Fenylethanoidové glykosidy Cistanche Tubulosa indukují apoptózu v buňkách Eca-109 cestou mitochondrie-dependentní dráhy

Úvod

Rakovina jícnu je jedním z nejběžnějších typů rakoviny s 11. nejvyšší mírou nemocnosti a 6. nejvyšší úmrtností na celém světě a v roce 2015 způsobila ~439000 úmrtí. Incidence rakoviny jícnu se mezi různými regiony výrazně liší, s východní Asie a východní a jižní Afrika vykazují nejvyšší míru výskytu a západní Afrika vykazuje nejnižší míru v roce 2012. V Číně byly odhadované případy rakoviny jícnu a úmrtnost 477,000 a 375,000, v tomto pořadí , v roce 2015. Přestože se míra nemocnosti na rakovinu jícnu v letech 2005 až 2015 v zemích se středním a vysokým středním sociodemografickým indexem snížila, míra úmrtnosti zůstává vysoká kvůli špatné prognóze. Kombinace chirurgické resekce s chemoterapií nebo radioterapií se používá k léčbě rakoviny jícnu, nicméně bylo hlášeno, že mezi lety 2003 a 2014 zůstala 5-letá míra přežití<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyto prokázalFenylethanoidové glykosidy Cistanche tubulosa(CTPG) by mohl potlačit růst buněk melanomu B16-F10 in vitro a in vivo (24). Špatná rozpustnost dříve používaného CTPG ve vodě však omezuje vývoj léčiva. Proto byl použit ve vodě rozpustný CTPG (CTPG-W) a byl zkoumán protinádorový účinek na buňky rakoviny jícnu (Eca-109). Bylo zjištěno, že CTPG-W může v závislosti na dávce inhibovat životaschopnost buněk Eca-109 prostřednictvím indukce apoptózy prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiály a metody

Zvířata.

Samice myší C57BL/6 (6-8 týdnů, ~25 g) byly zakoupeny od Beijing Laboratory Animal Research Center (Peking, Čína) a umístěny v prostředí s řízenou teplotou (25 °C), světelným cyklem (12/ 12) Zařízení pro zvířata Univerzity Sin-ťiang (Urumqi, Čína). Všechna zvířata dostávala vodu a potravu bez patogenů.

Buněčná linie a kultura.

Buněčná linie lidského karcinomu jícnu (Eca{0}}) byla uchována v Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Čína) a kultivována v RPMI{{1} } médium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) doplněné 10 % tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Čína), 1 % L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu při 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 % CO2.

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC).

CTPG-W (kat. č. SGJG20170410) byl zakoupen od Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Hlavní sloučeniny CTPG byly kvalifikovány a kvantifikovány pomocí HPLC podle naší předchozí studie (24). Krátce, HPLC byla prováděna na koloně ZORBAX SB‑C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) při 30 °C a eluována 0,2% roztokem kyseliny mravenčí a gradientem methanolu začínajícím na 23 %, protože každou minutu byl přidáván 1 ml. po dobu 45 minut až do dosažení 31 %. Celkem bylo nastříknuto 10 ul vzorku a detekováno při 330 nm. Echinakosidový standard byl zakoupen od Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína) a akteosidový standard byl zakoupen od Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Německo). Standardy byly použity k analýze složek CTPG-W.

MTT test.

Buněčná proliferace byla měřena pomocí MTT testu. Buňky Eca{{0}} byly naočkovány do 96-jamkových destiček v hustotě 5x103 buňky v 100 µl RPMI{{5 }} médium/jamka a kultivováno při 37 °C po dobu 24 hodin, poté ošetřeno různými koncentracemi (0, 200, 400, 600 a 800 µg/ml) CTPG-W nebo 0,4% dimethylsulfoxidem (DMSO) po dobu 24, 48 a 72 hodin. DMSO byl použit jako kontrola rozpouštědla (800 ug/ml CTPG-W obsahující 0,4 % DMSO). Jako pozitivní kontrola byla použita cisplatina (20 ug/ml). Následně byl supernatant odstraněn po centrifugaci při 225 xg po dobu 5 minut při teplotě místnosti a do každé jamky bylo přidáno 100 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml v RPMI-1640 médiu bez FBS) a inkubováno při 37 °C po dobu 3 h. Vytvořené krystaly formazanu byly rozpuštěny ve 200 ul DMSO. Hodnoty optické hustoty (OD) byly měřeny při vlnové délce 490 nm 96-jamkovou čtečkou mikrodestiček (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Relativní životaschopnost buněk byla vypočtena podle vzorce: Životaschopnost buněk (%)=(ODléčené/ODneléčené)x100%. Morfologie buněk Eca‑109 byla pozorována pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu (zvětšení x 200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokio, Japonsko).

