarickou hypoxií jsme dále testovali aktivity GR, GPx a SOD v testikulární tkáni. Jak je znázorněno na obrázku 5E, ve srovnání s kontrolní skupinou léčba hypobarické hypoxie významně snížila aktivity GR, GPx a SOD (P < 0.01). Léčba Cis však obnovila enzymové aktivity (GR, GPx a SOD) tkáně varlat u potkanů ​​léčených hypobarickou hypoxií (P < 0,05). Závěrem lze říci, že Cis zřejmě chrání varlata aktivací silného endogenního antioxidačního enzymového obranného mechanismu za podmínek hypobarické hypoxie.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskuse

V oblastech s vysokou nadmořskou výškou je známo, že hypobarická hypoxie postihuje více systémů u lidí, včetně mužského reprodukčního systému [4, 20]. Nedávné experimentální výzkumy jsou zaměřeny na pochopení mechanismů toho, jak hypobarická hypoxie narušuje mužský reprodukční systém. V této studii byl zkoumán terapeutický účinek Cis extraktu z Cistanches Herba na hypoxií vyvolané reprodukční poškození. Výsledky ukázaly, že Cis může chránit mužský reprodukční systém před hypoxickým poškozením snížením akumulace ROS a OS vyvolané hypoxií zvýšením aktivity endogenních antioxidačních enzymů.

ROS jsou volné radikály odvozené od kyslíku, které hrají zásadní roli v lidské fyziologii a patologii. Nízké dávky ROS jsou nezbytné prokapacita spermiíakrozomová reakce a fúze spermatozoa-oocyt [24, 25]. Nadměrná akumulace ROS však často vede k poškození zárodečných buněk a buněk stromatu, což vede k mužské neplodnosti [26]. ROS může peroxidací snadno poškodit buněčné membrány, nukleové kyseliny, proteiny, enzymy a další biologické makromolekuly. Navíc také vedou k potenciálnímu poškození buněk a DNA, když překročí antioxidační kapacitu. Nashromážděné důkazy podporují klíčovou roli ROS v patogenezi mužské fertility [27, 28]. Produkce ROS je regulována napětím kyslíku. V hypoxických podmínkách se snižuje dostupný kyslík v prostředí a zvyšuje se viskozita krve, čímž dochází k ovlivnění mnoha na kyslíku závislých metabolických procesů v organismu [29, 30]. Nižší atmosférický tlak ve vysokých nadmořských výškách však způsobuje špatný žilní návrat a pokles množství kyslíku transportovaného krevním řečištěm do všech buněk organismu, což dále zvyšuje hypoxii orgánů a buněk [29, 30]. Vystavení vysoké nadmořské výšce tedy vede k řadě hypoxických fyziologických reakcí, včetně produkce a akumulace ROS, když poptávka po kyslíku převyšuje vaskulární zásobu. Jak již bylo zmíněno dříve, akumulace ROS vede k řadě intracelulárních účinků, z nichž nejkritičtější je způsobit OS v buňkách.

