Porovnání obsahových rozdílů osmi chemických složek v surových a vínem zpracovaných produktech dvou druhů Cistanche Deserticola na základě UPLC Ⅱ
Jun 16, 2025
2. Metody a výsledky
2.1 Chromatografické podmínky
UPLC analýza byla provedena za použití aKolona Waters ACQUITY UPLC™ BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, velikost částic 1,7 μm). Mobilní fáze se skládala zmethanol (A)a0,1% vodný roztok kyseliny mravenčí (B)s následující gradientovou elucí:
0–4 min: 10 % → 26 % A
4–18 min: 26 % → 40 % A
18–20 min: 40 % → 50 % A
Průtok:0,3 ml/min
Objem vstřiku:3 μl
Teplota kolony:35 °C
Detekční vlnová délka:330 nm
2.2 Příprava roztoků
2.2.1 Smíšený referenční roztok
Zvažte přesně následující standardní sloučeniny:cistanosid F, echinakosid, cistanosid A, verbascoside, tubulosid A, isoverbaskosid, 2'-acetylverbaskosidatubulosid B. Rozpusťte v 50% methanolu za účelem přípravy referenční směsi s následujícími koncentracemi (µg·mL⁻¹):
Cistanosid F: 32,7
Echinakosid: 102,4
Cistanosid A: 50,2
Verbaskosid: 80,6
Tubulosid A: 25,6
Isoverbaskosid: 86.3
2'-Acetylverbaskosid: 77,3
Tubulosid B: 60,8
2.2.2 Vzorový roztok
Syrové plátky Cistanchebyly připraveny změkčením byliny, krájením a sušením.
Cistanche dušená ve víněbyl připraven namočením syrových plátků do 30% rýžového vína, napařováním směsi po dobu 12 hodin, ochlazením a opětovným sušením.
Přibližně0.2 gvysušeného prášku (prošel sítem 65 mesh) bylo naváženo do 50 ml jantarové odměrné baňky, extrahováno 25 ml 50% methanolu, sonikováno po dobu 40 minut (250 W, 35 kHz) a převedeno zpět na váhu. Roztok byl zfiltrován přes a0,22 μm membránaa filtrát byl použit pro analýzu.
Poznámka: H. Desert Cistanche; G. Tubulosa Cistanche; RH. Cistanche deserticola syrové plátky; RG. Cistanche tubulosa syrové plátky; WH. Cistanche deserticola dušená na víně; WG. Cistanche tubulosa dušená na víně; Obrázky 4 až 7 jsou stejné.
Obrázek 1 Obrázky léčivých materiálů Cistanche deserticola a Cistanche tubulosa, syrové plátky a dušené na víně
slavné víno cistanche prodávané v Číně
Podpůrná služba Wecistanche – kontaktujte nás a získejte podrobnosti o vzorku nebo velkoobchodu
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
2.3 Kvantitativní analýza 8 hlavních sloučenin v syrovém a vinně zpracovaném cistanche
2.3.1 Vhodnost systému
Za popsaných chromatografických podmínek bylo teoretické číslo desky proechinakosid exceeded 6000 with good resolution (>1.5). Chromatogramy směsného standardu, surového pouštního Cistanche a vzorků zpracovaného vína jsou uvedeny na obrázku 2.
Identifikace vrcholu:
Cistanosid F
Echinakosid
Cistanosid A
Verbascoside
Tubulosid A
isoverbaskosid
2'-Acetylverbaskosid
Tubulosid B
cistanche deserticola
cistanche tubulosa
2.3.2 Linearita a meze detekce
Standardní kalibrační křivky byly stanoveny pomocí sériových ředění referenční směsi v koncentracích 0,1 až 5,0 ml. Kalibrační křivky byly vytvořeny vynesenímkoncentrace (X)versusoblast vrcholu (Y). Byly stanoveny detekční limity (LOD, S/N=3) a kvantifikační limity (LOQ, S/N=10) a potvrdily dobrou linearitu napříč testovanými rozsahy.
2.3.3 Přesnost
Ukázalo se šest opakovaných injekcí smíšeného referenčního roztokurelativní směrodatné odchylky (RSD)špičkových oblastí v rozmezí od0,48 % až 2,14 %, což naznačuje vynikající přesnost přístroje.
2.3.4 Stabilita
Ukázková řešenísurový prášek Cistanche (číslo šarže. 160901)byly analyzovány po 0, 2, 4, 8, 12 a 24 hodinách. RSD ploch píku pro všech 8 sloučenin se pohybovaly od0,71 % až 1,93 %, potvrzujícístabilita roztoku do 24 hodin.
