Abstraktní

ObjektivníProzkoumat účinek na snížení kyseliny močové a hodnocení bezpečnosti echinakosidu (Ech) extrahovaného zCistanche tubulosa. MetodyV testu akutní toxicity byl KM myším orálně podáván Ech v maximální koncentraci dvakrát denně pro pozorování akutní toxicity. Krysí model hyperurikémie (HUA) byl vytvořen s použitím 1,5 g.kg-1 oxonátu draselného + 0.1g.kg-1 adeninu. HUA modelové krysy byly náhodně rozděleny do modelové skupiny, alopurinolové skupiny (30 mg·kg⁻¹) a skupin s nízkou, střední a vysokou dávkou Ech (50, 75, 100 mg·kg⁻¹), s normální kontrolní skupinou (n=10 na skupinu). Léky byly podávány intragastricky jednou denně po dobu 28 po sobě jdoucích dnů. Po podání byly krysy usmrceny a bylo odebráno sérum pro detekci relevantních biochemických indikátorů a hladin xanthinoxidázy (XOD); byly pozorovány renální histopatologické změny. Orgány byly zváženy pro výpočet orgánových koeficientů; byly detekovány hladiny exprese příbuzných genů a proteinů v renální tkáni.VýsledkyPři testu akutní toxicity nebyly pozorovány žádné zjevné toxické reakce. Ech významně snížil hladiny kyseliny močové v séru, výrazně zlepšil renální funkci a renální tubulární/intersticiální léze u HUA modelu potkanů ​​a významně reguloval transkripci a hladiny exprese proteinů genů souvisejících s transportérem urátů v renální tkáni.ZávěrÚčinek Ech na snížení kyseliny močové u modelových krys HUA může souviset se snížením produkce kyseliny močové in vivo, regulací funkce ledvin a modulací exprese přenašečů urátů s příznivou bezpečností.Klíčová slova: Cistanche tubulosa; echinakosid; hyperurikémie; kyselina močová; transkripce genu; Proteinová exprese; Mechanismus působení; Hodnocení bezpečnosti

 

 

 

Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight je běžně používaná bylina tonizující ledviny v tradiční čínské medicíně (TCM). Jak je zaznamenáno vČínský lékopis, doplňuje jang ledvin, doplňuje esenci a krev a klinicky se používá při impotenci a neplodnosti, nedostatku esence a krve a bolestech pasu a kolen. Fenylethanoidové glykosidy jsou nejhojnější a biologicky aktivní složky vCistanche tubulosa, který ukazuje velký potenciál pro vývoj a aplikaci. Náš výzkumný tým dříve našel prostřednictvím síťové farmakologie a předběžných experimentů na myších, ze kterých pochází echinakosid (Ech).Cistanche tubulosaextrakt může vykazovat účinky na snížení kyseliny močové, zatímco jeho mechanismus a bezpečnost jsou uváděny jen zřídka. Tato studie bere patogenezi hyperurikémie jako vstupní bod ke zkoumání farmakologického účinku Ech na snížení kyseliny močové s cílem objasnit její mechanismus a vyhodnotit její bezpečnost.

1 Materiály a metody

1.1 Nástroje, činidla a zvířata

7100 automatický biochemický analyzátor (Hitachi, Japonsko); Čtečka mikrodestiček Multiskan GO 1510 (Thermo, USA); Elektroforetický systém BG-Power600i (Beijing Baijing Biotechnology Co., Ltd.); 7500 Fast Real-Time Fluorescent Quantitative PCR System (Applied Biosystems, USA).

Cistanche tubulosa extract (Ech, self-prepared, chromatographic purity >98 %); oxonát draselný, adenin (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); kreatinin (CREA), kyselina močová (UA), močovina (UREA), adenosindeamináza (ADA), alanintransamináza (ALT), aspartáttransamináza (AST), alkalická fosfatáza (ALP) testovací sady (Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.); souprava pro stanovení aktivity XOD (Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.); protilátky URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 (Jiangsu Qinke Biotechnology); kozí anti-králičí IgG/HRP konjugát (Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., šarže: 245440113); DEPC (Amresco, USA); M5 HiClear DL2000 DNA marker (Beijing Juhemai Biotechnology Co., Ltd.); TRIzol™ Reagent (Thermo Fisher Scientific, USA); 5× All-In-One RT MasterMix, EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low ROX (Aibimeng Biotechnology Co., Ltd.).

Čtyřicet myší KM stupně SPF (samci a samice, 18–22 g) a 90 samců potkanů ​​SD stupně SPF (150–180 g) poskytlo Centrum pro experimentální zvířata Lékařské univerzity v Xinjiang (výrobní licence č. SCXK Xin 2023-0001).

