Cistanche Tubulosa indukuje druhem reaktivní kyslíkem zprostředkovanou apoptózu primárních a metastatických lidských rakovinných buněk tlustého střeva

Afnan Saleh Al-Menhali, Safia Ali Jameela, Aishah A. Latiff, Mohamed A. Elrayess, Mohammed Alsayrafi, Morana Jaganjac

Antidopingová laboratoř Katar, Toxikologie a víceúčelová, Dauhá, Katar.

Antidopingová laboratoř Katar, Life Science Research, Dauhá, Katar.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

ABSTRAKTNÍ

Rakovina tlustého střeva je celosvětově třetí nejčastější rakovinou. Konvenční terapie prokázaly střední účinnost se závažnými nežádoucími účinky, a proto existuje naléhavá potřeba bezpečnějších alternativ. V této studii,Cistanchetubulosa, místní název Thanoon, byl považován za potenciální fytoterapeutickou strategii kvůli svému známému vysokému terapeutickému potenciálu v tradiční medicíně a širokému výskytu v regionu Středního východu. Bioaktivní sloučeniny byly extrahovány z práškuCistanchetubulosaa testovány na jejich protirakovinné vlastnosti proti čtyřem tlustým střevůmrakovinabuněčné linie zahrnující dvě odvozené z primárního nádoru (CaCo2 a HCT116) a dvě odvozené z metastatického místa (LoVo a SW620). ÚčinekCistanchetubulosana indukci apoptózy a buněčné redox homeostázy byla také zkoumána.Cistanchetubulosavykazovaly koncentračně a časově závislou inhibici proliferace všech testovaných rakovinných buněčných linií o více než 60 procent po 72 hodinách ošetření 1 mg/ml surového extraktu. Inhibice proliferace byla poznamenána indukcí apoptózy, intracelulární produkcí reaktivních forem kyslíku a mitochondriálními superoxidy. Tato data naznačují, že Cistanche tubulosa je slibným kandidátem na aditivní léčbu rakoviny tlustého střeva. Toto je první studie prokazující protirakovinnou biologickou aktivitu Cistanche tubulosa proti buňkám rakoviny tlustého střeva.

Účinná látka zCistanchemáprotirakovinnéúčinek

zkratky:

7-AAD, 7-Amino-Aktinomycin D;

CTE,Cistancheextrakt z tubulosy;

EMEM, Eagle's Minimum Essential Medium;

FBS, fetální hovězí sérum; DCF, 2,7-dichlorfluorescein;

DCFH-DA, 2,7-dichlordihydrofluorescein diacetát;

DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium;

DMSO, dimethylsulfoxid; MTT, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium;

PE, fykoerythrin; RFU, jednotky relativní fluorescence;

ROS, reaktivní formy kyslíku

ÚVOD

Kolorektální karcinom je celosvětově jedním z nejčastějších nádorových onemocnění (Brenner et al., 2014) a jeho výskyt se neustále zvyšuje s odhadem 2,4 milionu případů v roce 2035, a to díky moderní stravě a životnímu stylu spolu se sníženou fyzickou aktivitou. Současné úsilí není dostatečné pro boj se současnou epidemií kolorektálního karcinomu, a proto jsou zapotřebí nové přístupy pro účinnou prevenci a léčbu včetně změn životního stylu v kombinaci s bezpečnějšími alternativními intervencemi, jako jsou fytoterapeutika (Weidner et al., 2015). Fytoterapie, využívání léčivých rostlin k léčbě nemocí, byla nevyhnutelnou součástí dávné historie lidstva. Léčivé rostliny jsou již dlouho využívány jako alternativní zdroje léčby rakoviny a představují více než šedesát procent protirakovinných látek používaných v konvenční medicíně (Balunas a Kinghorn, 2005; Saibu et al., 2015). Některé z nejznámějších příkladů zahrnují extrakty z Catharanthus roseus G. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) a Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg a Newman, 2005; da Rocha et al., 2001). Bylo prokázáno, že několik bylinných extraktů a fytochemikálií má protinádorové účinky u kolorektálního karcinomu připisovaného indukci produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) a související apoptóze rakovinných buněk, jako je tomu u extraktů z Melissa officinalis (Weidner et al., 2015).