OS označuje nerovnováhu mezi oxidačními a redukčními reakcemi, což vede k tvorbě přebytečných oxidantů nebo molekul, které přijímají elektron z jiného reaktantu, což zase produkuje ROS [31, 32]. OS je dobře známo, že může být spuštěn řadou endogenních a exogenních faktorů, včetně vystavení vysoké nadmořské výšce. Spermie jsou buňky, které jsou zvláště citlivé na OS vzhledem k jejich neadekvátním systémům opravy buněk a vysokému obsahu polynenasycených mastných kyselin v plazmatické membráně [33]. Testikulární a epididymální tkáně nejsou výjimkou, protože přítomnost těžké OS byla pozorována u kulatých spermatid u potkanů ​​vystavených hypoxii [4]. OS ovlivňuje stabilitu DNA, čímž ohrožuje integritu genetického materiálu gamet [34-36]. Bylo však potvrzeno, že vysoká úroveň poškození DNA u mužských gamet vede k aktivaci signalizace apoptózy, což má za následek snížení počtu spermií nadvarlete a zvýšení procenta defektních buněk [28, 37]. V této studii hypoxie významně snížila životaschopnost GC-1 buněk prostřednictvím indukce apoptózy a zástavy buněčného cyklu. Ještě důležitější je, že významně zvýšené hladiny ROS prokázala FCM analýza po stimulaci hypoxie, se zvýšenou mírou apoptózy a vyšší aktivací poměru kaspázy-3, PARP a Bax/Bcl-2, což naznačuje, že ROS může aktivovat apoptóza aktivací kaspázové signální dráhy během hypoxií indukovaného poškození plodnosti. Současná zjištění prokázala, že hypoxie vedla k nadměrné akumulaci ROS, což způsobuje oxidační poškození reprodukčních buněk. Je tedy smysluplné identifikovat nové antioxidanty, které mohou sloužit jako účinný přístup ke zmírnění poškození plodnosti způsobené hypoxií.

K ochraně před OS existuje v těle komplexní antioxidační systém složený převážně z enzymatických faktorů. Za fyziologických podmínek si obsah ROS a antioxidační systém udržuje určitou rovnováhu. Nadměrná produkce ROS však vyčerpává antioxidační systém spermií, což vede k OS, který způsobuje poškození DNA spermií a vede k nižší plodnosti a těhotenství [23]. K řešení nadprodukce ROS a souvisejících škodlivých účinků na buněčné úrovni v mužském reprodukčním systému byly tedy testovány různé antioxidační strategie [23]. V současné době existuje literatura týkající se použití sloučenin s antioxidační aktivitou azlepšení funkce spermiíje rozsáhlý. Důležité je, že většina zpráv popisuje zlepšení parametrů spermií po perorálním příjmu antioxidantů, včetnězlepšení koncentrace spermiía motility nebo snížení poškození DNA [38]. Rostoucí počet urologů proto předepisuje perorální antioxidanty pro léčbu neplodnosti v důsledku problémů souvisejících s OS [39]. Mezi tyto antioxidanty patří především karnitiny, vitamíny, zinek, melatonin a přírodní sloučeniny [23, 40]. V současné době, s rozvojem technologie extrakce léků, se také uvažuje o rostoucím počtu extraktů TCM ke zmírnění mužské neplodnosti, protože tyto antioxidanty mohou snížit destruktivní účinky OS [41]. Yüce A. a kol. v roce 2013 uvedli, že skořice má příznivé účinky na oxidační a antioxidační rovnováhu ve varlatech a kvalitu spermií [42]. Zhang L a kol. ukázali, že kurkumin významně zlepšuje motilitu spermií u pacientů a snižuje H2O2 [43]. Kromě toho bylo prokázáno, že řada dalších rostlinných extraktů, jako je borůvka, krokus sativus, semena granátového jablka a zelený čaj, chrání reprodukční systém prostřednictvím antioxidačních mechanismů [27, 44-47]. Cistanches Herba je důležitý TCM, který má mimo jiné příznivý bezpečnostní profil a široké léčebné funkce pro léčbu neplodnosti [13]. Moderní farmakologické studie ukázaly, že Cistanches Herba má různé aktivity, jako jsou antioxidační, protizánětlivé, hepatoprotektivní a antineurodegenerativní aktivity [13, 48]. Proto mohou mít extrakty, frakce nebo sloučeniny z Cistanches Herba potenciální antioxidační vlastnosti pro léčbu neplodnosti.