Pro proliferaci splenocytů byly myši C57BL/6 usmrceny cervikální dislokací a byly izolovány sleziny. Byla vyrobena jednobuněčná suspenze a splenocyty byly vysety do 96-jamkových destiček v hustotě 1x105 buněk/jamka ve 100 ul RPMI-1640 média a poté ošetřeny různými koncentracemi (0, 200, 400, 600 a 800 ug/ml) CTPG-W po dobu 24, 48 a 72 hodin při 37 °C s 5 % CO2. Proliferace splenocytů byla měřena MTT testem podle výše uvedeného protokolu. Stimulační index{20}}ODléčený/ODneléčený.

Měření apoptózy a buněčného cyklu. Buňky Eca{{0}} byly kultivovány na miskách o průměru 60 mm při hustotě 2,5x105 buněk/misku po dobu 24 hodin a ošetřeny různými koncentracemi ({{31} }, 200, 400, 600 a 800 ug/ml) CTPG-W nebo 0,4% DMSO po dobu 24 hodin při 37 °C s 5% CO2. Buňky byly shromážděny a obarveny soupravou pro detekci apoptózy Annexin V-fluorescein isothiokyanate (FITC)/propidium jodid (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Čína), podle protokolů výrobce. Vzorky byly odebrány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) a analyzovány pomocí FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). K analýze účinku CTPG-W na buněčný cyklus bylo 2,5x105 Eca{24}} buněk naočkováno do 60 mm kultivačních misek a ošetřeno CTPG-W (0, 100, 200 a 400 µg/ml) nebo 0,4 % DMSO po dobu 24 hodin při 37 °C s 5 % C02. Všechny buňky byly sklizeny a dvakrát promyty ledově chladným PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), poté fixovány v 70% ledově chladném ethanolu při 4 °C po dobu 30 minut. Po dvojnásobném promytí ledově chladným PBS byly buňky resuspendovány ve 300 ul PI/RNázového barvícího pufru (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Distribuce buněčného cyklu byla analyzována pomocí softwaru ModFit LT 3.0 průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur).

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSAProti únavěChránit játra PHGS 75 % ECH 30 % ACT 12 %

Analýza mitochondriálního membránového potenciálu (Δψm) a reaktivních forem kyslíku (ROS).Pro analýzu Δψm byly buňky Eca{{0}} ošetřeny CTPG-W (0, 400, 600 a 800 µg/ml) nebo 0,4% DMSO pro 24 h při 37 °C s 5 % CO2 a obarveno soupravou pro stanovení mitochondriálního membránového potenciálu s JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Čína), podle protokolu výrobce, po dobu 20 minut při 37 ° C. Po dvojnásobném promytí promývacím pufrem JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology) byly vzorky resuspendovány s 300 ul promývacího pufru JC‑1 a analyzovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur). Fluorescence barviva JC‑1 v buňkách Eca‑109 byla také pozorována pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu (zvětšení x 200; Nikon Eclipse Ti‑E). Pro analýzu ROS byly buňky Eca{21}} ošetřeny CTPG-W (0, 400, 600 a 800 ug/ml) po dobu 2, 4, 6, 12 a 24 hodin a obarveny testem Reactive Oxygen Species Assay kitu (Beyotime Institute of Biotechnology), podle protokolu výrobce, po dobu 20 minut při 37˚C. Po trojím promytí ledově studeným PBS byly vzorky odebrány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur) a analyzovány softwarem FlowJo 7.6.

Obrázek 1. Kvalifikovaná kontrola CTPG-W. Složky CTPG-W byly kvalitativně a kvantitativně analyzovány vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a porovnány se standardy echinakosidu a akteosidu. CTPG-W, ve vodě rozpustné fenylethanoidové glykosidy zC. tubulosa.