Cistanchedeserticola má inhibiční účinekbuňkaapoptóza

Mezi kandidáty na fytoterapeutikuCistanchetubulosa, pouštní parazitická rostlina z čeledi Orobanchaceae (Jiang et al., 2009), která je široce rozšířena v suchých a polosuchých oblastech Afriky, Asie a Středomoří, má cenné léčivé vlastnosti.Cistanchetubulosa je široce používána v tradiční medicíně a předpokládá se, že má léčebné účinky při nedostatku ledvin, chorobné leukoree, metroragii, ženské neplodnosti a senilní zácpě (Jiang et al., 2009). Cistanche Tubulosa byly v posledním desetiletí intenzivně studovány, včetně vazorelaxačních (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotektivních (Morikawa et al, 2010), antihyperglykemických a hypolipidemických účinků (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosawas je také navrhován jako silný posilovač imunitního systému, promotor tvorby kostí a prostředek proti stárnutí a únavě (Xu et al., 2014). Dále bylo prokázáno, že extrakt z Cistanche tubulosa blokuje ukládání amyloidu v modelu Alzheimerovy choroby (Wu et al., 2015). Navzdory různým terapeutickým účelům nebyl účinek Cistanche Tubulosa jako potenciálního protirakovinného činidla dosud studován.

V této práci jsme zkoumali protirakovinný účinekCistancheTubulosa na dvou primárních a dvou metastatických buněčných liniích rakoviny tlustého střeva a potenciální mechanismy, které jsou základem tohoto účinku.

MATERIÁLY A METODY

Sběr a příprava rostlinného extraktu

Vzorky zCistanchetubulosa byly odebrány z pouštních oblastí v Kataru během roku 2014 a pravost rostliny byla potvrzena herpetologem. Vzorky voucherů jsou archivovány na Toxikologickém a víceúčelovém oddělení v ADLQ. Vzorky rostlin vysušené na slunci byly rozemlety pomocí Retsch Knife Mill Grindomix GM300 na jemný prášek. Dvacet gramů prášku bylo extrahováno 200 ml ultračisté vody přes noc při 37 stupních na rotační třepačce při 200 pm. HrubýCistancheExtrakty tubulosa (CTE) byly centrifugovány po dobu 30 min při 8000 ot./min., aby se peletovaly nerozpustné sloučeniny, supernatant se shromáždil a lyofilizoval pomocí Labconco Freezone 6 plus Freeze dryer. Vysušený extrakt byl rekonstituován v Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, Německo) na koncentraci 20 mg/ml a sterilně zfiltrován přes 0,{7}}mikronový membránový filtr.

Buněčné linie a buněčná údržba

Buněčné linie lidského karcinomu tlustého střeva CaCo2, SW620 a LoVo byly získány od Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Německo), zatímco buněčná linie HCT 116 byla laskavým darem od oddělení biologických a environmentálních věd na Katarské univerzitě. CaCo2 a HCT11 byly odvozeny z primárního místa karcinomu tlustého střeva, zatímco SW620 a LoVo byly odvozeny z metastatického místa. Buňky SW620, HCT116 a LoVo byly kultivovány a udržovány v médiu DME, zatímco buňky CaCo2 byly udržovány v Eagleově minimálním základním médiu (EMEM, SIGMA, Německo). Buňky byly pěstovány jako monovrstva kultivovaná při 37 stupních v příslušném médiu doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS, SIGMA, Německo) a 1 procentem penicilin/streptomycin (SIGMA, Německo) ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent oxidu uhličitého.

Test životaschopnosti buněk

K hodnocení cytotoxické aktivity CTE podobně, jak bylo popsáno dříve (Jaganjac et al., 2010). Hustota naočkování buněk CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo kultivovaných v 96-jamkových destičkách byla 104 buněk na jamku. Buňky byly umístěny do příslušného média doplněného 10 procenty FBS 24 hodin před ošetřením. Po 24 hodinách bylo médium odstraněno a buňky byly ošetřeny 0, 0,25, 0,5, 1 a 2 mg/ml CTE po dobu 24, 48 a 72 hodin při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent C02. Po ošetření CTE bylo médium odstraněno a do každé jamky bylo přidáno 40 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml).

Po 3 hodinách inkubace byl MTT roztok odstraněn, formazanový produkt rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO, SIGMA, Německo) a absorbance byla měřena při 590 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Švýcarsko).