Mezi účinné látky v rostlinách, které zlepšují plodnost, patří různé chemické skupiny, jako jsou PhG, saponiny, kyslíkaté těkavé sloučeniny a alkaloidy [41]. Studie farmakologické aktivity PhGs prokázaly, že PhGs vykazují širokou škálu biologických aktivit, jako je antioxidace, antiradiační neuroprotekce a zvýšení sexuální funkce [49, 50]. Mezi těmito aktivitami postupně přitahuje pozornost antioxidace. Bylo popsáno, že některé jednotlivé složky nebo frakce PhGs inhibují apoptózu zárodečných buněk indukovanou různými chemikáliemi a jejich antioxidační schopnosti in vitro byly také prokázány in vivo na několika zvířecích modelech [51, 52]. Tyto výsledky naznačují, že PhG by mohly být atraktivním kandidátemléčba mužské neplodnosti. Cis je aktivní PhG, který lze izolovat z Cistanches Herba. V této studii jsme zkoumali účinky Cis na buňky ošetřené hypoxií nebo potkaní model a zkoumali základní molekulární mechanismy. Cis vykazoval ochranné účinky na snížení životaschopnosti vyvolané hypoxií a zvýšení apoptózy v GC-1 buňkách a také prokázal ochranný účinek na poškození vyvolané hypoxií v reprodukčním systému potkanů ​​in vivo. Byl pozorován významný pokles aktivit GR, GPx a SOD při hypoxii ve srovnání s normoxickými skupinami, zatímco specifické aktivity GR, GPx a SOD významně vzrostly u varlat nebo GC-1 buněk ošetřených Cis. Zdá se, že Cis chrání varlata a GC-1 buňky za hypoxických podmínek zvýšením aktivity antioxidačních enzymů.

Enzymové antioxidanty fungují hlavně tak, že vychytávají superoxidové anionty, čímž zabraňují peroxidaci lipidů a poškození DNA, aby se zabránilo neplodnosti. Enzymatické antioxidační mechanismy hrají zásadní roli v prevenci oxidačního poškození [23]. Enzymatický mechanismus proti OS zahrnuje lapače volných radikálů a enzymy závislé na glutathionu včetně GR, GPx a SOD [12]. Antioxidační enzymy jsou dobře známé jako nezbytné pro mužský reprodukční systém. V současné studii byl účinek snížené aktivity antioxidačních enzymů při hypobarické hypoxii doprovázen zvýšeným ROS a LPO v modelové skupině, což je v souladu s předchozími zprávami [12]. Podání Cis však vedlo k obnovení aktivit antioxidačních enzymů v buňkách GC-1 a varlatech potkanů, což umožnilo vytvořit strategie pro podávání přípravku Cistanches Herba k prevenci poškození způsobeného hypobarickou hypoxií, jak bylo dříve navrženo. Ačkoli současné výsledky ukázaly, že léčba Cis částečně snížila hypoxií indukované poškození zárodečných buněk u potkanů, jsou zapotřebí další výzkumy k odhalení úplného obrazu jeho reprodukčních ochranných účinků. Například specifický mechanismus Cis ovlivňuje aktivitu antioxidačních enzymů. Kromě toho existuje otázka, zda by mohly být relevantní i nějaké další mechanismy, protože Cis se jen částečně zotavil z reprodukčního poškození způsobeného hypoxií. Konečně je třeba zvážit, zda má Cis přímý účinek na podporu růstu na zárodečné buňky.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO UDRŽOVÁNÍ AKTIVITY SPERM PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Závěry

Obecně, zjištění této studie zdůrazňují potenciál Cis jako antioxidantu pro léčbu hypoxií indukovaného mužského reprodukčního poškození. Cis může chránit před hypoxií vyvolaným poškozením mužské reprodukce obnovením aktivity antioxidačních enzymů, snížením OS indukovaném ROS, současným zvýšením životaschopnosti buněk a snížením apoptózy. Důležité je, že všechny podtypy Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C a Cis-H) studované v této studii vykazovaly určitý ochranný účinek na reprodukční systém a nejvýraznější účinek vykazoval Cis-B. Proto spekulujeme, že Cis by mohl být dobrým kandidátem na antioxidantléčba hypoxií indukovaného mužského reprodukčního poškození, ačkoli přesný základní mechanismus vyžaduje další zkoumání.