1.2 Metody a výsledky

1.2.1 Test akutní toxicity

Experimenty na zvířatech byly schváleny Etickou komisí Institutu pro výzkum léčiv v Sin-ťiangu (č. schválení IACUC-(Zhun)-2024-008, IACUC-(Zhun)-2024-009). Čtyřicet SPF-grade KM myší bylo po karanténě a aklimatizaci náhodně rozděleno do kontrolní skupiny a léčebné skupiny (n=20, samec a samice). Myši byly před podáním přes noc hladověny s volným přístupem k vodě. PodlePokyny pro testování toxicity po jedné dávce tradičních čínských léků a přírodních produktůByl připraven roztok s maximální koncentrací (250 mg·ml⁻1) průchodný 12-gauge žaludeční jehlou. Myším KM bylo perorálně podáváno 40 ml.kg-1 dvakrát denně ve 4hodinovém intervalu, s kumulativní dávkou 20 g.kg-1. Celkový stav, barva srsti, aktivita, chůze, duševní stav, výkaly a moč byly pečlivě sledovány z hlediska toxických symptomů, doby nástupu, trvání a zotavení. V léčené skupině nebyly pozorovány žádné nepříznivé toxické reakce (např. omezená aktivita, vyčerpanost, netečnost, smrt). Barva srsti, aktivita, chůze, duševní stav, výkaly a moč zůstaly během pozorovacího období normální. Tělesná hmotnost a příjem potravy nevykazovaly žádné významné rozdíly mezi léčenou a kontrolní skupinou. Hrubá pitva na konci pozorování neodhalila žádné abnormality v objemu orgánu, barvě nebo struktuře.

 

Obrázek 1 Účinky Echo tělesné hmotnosti (AB) a příjmu potravy (C,D) u myší

 

1.2.2 Založení, seskupení a správa modelu

Šedesát samců potkanů ​​SD (150–180 g) bylo aklimatizováno a rozděleno do normální kontrolní skupiny (n=10) a modelové skupiny (n=50). Modelové skupině bylo intragastricky podáváno 100 mg.kg-1 adeninu + 1.5 g.kg-1 oxonátu draselného (suspendovaného v 0,5% CMC-Na) v dávce 10 ml.kg-1 jednou denně po dobu 14 dnů; kontrolní skupina dostala 0,5% CMC-Na. Po modelování byla odebrána orbitální krev pro detekci UREA, CREA a sérové ​​kyseliny močové (SUA). Model byl považován za úspěšný, když byly významně zvýšeny UREA, CREA a SUA. Úspěšné HUA modelové krysy byly rozděleny do modelové skupiny, alopurinolové skupiny (30 mg.kg⁻1) a skupin s nízkou, střední a vysokou dávkou Ech (50, 75, 100 mg.kg⁻1) (n=10 na skupinu). K udržení stabilní hyperurikémie bylo všem skupinám kromě kontrolní skupiny každé ráno intragastricky podáváno 100 mg.kg⁻1 adeninu + 500 mg.kg⁻¹ oxonátu draselného (0,5% suspenze CMC-Na) a odpovídající léky každé odpoledne po dobu 14 dnů. Modelovací činidla byla poté zastavena, zatímco podávání léků pokračovalo dalších 14 dní.

1.2.3 Stanovení SUA a kyseliny močové v moči (UUA) u potkanů

Po posledním podání se krysy nechaly přes noc hladovět s volným přístupem k vodě. Moč byla shromážděna, odstředěna (3x103 r·min⁻1, 10 min), zředěna 1:9 fyziologickým roztokem a testována na UUA pomocí biochemického analyzátoru. Krev byla odebrána v anestezii a sérum bylo separováno (3 x 103 r·min⁻1, 10 min) pro detekci SUA. Ve srovnání s kontrolní skupinou vykazovala modelová skupina významně zvýšenou SUA (P<0.05) and decreased UUA (P<0.01). The allopurinol group and low-, medium-, and high-dose Ech groups had significantly reduced SUA (P<0.05); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly increased UUA (P<0.05 or P<0.01).

 

Obrázek 2 Účinek Ech na SUA(A) a UUA(B) u krys s modelem hyperurikémie

 

1.2.4 Stanovení hladin ADA a XOD v séru u potkanů

Sérová ADA byla měřena pomocí biochemického analyzátoru; Aktivita XOD byla detekována pomocí enzymatického imunosorbentního testu (absorbance při 290 nm). Ve srovnání s normální skupinou měla modelová skupina významně zvýšené ADA a XOD (P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced ADA (P<0.01); the allopurinol group and high-dose Ech group had significantly reduced XOD (P<0.01).

