Polysacharidy Cistanche Deserticola zlepšují stárnutí střev inhibicí aktivace zánětu NLRP3
Nov 12, 2025
Stárnutí vede k postupnému poklesu mnoha fyziologických funkcí a zvyšuje riziko onemocnění souvisejících s věkem [1]. Studie prokázaly, že stárnutí má významný vliv na strukturu a funkci střev [2]. Stárnutí střeva jakožto hlavního orgánu pro trávení, metabolismus a imunitní obranu může způsobit malabsorpci živin, metabolické poruchy a zhoršenou imunitní funkci [3–4], čímž se zvyšuje náchylnost ke gastrointestinálním onemocněním [5]. Chronický zánět je charakteristickým znakem stárnutí střev, ale jeho molekulární mechanismy nejsou dosud zcela objasněny. V současnosti mezi látky proti stárnutí patří především beta-nikotinamid mononukleotid (NMN), rapamycin, dasatinib plus kvercetin a další [3]. Mezi nimi je NMN klíčovým prekurzorem esenciálního koenzymu NAD+ a četné studie potvrdily, že významně zpomaluje stárnutí střev u přirozeně stárnoucích myší; v oboru je široce uznávána jako účinná intervence [4–5]. Proto je velmi důležité prozkoumat příslušné mechanismy a intervenční strategie.
Cistanche ústní likér pro nemoci související se stárnutím
Kontaktujte nyní a seznamte se s farmáři cistanche v Číně
Podpůrná služba Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Inflammasom rodiny pyrinových domén obsahujících 3 (NLRP3) receptorů pro oligomerizační doménu vázající se na nukleotidy je klíčovým regulátorem vrozené imunity a hraje důležitou roli u nemocí souvisejících se stárnutím. Jeho aktivace vyžaduje dva signály. První signál: molekulární vzory asociované s patogenem (PAMPs) a molekulární vzory asociované s poškozením (DAMPs) indukují expresi NLRP3 a prekurzoru interleukinu-1 (pro-IL-1). Druhý signál (jako je eflux draslíku a poškození mitochondrií) spouští seskupení zánětu, aktivuje kaspázu-1 a štěpí pro-IL-1 a pro-IL-18 za vzniku zralých IL-1 a IL-18, čímž vyvolává zánět [6]. Během stárnutí je střevní homeostáza narušena, což vede k uvolnění prozánětlivých faktorů, jako je lipopolysacharid (LPS), který trvale aktivuje zánět NLRP3 a tvoří chronický zánět nízkého stupně. To dále zhoršuje poškození střevní bariéry a dysbiózu, mění expresi proteinů těsného spojení, zvyšuje propustnost střeva a urychluje stárnutí střev [7–10].
Cistanche deserticola, ceněná tradiční čínská léčivá a potravinově homologní bylina známá jako „ženšen pouště“, tonizuje jang ledvin, vyživuje esenci a krev a zvlhčuje střeva, aby zmírnila zácpu. Jeho aktivní polysacharidy vykazují anti-aging, antioxidační a střevní ochranné vlastnosti [11–12]. Pokud jde o ochranu střev, polysacharidy (CDP) Cistanche deserticola mohou modulovat rovnováhu střevní mikroflóry inhibicí aktivace dráhy Toll-like receptor 4 (TLR4)/nukleární faktor-kappa B (NF-κB), čímž snižují hladiny LPS a opravují funkci střevní bariéry [13–14]. CDP mohou také zlepšit mitochondriální funkci prostřednictvím aktivace AMP-aktivované proteinkinázy (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1) dráhy, oddálit stárnutí buněk, regulovat metabolismus lipidů a zmírnit lipotoxické poškození ve střevních epiteliálních buňkách [15].
Ačkoli byly prokázány střevní ochranné účinky CDP, zůstává nejasné, zda zlepšují stárnutí střev potlačením inflammasomové dráhy NLRP3. Tato studie si klade za cíl prozkoumat mechanismus, kterým CDP inhibují aktivaci zánětu NLRP3zlepšit stárnutí střev.