Test apoptózy

Apoptóza v buňkách CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo byla detekována pomocí PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I s 7-amino-aktinomycinem D (7-AAD) jako životně důležitým barvivem (Becton Dickinson International, Belgie) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, buňky byly nasazeny na 24-jamkové destičky v hustotě 5×104 buňky/jamku v příslušném médiu doplněném 10% FBS po dobu 24 hodin před přidáním CTE (0, 0,5, nebo 1 mg/ml). Po inkubaci 24 CTE byly buňky sklizeny, dvakrát promyty studeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a barveny fykoerythrinem (PE) Annexinem V a 7-AAD po dobu 15 minut při teplotě místnosti ve tmě. Obarvené buňky byly analyzovány během 1 hodiny průtokovou cytometrií za použití FACS. Průtokový cytometr Aria III a software FACSDiva (Becton Dickinson) při nízkém průtoku s minimem 104 buněk. Ošetření buněk po dobu 4 hodin 6 uM kamptotecinem (SIGMA) bylo použito jako pozitivní kontrola pro test.

Intracelulární produkce ROS

Intracelulární produkce ROS byla zkoumána pomocí 2,7-dichlordihydrofluorescein diacetátu (DCFH-DA, SIGMA, Německo). DCFH-DA je nefluorescenční sonda, která se oxiduje intracelulárním ROS na fluorescenční sloučeninu 2,7-dichlorfluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). Test DCFH DA byl proveden podobně, jak jsme popsali dříve (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Stručně, hustota naočkování buněk CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo kultivovaných v 96-černých destičkách s jamkami byla 104 buněk na jamku. Buňky byly umístěny na 24 hodin do příslušného média doplněného 10 procenty FBS. Před ošetřením byly buňky inkubovány s 10 uM DCFH-DA při 37 stupních po dobu 30 minut v 5 procentech CO2/95 procentech vzduchu. Buňky byly poté promyty a ošetřeny 0, 0,5 a 1 mg/ml CTE v médiu bez fenolové červeně. Intracelulární tvorba ROS byla monitorována nepřetržitě po dobu 25 hodin při 37 stupních a 5 procentech CO2 za použití čtečky mikrodestiček s horním modulem pro kontrolu fluorescence a plynu (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švýcarsko). Intenzita fluorescence byla měřena s excitační vlnovou délkou 500 nm a detekcí emise při 529 nm. Libovolné jednotky, relativní fluorescenční jednotky (RFU), byly založeny přímo na intenzitě fluorescence.

Generování mitochondriálního superoxidu

Schopnost CTE indukovat tvorbu superoxidu mitochondriemi byla odhadnuta pomocí sondy MitoSOX Red (Life Technologies) a Hoechst 33342 pro nukleární barvení (Life Technologies) propustné pro mitochondrie. Buňky CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 104 buněk na jamku v příslušném médiu doplněném 10 procenty FBS po dobu 24 hodin. Buňky byly poté naplněny 4 uM MitoSOX a 2 uM Hoechst 33342 po dobu 20 minut, přebytek barviva byl promyt a jamky ošetřeny 0, 0,5 a 1 mg/ml CTE po dobu 24 hodin při 37 stupních a 5 procentech CO2. Intenzita fluorescence byla měřena s excitační vlnovou délkou 510 nm a emisní detekcí při 580 nm pro MitoSOX a excitační vlnovou délkou 350 nm a emisní detekcí při 461 nm pro Hoechst 33342 pomocí čtečky mikrodestiček se špičkovou fluorescencí (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švýcarsko).

Statistická analýza

Popisné statistiky byly uvedeny jako průměr plus /- SD. Významnost rozdílů mezi skupinami byla hodnocena pomocí Studentova t-testu a Chi-kvadrát testu. Když byly porovnány více než dvě skupiny, použili jsme jednostrannou ANOVA s příslušným post hoc testováním. Byl použit SPSS 11.{5}}1 pro Mircosoft Windows. Rozdíly s P menším než 0,05 byly považovány za statisticky významné.