1.2.5 Stanovení hladin UREA, CREA, ALT, AST, ALP v séru

Ve srovnání s normální skupinou měla modelová skupina významně zvýšené UREA a CREA (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group had significantly reduced UREA (P<0.01); all Ech dose groups had significantly reduced UREA and CREA (P<0.05 or P<0.01); medium-/high-dose Ech groups had significantly reduced ALT (P<0.01); low-dose Ech group had significantly increased ALP (P<0.01).

1.2.6 Stanovení renálního orgánového koeficientu u potkanů

Orgánový koeficient=tělesná hmotnost (mg)/tělesná hmotnost (g). Ve srovnání s normální skupinou měla modelová skupina významně sníženou tělesnou hmotnost nalačno (P<0.01) and increased kidney and adrenal gland coefficients (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, all Ech dose groups had significantly increased body weight (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced kidney coefficients (P<0.01).

 

Tabulka 1 Účinky Ech na hladiny UREA, CREA, ALT, AST a ALP u modelových potkanů ​​s hyperurikémií (xˉ±s, n=10)

 

Skupina	Dávka / mg.kg-1	UREA / mmol·L⁻¹	CREA / μmol·L⁻¹	ALT / U·L⁻¹	AST / U·L⁻¹	ALP / U·L⁻¹
Řízení	–	8.00 ± 0.71	34.11 ± 3.33	51.22 ± 3.80	109.11 ± 11.62	206.00 ± 42.20
Model	–	23.20 ± 6.05**	100.10 ± 43.59*	62.00 ± 9.64	109.10 ± 7.92	173.10 ± 27.30
allopurinol	30	10.70 ± 1.95##	55.20 ± 13.27	52.70 ± 12.79	117.50 ± 21.71	198.40 ± 52.66
Ech	50	11.20 ± 3.33##	44.80 ± 21.01#	55.70 ± 12.59	106.10 ± 13.80	242.11 ± 55.04##
	75	9.90 ± 1.45##	41.20 ± 4.54#	46.50 ± 5.72##	102.10 ± 16.11	183.70 ± 22.31
	100	8.90 ± 1.10##	35.20 ± 2.74#	46.50 ± 5.72##	106.00 ± 15.19	195.20 ± 33.96

Poznámka:Ve srovnání s kontrolní skupinou: *P<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

Tabulka 2 Účinky ech na orgánové koeficienty u modelových potkanů ​​s hyperurikémií (xˉ±s, n=10)

 

Skupina	Dávka / mg.kg-1	Tělesná hmotnost nalačno / g	Koeficient jater	Koeficient ledvin	Koeficient nadledvinek	Koeficient sleziny	Koeficient brzlíku
Řízení	–	403.6 ± 28.0	26.92 ± 3.15	6.57 ± 0.55	0.14 ± 0.04	1.88 ± 0.26	1.07 ± 0.15
Model	–	352.5 ± 38.5**	26.60 ± 1.78	11.52 ± 1.67**	0.18 ± 0.03*	2.12 ± 0.23	1.03 ± 0.17
allopurinol	30	367.5 ± 26.3	25.76 ± 1.14	7.93 ± 0.51##	0.16 ± 0.03	1.93 ± 0.35	1.08 ± 0.27
Ech	50	392.3 ± 28.3#	27.04 ± 2.14	8.06 ± 0.54##	0.16 ± 0.04	2.09 ± 0.24	1.09 ± 0.19
	75	388.4 ± 34.8#	26.78 ± 2.37	7.80 ± 0.78##	0.16 ± 0.02	2.00 ± 0.20	0.99 ± 0.25
	100	386.3 ± 41.4#	25.91 ± 1.46	7.58 ± 0.33##	0.18 ± 0.03	2.09 ± 0.28	1.17 ± 0.31

Poznámka:Ve srovnání s kontrolní skupinou: *P<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

 

 

1.2.7 Histopatologické pozorování krysí ledviny (HE barvení)

Tkáně ledvin byly fixovány, dehydratovány, zality, nařezány (4 μm), obarveny HE a utěsněny. Modelová skupina vykazovala vylučování renálních tubulárních epiteliálních buněk, infiltraci nekrotických a zánětlivých buněk a fokální zánětlivou infiltraci v renálním intersticiu. Skupina s alopurinolem vykazovala mírné léze; Všechny léčebné skupiny vykazovaly zmírněné odlučování epiteliálních buněk, nekrózu a zánětlivou infiltraci.