Aktivita vychytávání radikálů 2,2‑difenyl‑1‑pikrylhydrazyl (DPPH). Aktivita CTPG-W zachycující volné radikály byla stanovena pomocí testu volných radikálů DPPH podle publikovaného protokolu s menší modifikací, protože methanol byl nahrazen ethanolem, aby se rozpustil DPPH (25,26). Pro měření v ustáleném stavu bylo 150 µl DPPH (100 mmol/l) v ethanolu smícháno s různými koncentracemi CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 a 600 ug/ml) v 50 ul PBS a inkubovány ve tmě po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Absorbance při 517 nm byla detekována v přítomnosti a nepřítomnosti CTPG-W. Jako pozitivní kontrola bylo použito celkem 50 ul vitaminu C. Aktivita vychytávání radikálů DPPH byla vypočtena pomocí vzorce: Scavenging (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, kde Ablank je absorbance kontroly (bez DPPH), Vzorek je absorbance vzorku a A0 je absorbance PBS s DPPH.

Western blot analýza. Buňky Eca{{0}} byly ošetřeny CTPG-W (0, 200, 600 ug/ml) nebo 0,4% DMSO po dobu 24 hodin při 37 °C s 5% CO2. Následující promytí dvakrát PBS, buňky 

Obrázek 2. Účinek CTPG-W na růst Eca-109 buněk a splenocytů. (A) Buňky Eca-109 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG-W po dobu 24, 48 a 72 hodin a poté byla pomocí testu MTT detekována životaschopnost buněk. (B) Morfologické změny buněk Eca-109 po ošetření CTPG-W za 24 hodin. (C) Splenocyty myší C57BL/6 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG-W po dobu 24, 48 a 72 hodin a poté byla proliferace analyzována pomocí MTT testu.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

byly lyžovány v radioimunoprecipitačním lyzačním pufru (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Čína) po dobu 20 minut na ledu. Po centrifugaci při 10,000 xg po dobu 10 minut při 4 °C byly supernatanty shromážděny a koncentrace proteinu byly detekovány pomocí soupravy kyseliny bicinchoninové (Thermo Fisher Scientific, Inc.) podle protokolů výrobce. Analýza Western blot byla provedena podle našeho předchozího popisu (24). Protilátky proti kaspáze-7 (kat. č. D120077), kaspáze-8 (kat. č. D155240), kaspáze-9 (kat. č. D220078), B-buněčný lymfom{ {13}} (Bcl-2) související s X (Bax) (kat. č. D220073) a Bcl-2 (kat. č. D260117) a anti-myší IgG-křenová peroxidáza (HRP ) (kat. č. D111050) a anti-králičí IgG-HRP (kat. č. D110058) byly zakoupeny od BBI Life Sciences (Shanghai, Čína). Protilátky proti kaspáze-3 (kat. č. E-AB-10050) a aktivní kaspáze-3 (kat. č. E-AB-22115) byly zakoupeny od společnosti Elabscience ( Wuhan, Čína). Další protilátky proti kaspáze -7 (kat. č. 9492), poly (ADP-ribóza) polymeráze (PARP) (kat. č. 9542), cytochromu c (kat. č. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminální kináza (JNK) (kat. č. 9252S) a -aktin (kat. č. 58169) byly získány od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Všechny primární a sekundární protilátky byly naředěny v poměru 1:1,000. Primární protilátky byly inkubovány při 4 °C přes noc a sekundární protilátky byly inkubovány při 37 °C po dobu 1 hodiny.

Obrázek 3. Apoptóza Eca-109 buněk indukovaná CTPG-W. Buňky byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG-W po dobu 24 hodin. (A) Apoptotické a nekrotické buňky Eca‑109 byly analyzovány průtokovou cytometrií. Horní panel zobrazuje jednotlivé bodové grafy a spodní panel zobrazuje souhrnná data. *P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Cílové proteiny byly detekovány pomocí vylepšené chemiluminiscenční testovací soupravy (Beyotime Institute of Biotechnology), podle protokolu výrobce.