Cistanchemáprotirakovinnévlastnosti a zlepšujeimunita

VÝSLEDEK

Účinek CTE na proliferaci lidských buněčných linií rakoviny tlustého střeva je znázorněn na obrázku 1. Všechny testované koncentrace CTE vykazovaly silný inhibiční účinek na buněčnou linii CaCo2 v závislosti na koncentraci a čase (obrázek 1A). 72 hodin léčby CTE inhibovalo růst buněk CaCo2 o více než 60 procent ve srovnání s kontrolou (p < 0.05="" pro="" všechny="" koncentrace).="" významný="" dopad="" léčby="" cte="" na="" buněčný="" růst="" hct116="" byl="" také="" detekován="" ve="" všech="" časových="" bodech="" u="" dvou="" nejvyšších="" koncentrací="" (1="" mg/ml="" a="" 2="" mg/ml),="" přičemž="" u="" posledně="" jmenovaných="" bylo="" dosaženo="" snížení="" o="" více="" než="" 70="" procent="" koncentrace="" (obrázek="" 1b,="" p="">< 0,05).="" přestože="" dvě="" nižší="" koncentrace="" cte="" (0,25="" a="" 0,5="" mg/ml)="" významně="" snížily="" růst="" buněk="" hct116="" po="" 24="" hodinách=""><0.05), they="" had="" no="" significant="" effect="" following="" 72="" hours="" treatment="" compared="" to="" control="" (p="">{{0}}.{{10}}5). Inhibice proliferace pomocí CTE závislá na čase a koncentraci byla dále potvrzena u buněk LoVo o více než 60 procent při nejvyšší koncentraci (p < 0.05)="" (obrázek="" 1c)="" a="" všechny="" čtyři="" testované="" koncentrace="" cte="" snížily="" růst="" buněk="" sw620="" po="" 48="" hodinách="" (obrázek="" 1d,="" p="">< 0,05="" pro="" všechny).="" po="" 72="" hodinách="" léčby="" byl="" stejný="" účinek="" pozorován="" pouze="" u="" dvou="" nejvyšších="" koncentrací="" (p="">< 0,05),="" zatímco="" koncentrace="" 0,25="" a="" 0,5="" mg/ml="" nevykazovaly="" žádný="" významný="" účinek="" ve="" srovnání="" s="" kontrolou="" (p=""> 0,05). Dopad léčby 0,5 a 1 mg/ml CTE na indukci apoptózy byl dále testován u všech čtyř buněčných linií (obrázek 2). Zvýšený počet buněk v časné apoptóze byl detekován v HCT116 a LoVo po 24hodinové léčbě 0,5 mg/ml (p<0.05, figure="" 2b="" and="" 2c)="" and="" in="" all="" cell="" lines="" at="" 1="" mg/ml=""><0.05). a="" significant="" increase="" in="" necrotic="" or="" late="" apoptotic="" cell="" number="" was="" further="" observed="" in="" caco2="" and="" sw620="" cell="" lines=""><0.05, figure="" 2a="" and="" 2d).="" the="" ability="" of="" cte="" to="" induce="" intracellular="" ros="" production="" is="" demonstrated="" in="" figure="" 3.="" three="" hours="" following="" cte="" treatment="" there="" was="" a="" strong="" increase="" in="" intracellular="" ros="" production="" in="" all="" cell="" lines=""><0.05). the="" intracellular="" ros="" production="" increased="" progressively="" throughout="" the="" 25="" hours="" of="" treatment="" in="" a="" time="" and="" concentration-dependent="" manner.="" furthermore,="" staining="" of="" cells="" with="" mitochondria-targeted="" probe="" revealed="" a="" strong="" impact="" of="" cte="" on="" mitochondrial="" superoxide="" production="" in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 4).="" the="" highest="" increase="" in="" superoxide="" production="" by="" mitochondria="" was="" observed="" in="" hct116="" (69%,="" figure="" 4b)="" and="" lovo="" cells="" (82%,="" figure="" 4c)="" following="" 24="" hours="" of="" treatment="" with="" 1="" mg/ml="" of="">

DISKUSE

Přestože dřívější studie uváděly četné léčivé vlastnostiCistanchetubulosa, toto je první zpráva o jeho antiproliferativním účinku na maligní buňky. Bioaktivní sloučeniny Cistanchetubulosa extrahované vodou, vysoce polárním rozpouštědlem, vykazovaly silnou protirakovinnou bioaktivitu. Již dříve jsme porovnávali účinnostCistanchetubulosa se solubilizovala ve vodě proti jiným rozpouštědlům, jako je methanol a ethylacetát, ale vodné extrakty vykazovaly nejslibnější protirakovinné aktivity (data nejsou uvedena).