 

 

Obrázek 4 HE barvící snímek ledvinové tkáně kontrolní skupiny (A), modelové skupiny (B), alopurinolové skupiny (C, D), nízké (E) a vysoké
(F)dávkové skupinyEch(×400)

 

1.2.8 Proteinová exprese URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 v ledvinách potkana

Imunohistochemie byla provedena pro detekci exprese proteinu (integrovaná optická hustota, IOD). Ve srovnání s normální skupinou měla modelová skupina významně upregulované URAT1 a GLUT9 (P<0.01) and downregulated OAT1 and OAT3 (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 and GLUT9 (P<0.05, P<0.01) and upregulated OAT1 (P<0.05, P<0.01); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly upregulated OAT3 (P<0.05, P<0.01).

 

Obrázek 5 Účinky hodnot EchonURAT1/IOD(A),GLUT9/IOD(B),OAT1/IOD(C)aOAT3/IODhodnoty(D)v
renální tkáň modelových potkanů ​​hyperurikémie

 

Obrázek 6 Účinky Ech na renální expresi URAT1 u potkaního modelu hyperurikémie

(Kontrolní skupina (A), modelová skupina (B), alopurinolová skupina (C) a skupiny 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech (D–F); IHC × 400)

 

Obrázek 7 Účinky Ech na renální expresi GLUT9 u potkaního modelu hyperurikémie

(Kontrolní skupina (A), modelová skupina (B), alopurinolová skupina (C) a skupiny 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech (D–F); IHC × 400)

Obrázek 8 Účinky Ech na renální expresi OAT3 u potkaního modelu hyperurikémie

(Kontrolní skupina (A), modelová skupina (B), alopurinolová skupina (C) a skupiny 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech (D–F); IHC × 400)

Obrázek 9 Účinky Ech na renální expresi OAT1 u potkaního modelu hyperurikémie

(Kontrolní skupina (A), modelová skupina (B), alopurinolová skupina (C) a skupiny 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech (D–F); IHC × 400)

 

 

1.2.9 Exprese mRNA URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 v ledvině potkana

Celková RNA byla extrahována a reverzně transkribována; qPCR byla provedena pomocí metody 2⁻ΔACt. Ve srovnání s normální skupinou měla modelová skupina významně upregulovanou mRNA URAT1 a GLUT9 (P<0.05) and downregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and low-/medium-dose Ech groups had significantly downregulated GLUT9 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly upregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05).

 

Tabulka 3 Sekvence primerů

 

Název primeru	Sekvence (5′ až 3′)	Velikost produktu
URAT1-	F: GTTCCCATGGCCTCCAGATTR: CATATGCATGCCACACAGCC	121 bp
GLUT9	F: TCTGCCCTGGCTGAGTATTGAR: ATGTGTCCCCCACATCATTGT	2147 bp
OAT1	F: TGTGAAGCCCTTCCGTTCTCR: TGTGAAGCCCTTCCGTTCTC	218 bp
OAT3	F: TACCTGCATGTGACCTTGCTGR: GAGACACTTCTCAGGCTTCCC	171 bp
-Aktin	F: CCCATCTATGAGGGTTACGCR: TTTAATGTCACGCACGATTTC	150 bp

 

1.2.10 Statistická analýza

Data byla analyzována pomocí SPSS 20.0, vyjádřeno jako průměr ± standardní odchylka (x±s). Jednocestná ANOVA byla použita pro skupinové srovnání a LSD nebo Tamhaneův T2 pro post-hoc testy. P<0.05 was considered statistically significant.

Obrázek 5 Účinky EchonURAT1/hodnoty IOD(A),GLUT9/hodnoty IOD(B),OAT1/hodnoty IOD(C) a OAT3/hodnoty IOD(D) na renální tkáň modelových potkanů ​​hyperurikémie

 

