Klonování genů, funkční identifikace, strukturní a expresní analýza syntázy sacharózy z Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Expresní analýza CtSus v různých částech Cistanche tubulosa a v systému buněčných kultur při stresu ze sucha

4.1 Analýza exprese CtSus v různých částech Cistanche tubulosa

Experimenty s celobuněčnou transformací in vitro a experimenty s enzymatickou katalytickou reakcí potvrdily, že protein kódovaný genem CtSus má schopnost katalyzovat syntézu UDP-glukózy. Aby bylo možné dále prozkoumat korelaci mezi tímto genem a biosyntézou glykosidových sloučenin v Cistanche tubulosa, úroveň exprese tohoto genu v různých částechCistanche tubulosabyl analyzován.

PRODÁM VYSOCE KVALITNÍ CISTANČOVÉ SUROVINY

Podpůrná služba Wecistanche - Kontaktujte nás a získejte informace o slevě:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Echinakosidje nejreprezentativnější glykosidovou sloučeninou v Cistanche tubulosa a její obsah může dosáhnout více než 30 % suché hmotnosti rostlin Cistanche tubulosa [23]. Výzkumná skupina dříve měřila obsah echinakosidu v různých částech rostlin Cistanche tubulosa a konkrétní výkon byl: obsahechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>vzdušná část; mezi nimi byl obsah echinakosidu v haustoriu nejvyšší. Fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase byla provedena s použitím cDNA z různých částí Cistanche tubulosa jako templátů a výsledky byly analyzovány 2– ΔΔCT metoda a byla provedena diferenciální analýza. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4A. Úroveň exprese genu CtSus v haustoriu byla nejvyšší, 1,5krát vyšší než v nadzemní části, a úroveň exprese v podzemní části byla výrazně vyšší než v nadzemní části, což je v souladu s akumulačním vzorem fenyletanolových glykosidů. zastoupený echinakosidem v různých částechCistanche tubulosa.

Obrázek 4 Relativní hladiny exprese CtSus v různých částech C. tubulosa a v suspenzních buňkách ošetřených PEG6000. A: Relativní hladina exprese CtSus v různých částech C. tubulosa; B: Hladina relativní exprese CtSus v suspenzních buňkách C. tubulosa ošetřených PEG6000 v různých časových bodech n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

VYSOCE KVALITNÍ CISTANČOVÉ SUROVINY

4.2 Analýza exprese CtSus v buňkách suspenze Cistanche deserticola za podmínek stresu suchem

Ukázal to předběžný průzkum projektustres ze sucha vyvolaný PEG6000můževýrazně zvýšitaakumulace fenylethanolových glykosidův suspenzních buňkách Cistanche. Od 3 do 9 dnů po indukci se obsah echinaceasidu výrazně zvýšil. Od 12. do 15. dne,rychlost růstu echinaceasideobsah se zpomalil a dosáhl maximální hodnoty 15. den. Poté, jak se doba kultivace prodlužovala, obsah echinaceaside se významně zvýšil. Obsah fruktosidu se postupně snižoval [24]. Na základě tohoto výzkumu tato práce použila cDNA neošetřených suspenzních buněk Cistanche deserticola a PEG 6000-indukovaných suspenzních buněk Cistanche deserticola jako templáty pro provádění fluorescenční kvantitativní PCR detekce v reálném čase ke zkoumání genu CtSus v suspenzi Cistanche deserticola buňky ve stresových podmínkách sucha. změny v hladinách exprese. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4B. V buňkách suspenze Cistanche deserticola indukovaných PEG6000 se exprese CtSus významně zvýšila 6. den po indukci a dosáhla nejvyšší hodnoty 9. den a poté klesla zpět na stejnou úroveň jako u kontroly. skupiny na stejné úrovni. Výše uvedené výsledky ukazují, že stres ze sucha může významně zvýšit expresi genu CtSus v suspenzní buněčné linii Cistanche deserticola, což je v souladu se vzorem akumulace echinaceasidu při stresu ze sucha. Vrchol exprese genu CtSus se však objevuje dříve než vrchol obsahu echinaceasidu, protože aktivní donor glykosylu syntetizovaný katalýzou CtSus je důležitým prekurzorem potřebným pro vícestupňovou glykosylační reakci v následné biosyntetické dráze echinaceasidu. Proto se spekuluje, že po vystavení stresu ze sucha budou organismy přednostně mobilizovat geny související s primárním metabolismem, aby dosáhly akumulace aktivních dárců, a poté dosáhnou akumulace důležitých sekundárních metabolitů.