Prokázali jsme schopnost CTE při 1 mg/ml a 2 mg/ml inhibovat 60 procent růstu buněčných linií primárního i metastatického karcinomu tlustého střeva, což odhaluje potenciálně důležitou roli Cistanche tubulosa jako léčby rakoviny tlustého střeva. Ve srovnání s normálními buňkami jsou rakovinné buňky obecně charakterizovány poruchou redoxní homeostázy a běžnou strategií současných protirakovinných terapií je zvýšení buněčného oxidačního stresu (Yang et al, 2013). Ačkoli fyziologicky nízké hladiny ROS hrají důležitou roli jako signální molekuly, nadměrná produkce ROS může přispět k nestabilitě a malignitě rakoviny (Liou a Storz, 2010). Paradoxně tato nerovnováha v buněčné redoxní homeostáze činí rakovinné buňky zranitelnějšími vůči buněčné smrti vyvolané ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira a Hay, 2013). Antiproliferativní účinek CTE uváděný v této studii může být zprostředkován různými extra- a intracelulárními mechanismy známých a neznámých sloučenin v extraktu, které se zaměřují na více cest, které hrají zásadní roli v apoptóze. Abychom odlišili různé způsoby buněčné smrti, zkoumali jsme potenciální mechanismus zodpovědný za pozorovanou cytotoxicitu indukovanou CTE.

Naše data ukazují, že CTE zvyšuje intracelulární produkci ROS a následně ROS-indukovanou buněčnou smrt. Redoxní stav buňky také hraje klíčovou roli v regulaci apoptózy a mitochondriální elektronový transportní řetězec je jedním z hlavních míst tvorby buněčného ROS (Trachootham et al., 2008). Kromě toho by intracelulární ROS mohl způsobit buněčnou apoptózu jak prostřednictvím mitochondrií závislých, tak nezávislých drah (Sinha et al., 2013). Naše data skutečně také naznačují, že externalizace fosfatidylserinu indukovaná CTE, běžný účinek při apoptóze, v buněčných liniích primárního i metastatického karcinomu, což naznačuje, že mechanismus smrti indukované CTE je zprostředkován spíše apoptózou než nekrózou. Aktivace apoptózy v rakovinných buňkách je korektivní strategií a mnoho protirakovinných léků může vykazovat apoptotické účinky v rakovinných buňkách.

Sloučeniny nebo extrakty s proapoptickými aktivitami v rakovinných buňkách jsou proto potenciálně užitečné při výzkumu protirakovinných léčiv (Wong, 2011). Abychom určili, zda proapoptotický účinek indukovaný CTE je zprostředkován mechanismem ROS indukovaným mitochondriemi, měřili jsme produkci superoxidu pomocí fluorescenční sondy cílené na mitochondrie v buňkách ošetřených CTE. Naše data jasně ukazují, že CTE stimuluje produkci mitochondriálního superoxidu, což naznačuje, že protirakovinná aktivita Cistanche tubulosa je alespoň částečně zprostředkována mechanismem ROS indukovaným mitochondriemi.

Cistanchemáprotirakovinnéajátraochranaefekty

ZÁVĚRY

Závěrem lze říci, že naše data naznačují, že vodní extrakt z pouštní rostliny Cistanche tubulosa může představovat slibného kandidáta na protirakovinný přístup v kombinaci s jinými konvenčními terapiemi pro prevenci a léčbu rakoviny tlustého střeva. Ukazujeme také, že toxicita rostlinného extraktu proti rakovinným buňkám je zprostředkována zvýšenou intracelulární produkcí ROS a alespoň částečně apoptózou závislou na mitochondriích. Probíhají další studie s cílem izolovat a charakterizovat jednotlivé biologicky aktivní složky odpovědné za protirakovinnou aktivitu.

K vyhodnocení potenciálního použití tohoto extraktu jako účinného chemopreventivního činidla a k pochopení mechanismů působení na buňky rakoviny tlustého střeva na molekulární úrovni je zapotřebí další výzkum. K potvrzení pozorovaných příznivých zdravotních účinků Cistanche tubulosa pro prevenci rakoviny jsou také zapotřebí další preklinické a klinické studie.

PODĚKOVÁNÍ

Finanční podpora a sponzorství

Tato studie byla podpořena Antidopingovou laboratoří Katar.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

REFERENCE

Balunas MJ, Kinghorn, AD. Objev léčiv z léčivých rostlin. Life Sci. 2005;78:431-41.

Brenner H, Kloor M, Pox CP. Kolorektální rakovina. Lancet 2014;383,1490-502.