Materiály
1.1 Pokusná zvířata
Padesát zdravých samců myší C57BL/6J (10 ve věku 2 měsíců; 40 ve věku 20 měsíců) bylo zakoupeno od společnosti Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd. Výrobní licence: SYXK (Beijing) 2023-0011. Zvířata byla chována v bariérovém prostředí v experimentálním zvířecím zařízení provinční nemocnice tradiční čínské medicíny Hebei za následujících podmínek: teplota 22 ± 2 stupně, relativní vlhkost 50 % ± 10 % a cyklus 12 h světlo/12 h tma. Všechny myši byly aklimatizovány po dobu 1 týdne. Tato studie byla schválena Institucionálním výborem pro péči o zvířata a použití provinční nemocnice tradiční čínské medicíny Hebei (IACUC-HPHCM-2025001).
1.2 Nástroje a činidla
Kryostat (Thermo Fisher; CryoStar NX50)
Laserový skenovací konfokální mikroskop (Nikon; AX)
Systém PCR v reálném čase (Thermo Fisher; 7500)
Multimode čtečka destiček (Tecan; Spark)
Beta-nikotinamid mononukleotid (Bontac, Čína; kat. BT05N120A005)
SA- -sada na barvení gal (Solarbio, Peking; Cat. 250003003)
Souprava myši LPS ELISA (CUSABIO/Huamei, Wuhan; kat. CSB-E13066m)
Souprava TransZol Up Plus RNA (TransGen Biotech, Peking; kat. ER501-01-V2)
MonAmp ChemoHS qPCR Mix (Monad; kat. MQ00501S)
Lgr5 polyklonální protilátka (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)
ZO-1 monoklonální protilátka, monoklonální protilátka NLRP3, monoklonální protilátka kaspáza-1, monoklonální protilátka ASC, monoklonální protilátka GAPDH, monoklonální protilátka Ki67 (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab179549, ab179549, ab52b, a1587,8509)
Metody
2.1 Příprava polysacharidů Cistanche deserticola
Materiál Cistanche (50 g) byl dvakrát extrahován odvarem s 8násobným objemem vody, pokaždé 1 hodinu. Filtráty byly spojeny a ochlazeny na teplotu místnosti. Pro vysrážení byl přidán bezvodý ethanol do konečné koncentrace 80 %. Po odstředění byl supernatant odstraněn. Sraženina byla rozpuštěna ve vodě, dialyzována a poté lyofilizována, aby se získal vzorek.
2.2 Seskupování a podávání zvířat
Po aklimatizaci bylo 40 20měsíčních myší C57BL/6J náhodně rozděleno do: skupiny přirozeného stárnutí, skupiny s nízkou dávkou CDP (2,5 g·kg-1), skupiny s vysokou dávkou CDP (5,0 g·kg-1) a skupiny NMN (200 mg·kg-1). Dalších deset 2měsíčních myší SPF C57BL/6J sloužilo jako mladá kontrolní skupina. Nízké a vysoké dávky CDP byly podávány orální sondou v dávce 2,5 g.kg-1 a 5,0 g.kg-1. Při použití konverze plochy povrchu těla a konverzního faktoru z člověka na myš 12 [16] odpovídají přibližně 1× a 2× klinické ekvivalentní dávce pro dospělé. Skupina NMN dostávala NMN 200 mg·kg−1 sondou. Mladé kontrolní skupiny a přirozené stárnoucí skupiny dostávaly stejné objemy fyziologického roztoku (10 ml·kg-1). Léčba byla podávána nepřetržitě po dobu 2 měsíců.
2.3 Příprava zmrazených řezů
Myši byly anestetizovány intraperitoneální injekcí pentobarbitalu sodného (30 mg.kg-1) a usmrceny. Břicho se rychle otevřelo, mezenterium se oddělilo a ileální tkáň se odebrala a nařezala na 5 μm na zmrazené řezy [17].
2.4 SA- -gal test na aktivitu střevní galaktozidázy
Barvení bylo provedeno podle instrukcí SA- -gal kit. Po inkubaci byl barvicí roztok odstraněn a řezy byly promyty PBS. Obrázky byly shromážděny pomocí inverzního mikroskopu.