Statistická analýza. Statistická významnost byla vypočtena jednosměrnou analýzou rozptylu s Tukeyho post hoc testem a výsledky byly analyzovány pomocí softwaru GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) mezi léčebnými a kontrolními skupinami. Všechna data byla prezentována jako průměr ± standardní odchylka. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

EXTRAKT CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ FUNKCE LEDVIN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Výsledek

CTPG‑W potlačuje růst buněk Eca‑109.

Složky CTPG-W byly kvalifikovány a kvantifikovány pomocí HPLC (obr. 1), které byly porovnány se standardy echinakosidu a akteosidu. Podle retenčních časů píku a ploch píku obsahoval CTPG-W 39,16 % echinakosidu a 2,44 % akteosidu. Nejprve byl pomocí testu MTT stanoven účinek CTPG-W na životaschopnost buněk Eca{8}}. CTPG-W byl rozpuštěn v DMSO na 200 mg/ml a zředěn médiem RPMI-1640 obsahujícím 10% teplem inaktivovaný FBS na uvedené koncentrace. Buňky Eca-109 byly ošetřeny CTPG-W a životaschopnost buněk byla analyzována pomocí testu MTT v uvedených časových bodech. Léčba CTPG‑W významně snížila životaschopnost buněk Eca-109 způsobem závislým na dávce a čase (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Obrázek 4. Účinek CTPG-W na distribuci buněčného cyklu v buňkách Eca{2}}. Různé koncentrace CTPG-W byly použity k ošetření Eca-109 buněk po dobu 24 hodin a distribuce buněčného cyklu byla analyzována průtokovou cytometrií. *P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG‑W indukuje apoptózu v buňkách Eca‑109. Aby se zjistilo, zda CTPG-W potlačuje růst buněk Eca{2}} prostřednictvím indukce apoptózy nebo nekrózy, byly buňky ošetřeny různými koncentracemi CTPG-W. Po 24 hodinách byla apoptóza a nekróza buněk Eca{5}} detekována barvením Annexinem V/PI. Jak je znázorněno na obr. 3A, buňky Annexin V-/PI+ byly uzavřeny jako nekrotické buňky a buňky Annexin V+/PI+ a Annexin V+/PI- byly uzavřeny jako apoptotické buňky. CTPG-W primárně indukoval apoptózu buněk Eca{14}} v závislosti na dávce, ačkoli nekrotické buňky Eca{16}} také významně vzrostly při léčbě 600 a 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W indukuje zástavu buněčného cyklu ve fázi S v buňkách Eca‑109. Narušení cyklu rakovinných buněk potlačí buněčný růst a podpoří apoptózu (27). Distribuce buněčného cyklu v buňkách Eca-109 byla detekována pomocí barvení PI po ošetření CTPG-W po dobu 24 hodin. Bylo pozorováno, že buňky ve fázi S se zvýšily a buňky ve fázích G0/G1 naznačovaly celkově významný pokles po léčbě CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W snižuje Δψm a indukuje uvolňování cytochromu c. Apoptóza může být indukována mitochondriálně závislou cestou (28,29). Pro- a antiapoptotické členy rodiny BCL-2 proteinů hrají důležitou roli v regulaci integrity mitochondriální membrány (30,31). Po ošetření CTPG-W po dobu 24 hodin byl Δψm hodnocen pomocí barvení JC-1. Agregát JC‑1 (červená fluorescence detekovaná v FL‑2) se rozpadne na monomer (zelená fluorescence detekovaná v FL-1), když se Δψm snižuje (32). Jak je znázorněno na obr. 5A, frekvence buněk FL-1+FL-2-/+ se významně zvýšily způsobem závislým na dávce, což ukazuje, že Δψm buněk Eca-109 se snížil. Změny fluorescence v buňkách Eca‑109 byly také pozorovány pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu (obr. 5B). Se zvyšujícími se koncentracemi CTPG‑W se červená fluorescence snižovala a zelená fluorescence zvyšovala, což je v souladu s údaji z průtokové cytometrie. Bylo také pozorováno, že hladina cytochromu c v cytosolu byla výrazně zvýšena (obr. 5C), což je výsledkem snížení Δψm. To potvrzuje závěr vyvozený ze zvýšeného počtu FL-1+ FL-2-/+ buněk, že Δψm se snížil v důsledku léčby CTPG-W. Bylo hlášeno, že JNK může regulovat aktivaci rodiny proteinů BCL-2 způsobující uvolňování cytochromu c (33-35). Bylo také stanoveno, že hladina JNK byla po léčbě CTPG-W výrazně zvýšena (obr. 5C). Výsledky ukázaly, že CTPG-W může indukovat apoptózu buněk Eca-109 prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy.