Tabulka 1. Vzorové informace o materiálech Cistanche
| Zdrojový druh | ID vzorku | Původ | Číslo šarže |
|---|---|---|---|
| Cistanche deserticola | H1 | Vnitřní Mongolsko | 160901 |
| H2 | Sin-ťiang | 1712301 | |
| H3 | Sin-ťiang | 1712305 | |
| H4 | Sin-ťiang | 1712306 | |
| H5 | Sin-ťiang | 1712307 | |
| H6 | Vnitřní Mongolsko | 1712308 | |
| H7 | Sin-ťiang | 180710 | |
| H8 | Sin-ťiang | 180710 | |
| H9 | Sin-ťiang | 180710 | |
| H10 | Sin-ťiang | 180711 | |
| Cistanche tubulosa | G1 | Sin-ťiang | 151201 |
| G2 | Sin-ťiang | 170301 | |
| G3 | Sin-ťiang | 1709001 | |
| G4 | Sin-ťiang | 170601 | |
| G5 | Sin-ťiang | 1712302 | |
| G6 | Sin-ťiang | 1712303 | |
| G7 | Sin-ťiang | 1712304 | |
| G8 | Sin-ťiang | 180710 | |
| G9 | Sin-ťiang | 180710 | |
| G10 | Sin-ťiang | 180712 |
| Echinakosid |
| Cistanosid A |
| Verbascoside |
2.3.5 Opakovatelnost
Šest nezávisle připravených replikátů stejné šarže Cistanche vykazovalo dobrou opakovatelnost. Průměrný obsah (mg·g⁻¹) a RSD byly následující:
| Sloučenina | Prům. Obsah (mg/g) | RSD (%) |
|---|---|---|
| Cistanosid F | 0.24 | 1.24% |
| Echinakosid | 4.49 | 0.25% |
| Cistanosid A | 0.56 | 1.93% |
| Verbascoside | 2.52 | 1.40% |
| Tubulosid A | 0.59 | 1.15% |
| isoverbaskosid | 1.49 | 0.71% |
| 2'-Acetylverbaskosid | 1.23 | 1.94% |
| Tubulosid B | 0.86 | 1.02% |
2.3.6 Test obnovy
Výtěžnost byla testována nástřikemšest replikátů prášku Cistanche (0,1 g)se známými koncentracemi 8 referenčních sloučenin. Průměrné výnosy se pohybovaly od95,56 % až 102,71 %, s RSD mezi1,44 % a 2,97 %, což naznačujevynikající spolehlivost extrakce a kvantifikace.
Poznámka: A. Smíšené reference; B. Raw Cistanche deserticola; C. Cistanche deserticola dušená na víně; 1. Cistanchesid F; 2. Echinakosid; 3. cistanchesid A; 4. verbascoside; 5. Tubulosid A; 6. isoverbaskosid; 7. 2΄-acetylverbaskosid; 8. Tubulosid B.
2.3.7 Kvantifikace aktivních sloučenin v syrové vs. víno zpracované cistanche
Každý vzorek byl testován v duplikátech. 8 cílových sloučenin bylo kvantifikováno v10 šarží Cistanche deserticola(syrové a zpracované víno) a10 šarží Cistanche tubulosa. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 3, která nabízí pohled na:
Druhově specifické rozdíly ve složení
Změny fytochemického obsahu po zpracování vína
Analytické snímání otisků prstů pro kontrolu kvality Cistanche
Tabulka 2. Kalibrační křivky, korelační koeficienty (r), lineární rozsahy, LOD a LOQ pro osm sloučenin
| Sloučenina | Kalibrační rovnice | r | Lineární rozsah (µg·mL⁻¹) | LOD (µg·mL⁻¹) | LOQ (µg·mL⁻¹) |
|---|---|---|---|---|---|
| Cistanosid F | Y=4.89 × 10⁹X + 3.31 × 10³ | 0.9999 | 0,327–32,700 | 0.0521 | 0.1300 |
| Echinakosid | Y=3.88 × 10⁹X + 1.71 × 10⁴ | 0.9999 | 1 024–102 400 | 0.0422 | 0.1339 |
| Cistanosid A | Y=5.08 × 10⁹X + 3.45 × 10³ | 0.9999 | 0,502–50,600 | 0.1006 | 0.4035 |
| Verbascoside | Y=3.88 × 10⁹X + 3.43 × 10³ | 0.9999 | 0,806–80,600 | 0.0732 | 0.1871 |
| Tubulosid A | Y=4.42 × 10⁹X + 1.07 × 10³ | 0.9999 | 0,256–25,600 | 0.0865 | 0.2876 |
| isoverbaskosid | Y=4.81 × 10⁹X + 5.29 × 10³ | 0.9999 | 0,863–86.300 | 0.0242 | 0.0734 |
| 2'-Acetylverbaskosid | Y=5.30 × 10⁹X + 2.99 × 10³ | 0.9999 | 0,773–77,300 | 0.0317 | 0.1024 |
| Tubulosid B | Y=5.17 × 10⁹X + 3.39 × 10³ | 0.9999 | 0,608–60,800 | 0.1794 | 0.3876 |
2.4 Srovnávací analýza chemického složení mezi druhy cistanche
K prozkoumánífytochemické rozdílymeziCistanche deserticolaaCistanche tubulosa, koncentrace osmi klíčůfenylethanoidové glykosidyz10 šarží vzorků surového a zpracovaného vínakaždého druhu byly vizualizovány pomocíkrabicové grafy (obrázek 3). Statistická analýza odhalila, že kromě2'-acetylverbaskosidatubulosid B, ukázala většina ostatních sloučeninvýznamné rozdíly (P < 0,05)mezi těmito dvěma druhy v surové i zpracované formě.