Cindric M, Cipak A, Zapletal E, Jaganjac M, Milkovic L, Waeg G, Stolc S, Zarkovic N, Suzana Borovic S. Stobadine zmírňuje poškození modelu střevní bariéry způsobené 4-hydroxynonenalem. Toxikol In Vitro. 2013; 27:426-32.

Cragg GM, Newman DJ. Rostliny jako zdroj protirakovinných látek.J Ethnopharmacol. 2005;100:72-9.da

Rocha AB, Lopes RM, Schwartsmann G. Přírodní produkty v protinádorové terapii. CurrOpinPharmacol. 2001;1:364-9.

Jaganjac M, Matijevic T, Cindric M, Cipak A, Mrakovcic L, Gubisch W, Zarkovic N. Indukce promotoru CMV-1 pomocí 4-hydroxy-2-nominálu v lidských embryonálních ledvinových buňkách. Acta Biochim Pol. 2010;57:179-83.

Jaganjac M, Poljak-Blazi M, Zarkovic K, Schaur RJ, Zarkovic N. Zapojení granulocytů do spontánní regrese Walker 256 karcinomu. Cancer Lett. 2008;260:180-6.

Jiang Y, Tu PF. Analýza chemických složek u druhů Cistanche. J Chromatogr A. 2009;1216:1970-9.Liou GY, Storz P. Reactive oxygen species in cancer. Free Radic Res. 2010;44:479-96.

Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, Yoshikawa M, Yuan D, Muraoka O. Acylované fenylethanoidové oligoglykosidy s hepatoprotektivní aktivitou z pouštní rostliny Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem. 2010;18:1882-90.

Nogueira V, Hay N. Molekulární cesty: homeostáza reaktivních forem kyslíku v rakovinných buňkách a důsledky pro terapii rakoviny. Clin Cancer Res. 2013;19:4309-14.

Poljak-Blazi M, Jaganjac M, Sabol I, Mihaljevic B, Matovina M, Grace M. Vliv železitých iontů na tvorbu reaktivních forem kyslíku, růst buněčných linií rakoviny děložního čípku a expresi onkogenu E6/E7. Toxikol In Vitro. 2011; 25:160-6.

Saibu GM, Katerere DR, Rees DJG, Meyer M. In vitro cytotoxické a proapoptotické účinky vodních extraktů listů a cibulí Tulbaghia violacea. J Ethnopharmacol. 2015;164:203-9.

Sinha K, Das J, Pal PB, Sil PC. Oxidační stres: na mitochondriích závislé a na mitochondriích nezávislé dráhy apoptózy. Arch Toxicol.2013; 87:1157-80.

Trachootham D, Lu W, Ogasawara MA, Nilsa RD, Huang P. Redoxní regulace přežití buněk. Antioxidační redoxní signál. 2008;10:1343-74.

Weidner C, Rousseau M, Plauth A, Wowro SJ, Fischer C, Abdel-Aziz H, Sauer S. Extrakt z Melissa officinalis indukuje apoptózu a inhibuje proliferaci buněk rakoviny tlustého střeva prostřednictvím tvorby reaktivních forem kyslíku. Fytomedicína. 2015; 22:262-70.

Wong RS. Apoptóza u rakoviny: od patogeneze k léčbě. J Exp Clin Cancer Res. 2011;30:87.

Wu SH, Chou FP, Chyau CC, Chen JH, Tu SF, Lin HH. Protirakovinné účinky extraktu Wasabia japonica v buňkách rakoviny jater Hep3B prostřednictvím akumulace ROS, poškození DNA a apoptózy zprostředkované p73-. J Funct Foods. 2015;14:{11}}.

Xiong WT, Gu L, Wang C, Sun HX, Liu X. Antihyperglykemické a hypolipidemické účinky Cistanche tubulosa u diabetických DB/DB myší typu 2. J Ethnopharmacol. 2013;150:935-45

Xu R, Sun S, Zhu W, Xu C, Liu Y, Shen L, Shi Y, Chen J. Vícestupňové vlastnosti infračerveného makro otisku ethanolových extraktů z různých druhů Cistanche v Číně v kombinaci s HPLC otiskem prstu. J Mol Struct. 2014;1069:236-244.

Yang Y, Karakhanova S, Werner J, Bazhin AV. Reaktivní formy kyslíku v biologii rakoviny a protinádorové terapii. Curr Med Chem. 2013; 20:3677-92.

Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, Muraoka O. Fenylethanoidní oligoglykosidy a acylované oligocukry s vazorelaxační aktivitou z Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem. 2006;14:7468-75.