Obrázek 5. Snížení Δψm a upregulace cytochromu c a JNK. Buňky Eca-109 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG-W po dobu 24 hodin. (A) Δψm byl detekován barvením JC‑1 a vzorky byly analyzovány průtokovou cytometrií. Jednotlivé bodové grafy zobrazují změny fluorescence JC‑1. Frekvence buněk FL-1+ FL-2-/+ jsou znázorněny na spodním panelu. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Obrázek 6. Hladiny ROS v buňkách Eca-109 po ošetření CTPG-W a antioxidační aktivita CTPG-W. (A) Buňky Eca{4}} byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG‑W a hladiny ROS byly analyzovány průtokovou cytometrií v uvedených časových bodech. *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Vliv CTPG‑W na intracelulární tvorbu ROS.ROS by mohla snížit Δψm k indukci apoptózy (36). Aby se zjistilo, zda CTPG-W může zvýšit produkci ROS, buňky Eca-109 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG-W. Buňky byly shromážděny v uvedených časových bodech a obarveny DCFH-DA. Produkce intracelulárních ROS v buňkách Eca{5}} byla stanovena průtokovou cytometrií. Jak je znázorněno na obr. 6A, 800 ug/ml CTPG-W významně zvýšilo produkci ROS od 2-6 h a snížilo od 12-24 h. Navíc 400 µg/ml CTPG‑W významně zvýšilo produkci ROS od 12-24 h. Kromě toho 200 ug/ml CTPG-W významně nezměnilo produkci ROS. Dynamické změny v produkci ROS mohou souviset s apoptózou buněk Eca{15}}. Bylo také stanoveno, že CTPG-W měl aktivitu vychytávání volných radikálů (obr. 6B), což může být spojeno se sníženou produkcí ROS v buňkách Eca-109 ošetřených 800 ug/ml CTPG-W po 12 hodinách.

Obrázek 7. Hladiny štěpených kaspáz a štěpených PARP po ošetření CTPG-W. Proteiny byly izolovány z buněk Eca{4}} ošetřených CTPG-W po dobu 24 hodin a hladiny štěpených kaspáz a štěpených PARP byly detekovány analýzou western blot. DMSO, dimethylsulfoxid; CTPG-W, ve vodě rozpustné fenylethanoidové glykosidy zC. tubulosa; PARP, poly (ADP-ribóza) polymeráza.

CTPG-W upreguluje aktivitu kaspázy-3, kaspázy-7, kaspázy-9 a PARP. Uvolnění cytochromu c v důsledku redukce Δψm by mohlo aktivovat kaspázové proteázy k indukci apoptózy (29,30,37). Po ošetření CTPG-W po dobu 24 hodin byla pomocí analýzy western blot detekována aktivace kaspázy-3, 7, 8, 9 a PARP. Ve srovnání s kontrolní skupinou byly úrovně štěpené kaspázy-9, štěpené kaspázy-7, štěpené kaspázy-3 a štěpené-PARP, ale nikoli úrovně štěpené kaspázy{{20 }}, byly upregulovány léčbou CTPG způsobem závislým na dávce (obr. 7). Tyto výsledky ukázaly, že CTPG-W redukoval Δψm a podporoval uvolňování cytochromu c k aktivaci kaspáz, které indukují apoptózu Eca-109 buněk.