Konkrétně:
Vsyrové Cistanche, obsahcistanosid F, echinakosid, isoverbaskosid, tubulosid A a verbaskosidbylvýrazně nižšívC. deserticolave srovnání sC. tubulosa(P < 0,05).
Thevzorky zpracovaného vínaodrážely podobné trendy.
Zejména,cistanosid Abyl nalezen navyšší úrovně vC. deserticolaa bylnezjistitelnévC. tubulosa, což naznačuje, že může sloužit jako apotenciální markerová sloučeninapro druhovou diferenciaci.
PLS-DA Chemometrická analýza druhů Cistanche
A Částečná diskriminační analýza metodou nejmenších čtverců (PLS-DA)byla provedena s použitím údajů o koncentraci osmi sloučenin. Výslednýgrafy skóre (obrázek 4A)ukázaly, že surové a zpracované vzorky od obou druhů anoneshlukují se do jasně oddělených skupin.
Však,testy náhodných permutací (obrázek 4B)odhalil, že model bylnení přestrojenýjako skutečné hodnotyR²Y a Q²byly vyšší než u permutovaných modelů. Relativněnízké hodnoty Q²navrhnoutomezená předvídatelnost, pravděpodobně kvůlivnitroskupinová variabilitaapřekrývající se rozsahy sloučeninmezi surovou a zpracovanou formou.
Další modelování PLS-DA a VIP analýza
Byly zkonstruovány samostatné modely PLS-DA pro surové vzorky a vzorky zpracované vínem obou druhů k prozkoumánídruhově specifické chemické rozdíly. Bylo pozorováno následující:
Grafy skóre (obrázky 5A a 5C)ukázalzřetelné shlukovánímeziC. deserticolaaC. tubulosav surové i zpracované formě.
Ověření modelu (obrázky 5B a 5D)potvrdila dobrou prediktivní schopnost bez přemontování.
Proměnná důležitost v grafech projekce (VIP) (obrázky 6A a 6B)identifikované klíčové sloučeniny přispívající k diskriminaci druhů:
Prosurové vzorky: Cistanosid A, cistanosid F, echinakosidaverbascosidebyly nejvíce informativní.
Provzorky zpracovaného vína: Cistanosid Aatubulosid Bhráli dominantní role.
2.5 Vliv zpracování vína na fytochemii Cistanche
Vzhledem k podstatným rozdílům v obsahu sloučenin mezi šaržemi,byly vyrobeny mezi syrovými a vínem zpracovanými vzorkystejná várka. Výsledky, vizualizované pomocíhouslové výkresy (obrázek 7), odhalil následující:
VC. deserticola, úrovně2'-acetylverbaskosid, cistanosid A, cistanosid F, echinakosid, tubulosid A a verbascosid výrazně kleslapost-processing (P < 0,05), zatímcotubulosid B zvýšené.
VC. tubulosa, úrovně2'-acetylverbascosid, echinakosid a verbascosidtakésnížena, zatímcoisoverbaskosid a tubulosid B zvýšenévýznamně (P < 0,05).
Tato zjištění naznačují, že zpracování vína může vést khydrolýza, izomerizacenebochemická přeměnaúčinných látek.
3. Diskuse
PodleVydání čínského lékopisu z roku 2020, Cistanche deserticolanesmí obsahovat méně než0.3%kombinovaného obsahuechinakosid a verbascosid, zatímcoCistanche tubulosanesmí obsahovat méně než1.5%z těchto dvou sloučenin. V této studii všechny surové a zpracované vzorky – kromě jedné šarže (180710) – tyto standardy splnily.
Navzdoryvariabilita šarže od šaržev rámci každého druhu (některé sloučeniny se lišily až 10krát, jako je tubulosid A a isoverbaskosid) byly mezi těmito dvěma druhy konzistentně pozorovány statisticky významné rozdíly v obsahu sloučenin. To potvrzujedruhový původ je hlavním faktoremovlivňující fytochemické složení.
navíccistanosid Abylzjištěno pouze vC. deserticolaa nepřítomný vC. tubulosa, takže to acenný marker pro autentizaci druhu, zejména ve farmakognostických podmínkách nebo nastaveních kontroly kvality.
🔬 Vliv zpracování vína na chemické složení
Po zpracování vína vykazovaly oba druhy konzistentní trend:
Snížené úrovněz:
Cistanosid F, echinakosid, cistanosid A, verbascosid, tubulosid A a 2'-acetylverbaskosid
Zvýšené úrovněz:
Tubulosid B a isoverbaskosid
Tyto trendy mohou vyplývat zchemická hydrolýza, degradacenebostrukturální přeskupeníběhem procesu napařování. Zajímavé je, ževelikost a směr změn se v jednotlivých šaržích lišily, pravděpodobně kvůli rozdílům v:
Počáteční koncentrace sloučeniny
Morfologie bylin (velikost, tloušťka)
Citlivost na podmínky zpracování
To zdůrazňuje důležitoststandardizace parametrů zpracovánía dirigováníhodnocení kvality specifické pro šaržepři bylinné přípravě.