VYSOCE KVALITNÍ CISTANČOVÉ SUROVINY

5 Studie trojrozměrné struktury proteinu CtSus a analýza klíčových aktivních míst

Na základě funkce CtSus při katalýze produkce glykosylového donoru UDP-glukózy byl dále studován strukturní základ katalytické aktivity CtSus. K predikci sekundární struktury proteinu byl použit online nástroj SOPMA. Výsledky ukázaly, že sekundární struktura CtSus obsahovala 55,28 % -helixů, 25,47 % náhodných závitů, 12,80 % prodloužených řetězců a 6,46 % - závitů (obrázek 5A), což ukazuje, že -helixy jsou nejdůležitější sekundární strukturní jednotky v proteinu CtSus, následují náhodné závity, které také tvoří velký podíl proteinu. Prodloužená vlákna a závity jsou distribuovány v celém proteinu. Podle existujících studií sacharózasyntáza obvykle existuje ve formě tetrameru, který je považován za její aktivní formu. Proto tento článek dále použil AlphaFold2 k predikci struktury proteinu CtSus a získal jeho trojrozměrnou strukturu proteinových tetramerů. Srovnání databáze PDB (Protein Data Bank) zjistilo, že sekvenční podobnost mezi Arabidopsis thaliana sacharózasyntázou AtSus1 (PDBID 3S28) a CtSus může dosáhnout 77,93 %. Předpokládaná struktura CtSus byla porovnána s trojrozměrnou strukturou AtSus1 a hodnota střední kvadratické odchylky (RMSD) po superpozici proteinu byla 1,11 Á, což ukazuje, že prostorové struktury těchto dvou jsou vysoce konzistentní (obrázek 5B).

Uváděná struktura krystalického komplexu protein-ligand Arabidopsis AtSus1 s UDP a fruktózou (PDBID3S29) byla použita jako templát [16] k analýze vazebného režimu CtSus s UDP a fruktózou. Výsledky molekulárního dokování jsou uvedeny na obrázku 5C. Lze pozorovat, že kapsy vázající substrát AtSus1 a CtSus jsou velmi podobné, pokud jde o typ aminokyselin, prostorovou distribuci a konfiguraci, a překrývání je vysoké, což dokazuje, že sekvence sacharózasyntázy je v rostlinách vysoce konzervovaná. Konformace dvou ligandů, UDP a fruktózy, ve vazebné kapse proteinového substrátu jsou znázorněny na obrázku 5D. Nejvýhodnější konformace UDP a CtSus pro molekulární dokování se dobře překrývá s konformací UDP v krystalovém komplexu AtSus1-UDP, což dokazuje přesnost výsledků molekulárního dokování. Interakce mezi UDP a klíčovými aminokyselinovými zbytky ve vazebné kapse proteinového substrátu je ukázána na obrázku 5E. UDP a CtSus jsou vázány hlavně vodíkovými vazbami a hydrofobními interakcemi. Klíčové aminokyselinové zbytky ve vazebné kapse substrátu zahrnují: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 a Glu681.

Reference

[1] Píseň ZH, Lei L, Tu PF. Pokroky ve výzkumu farmakologické aktivity v rostlinách CistancheHoffing. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ a kol. Chemomové srovnání mezi kultivovanou a divokou Cistanchetubulosa za použití1H-NMR spektroskopie [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y a kol. Cistanches Herba, od ohroženého druhu po velkou značku čínské medicíny [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Polysacharidy Cistanche deserticola chrání buňky PC12 před poškozením vyvolaným OGD/RP [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X a kol. Evoluce rostlinných nukleotidových-cukrových interkonverzních enzymů [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Tvorba rostlinného nukleotidového cukru, vzájemná konverze a záchrana recyklací cukru [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Biochemická charakterizace UDP-GlcNAc/Glc4-epimerázy z Escherichia coli O86:B7 [J]. Biochemistry, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr., et al. Identifikace UDP-N-acetylglukosamin4-epimerázy účastnící se glykosylace exosporiového proteinu u Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Transkriptomová identifikace genů sacharózasyntázy v Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Sacharóza syntáza: unikátní glykosyltransferáza pro vývoj procesu biokatalytické glykosylace [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Biosyntéza sacharózy [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.[12]Stein O, Granot