Diskuse

Tradiční CHM by mohla indukovat apoptózu buněk rakoviny jícnu prostřednictvím různých drah, včetně vnějšího receptoru smrti a vnitřních drah mitochondriálního a endoplazmatického retikula (29). Naše předchozí studie prokázala, že CTPG, jako hlavní složka C. tubulosa, inhibuje růst melanomových B16-F10 buněk prostřednictvím indukce apoptózy prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy (24). V této studii byl zkoumán protinádorový účinek CTPG-W na Eca-109 buňky a bylo zjištěno, že CTPG-W potlačoval růst Eca{8}} buněk, indukoval apoptózu a zástavu buněčného cyklu, snížil Δψm, zvýšil uvolňování cytochromu c a aktivovaných kaspáz. CTPG a CTPG-W by mohly indukovat apoptózu a zastavení buněčného cyklu v rakovinných buňkách. Přesné mechanismy se však liší v důsledku různých složek CTPG (26,64 % echinakosidu, 10,19 % akteosidu a 1,71 % isoakteosidu) a CTPG-W (39,16 % echinakosidu a 2,44 % akteosidu). CTPG zastavil buňky B16-F10 ve fázích G0/G1, ale CTPG-W zastavil buňky Eca-109 ve fázi S (24). Produkce ROS byla CTPG zvýšena v závislosti na dávce, ale indikovala změnu v závislosti na čase vysokou dávkou CTPG-W, která se významně zvýšila na začátku léčby CTPG-W (2-6 h) a významně poklesly po 12 hodinách ve srovnání s kontrolou. Možným důvodem je, že hlavní složkou CTPG-W je echinakosid. Několik studií uvádí, že echinakosid by mohl inhibovat produkci ROS a apoptózu indukovanou ROS, aby uplatnil své neuroprotektivní účinky a účinky proti stárnutí (38-40). Podobně byla v této studii pozorována aktivita vychytávání volných radikálů. Proto se spekulovalo, že některé složky, včetně verbascosidu, iso-verbascosidu a salidrosidu ve vysoké dávce CTPG-W, by mohly okamžitě vyvolat tvorbu ROS, aby způsobila apoptózu Eca-109 buněk (41,42), a pak ROS byl uklizen echiNacoside (Zánět moře). Dalším možným důvodem rozdílů v produkci ROS pomocí CTPG a CTPG-W je to, že v této studii a v předchozí studii byly použity různé buněčné linie (24). Dong et al (43) uvedli, že echinakosid by mohl indukovat apoptózu lidských buněk kolorektálního karcinomu SW480 prostřednictvím generování oxidativního poškození DNA bez zvýšených hladin ROS.

Léčba CTPG-W snížila Δψm a způsobila uvolnění cytochromu c, který podporuje štěpení kaspázy-9 (28). V souladu s tím byly hladiny štěpené kaspázy-9 regulovány léčbou CTPG-W. Následně může aktivní kaspáza-9 aktivovat kaspázu-3 k indukci apoptózy (44). Hladiny štěpené kaspázy{10}} byly také zvýšeny léčbou CTPG-W. Kaspáza-8 však nebyla aktivována CTPG-W, což naznačuje, že vnější dráha receptoru smrti nebyla zapojena do apoptózy indukované CTPG-W. Tato pozorování naznačují, že CTPG-W indukuje apoptózu buněk Eca{16}} prostřednictvím aktivace mitochondriálně závislé dráhy.

PARP hraje důležitou roli v genomové stabilitě a může být štěpena aktivními kaspázami, zejména kaspázou-3 a -7 (45). Bylo zjištěno, že léčba CTPG-W aktivovala kaspázu-3 a -7, které mohou štěpit PARP za účelem inhibice opravy DNA a způsobit apoptózu.

CTPG-W také v závislosti na dávce a čase potlačuje růst buněk lidského hepatocelulárního karcinomu BEL-7404 (nepublikovaná data). Ačkoli CTPG-W inhibuje růst Eca-109 a BEL-7404 buněk, podporuje proliferaci splenocytů, což může být způsobeno obsahem polysacharidů (~50 %) v CTPG-W (46 ). Podobně několik studií uvádí, že polysacharidy mohou podporovat proliferaci splenocytů (46-49). Na myším modelu bylo zjištěno, že CTPG‑W významně zvýšil index sleziny ve srovnání s kontrolní skupinou, ale neovlivnil tělesnou hmotnost a další orgánové indexy včetně srdce, jater, ledvin a plic (nepublikovaná data), což ukazuje, že CTPG-W nemá žádný cytotoxický účinek na normální buňky.

Souhrnně údaje naznačovaly, že CTPG-W inhibuje růst buněk Eca{1}} indukcí apoptózy prostřednictvím mitochondriálně závislé dráhy

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%