2 Diskuse

Přetrvávající hyperurikémie způsobuje poškození ledvin vyvolané kyselinou močovou a mění biomarkery renálních funkcí. Tato studie vytvořila model HUA potkanů ​​s použitím adeninu kombinovaného s oxonátem draselným, s UREA, CREA a SUA jako klíčové indikátory. Výsledky ukázaly, že Ech zCistanche tubulosazlepšená funkce ledvin a snížená SUA u HUA modelových krys s terapeutickými účinky. Hyperurikémie vzniká nadměrnou tvorbou kyseliny močové a poruchou vylučování. Jaterní XOD a ADA jsou klíčové enzymy v syntéze kyseliny močové; nadprodukce je hlavní příčinou HUA. Přibližně dvě třetiny denní dávky kyseliny močové se vylučují ledvinami, takže primárním faktorem je dysfunkce vylučování ledvin. URAT1 a GLUT9 zprostředkovávají reabsorpci kyseliny močové, zatímco OAT1 a OAT3 usnadňují vylučování kyseliny močové – to vše jsou klíčové cíle pro vývoj léků na snížení kyseliny močové. Ech významně snížil jaterní ADA a XOD, snížil renální URAT1/GLUT9 (protein a mRNA) a upreguloval OAT1/OAT3 (protein a mRNA), což ukazuje, že jeho účinek na snížení kyseliny močové působí prostřednictvím snížení syntézy a regulace transportérů. Při testování akutní toxicity nebyla u myší pozorována žádná mortalita ani zjevná akutní toxicita. Ech zlepšil renální funkci a snížil jaterní ALT u HUA potkanů ​​bez ovlivnění AST nebo orgánových koeficientů, což potvrzuje příznivou bezpečnost. Závěrem lze říci, že Ech vykazuje významné účinky na snížení kyseliny močové u potkanů ​​HUA indukovaných adeninem a oxonátem draselným potlačením syntézy kyseliny močové zprostředkované ADA/XOD, ochranou funkce ledvin a vyvážením exprese transportéru urátů se spolehlivou bezpečností pro potenciální klinické použití.

Reference

Zhang MH, Du JW, Zhang T, a kol. Mechanismus Bixie Fenqing Wan v intervenci hyperurikemických potkanů ​​regulací exprese urátového transportéru [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2023, 29(3): 1–8.

Niu YF, Zhou YF, Lin H a kol. Inhibice 3,5,2′,4′-tetrahydroxychalkonu na produkci kyseliny močové u hyperurikemických myší vyvolaných hypoxanthinem[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2018, 41 (1): 99–105.

Frédéric L. Gout: aktualizace[J]. Journal of Bone and Joint Surgery, 2019, 86(1): 103–115.

Takeo N, Kouhei O, Sho S a kol. Funkční spolupráce URAT1 (SLC22A12) a URATv1 (SLC2A9) při renální reabsorpci urátů[J]. Nefrologická dialyzační transplantace, 2013, 28(3): 603–611.

Lee SY, Cho SS, Han KM a kol. Korejský červený ženšen zlepšuje hladiny kyseliny močové v séru prostřednictvím downregulace URAT1 a upregulace OAT1 a OAT3[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2024, 47(11): 1876–1882.

Falah K, Zhang P, Nigam AK a kol. In vivo regulace malých molekul přírodních produktů, antioxidantů a živin pomocí OAT1 a OAT3[J]. Živiny, 2024, 16(14): 2242.

 

Vysoký obsahCistancheZdroj pro bylinky snižující hladinu kyseliny močové

Pro instituce, odborníky a jednotlivce zaměřené nabylinné terapie pro snížení kyseliny močovéa léčba hyperurikemie,vysoká čistotaCistanche tubulosavýpisje spolehlivou přírodní surovinou s ověřenou účinností.

Hlavní výhody zdroje napájení

Vysoce standardizované aktivní složky

Echinakosid (Ech): větší nebo roven 10 %–40 %

Akteosid: větší nebo roven 4 %–16 %

Celkové fenylethanoidní glykosidy: Větší nebo rovné 40 %–85 % (splňuje specifikace potravinářské a extraktové kvality pro výzkum a vývoj a vývoj produktů)

 

Základna a továrna Cistanche

Kontaktujte nyní

 

Supporting Service Of Wecistanche-Pro více podrobností o spolupráci
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

 

Ověřený mechanismus snižování kyseliny močové

Inhibuje XOD/ADA ke snížení syntézy kyseliny močové

Reguluje URAT1/GLUT9/OAT1/OAT3 a podporuje vylučování kyseliny močové

Chrání funkci ledvin a zmírňuje poškození ledvin související s hyperurikémií

Bezpečné a dobře tolerované

Test akutní toxicity: Žádné zjevné nežádoucí účinky při vysokých dávkách

Žádné významné poškození jater, ledvin nebo hlavních orgánů

Splňuje požadavky na potraviny a doplňky stravy

Autoritativní dodavatelský odkaz

https://www.xjcistanche.com/cistanche-extract-product/herbal-cistanche-dietary-supplement-capsules.html

 

Tento zdroj poskytuje standardizovanéCistanche tubulosaextrakt, kapsle, tablety, perorální tekutiny a služby zpracování na zakázku, podporující vývoj produktů na snížení hladiny kyseliny močové na bázi bylin, klinický výzkum a formulaci doplňků stravy.