2.5 PCR v reálném čase pro sekreční fenotyp spojený se stárnutím (SASP)
Celková RNA z ileální tkáně byla extrahována pomocí soupravy TransZol Up Plus. Reverzní transkripce byla provedena systémem GoScript za následujících podmínek: 42 stupňů po dobu 15 minut, 70 stupňů po dobu 15 minut, 4 stupně po dobu 10 minut. PCR v reálném čase byla provedena za použití MonAmp ChemoHS qPCR Mix s následujícím cyklováním: 95 stupňů 10 min; poté 40 cyklů 95 stupňů 15 s, 60 stupňů 1 min. Křivka tání: 95 stupňů 15 s, 60 stupňů 15 s, 95 stupňů 15 s. GAPDH sloužil jako vnitřní reference a relativní kvantifikace používala metodu 2^-ΔACt. Primery byly zakoupeny od Promega. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1.
2.6 Imunofluorescenční barvení pro expresi ZO-1
Ileální tkáň byla fixována ve 4% paraformaldehydu a nařezána parafinem na 5 μm. Řezy byly permeabilizovány 0,3% Tritonem X-100 po dobu 15 minut a blokovány 10% kozím sérem po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Primární protilátka proti ZO-1 (1:200) byla aplikována přes noc při 4 stupních. Po promytí PBS byla Cy3-konjugovaná sekundární protilátka (1:500) inkubována po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti ve tmě. Jádra byla kontrastně obarvena DAPI po dobu 5 minut. Sklíčka byla upevněna médiem proti vyblednutí a zobrazena konfokální mikroskopií. Intenzita fluorescence byla kvantifikována pomocí softwaru Image-Pro.
2.7 Imunohistochemie pro expresi Ki67 a Lgr5
Ileální řezy byly inkubovány s primárními protilátkami Ki67 (1:1000) a Lgr5 (1:200) přes noc při 4 stupních podle protokolu IHC soupravy, poté s odpovídajícími sekundárními protilátkami. Pro chromogenní vývoj byl použit DAB. Výsledky byly pozorovány světelnou mikroskopií. Střední optická hustota byla kvantifikována pomocí softwaru Image-Pro.
2.8 ELISA pro hladiny LPS
Standardy a vzorky (100 ul na jamku) byly přidány na destičku a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodiny. Poté byl přidán roztok streptavidinu konjugovaného s HRP (100 ul na jamku) a inkubován po dobu 30 minut. Substrát se přidal za podmínek chráněných před světlem a nechal se reagovat po dobu 30 minut. Reakce byla ukončena zastavovacím roztokem a absorbance byla měřena při 450 nm.
2.9 Western blot pro NLRP3, kaspázu-1 a ASC
Přibližně 30 mg ileální tkáně bylo rozemleto v kapalném dusíku. Byl přidán lyzační pufr RIPA obsahující inhibitory proteázy/fosfatázy; lyzáty byly inkubovány na ledu po dobu 30 minut a centrifugovány při 12 000 x g, 4 stupně po dobu 15 minut, aby se shromáždily supernatanty. Koncentrace proteinu byla stanovena testem BCA a upravena na 2 ug/μl. Stejná množství proteinu (20–40 ug) byla separována pomocí SDS-PAGE a přenesena na membrány PVDF. Membrány byly blokovány 5% odtučněným mlékem po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě, inkubovány s primárními protilátkami (NLRP3 1:1000, Caspase-1 1:500, ASC 1:1000) přes noc při 4 stupních a poté s HRP-konjugovanými sekundárními protilátkami (1:5000 při pokojové teplotě). Po promytí TBST byly vyvinuty signály. Intenzity pásů byly normalizovány na GAPDH.
2.10 Statistická analýza
Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka. Statistická analýza a grafy byly provedeny pomocí SPSS 26.0 a GraphPad Prism 8.0.2, v daném pořadí. K posouzení rozdílů mezi skupinami byla použita jednocestná ANOVA, po níž následoval Tukeyho post hoc test. Statistická významnost byla stanovena na P < 0,05.
Praktické poznámky pro čtenáře se zájmem o střevní motilitu a vývoj doplňků stravy
Funkční zaměření Cistanche deserticola: Tradičně se používá k zvlhčení střev a zmírnění zácpy; moderní data podporují bariérovou podporu, modulaci zánětu (TLR4/NF-κB) a mitochondriální funkci prostřednictvím AMPK/SIRT1.
Potenciální mechanismus proti stárnutí střeva zkoumaný zde: Potlačení aktivace zánětu NLRP3; snížení zánětu nízkého stupně vyvolaného LPS; zachování těsných spojů (např. ZO-1); udržování epiteliálních markerů proliferace/stemness (Ki67, Lgr5).
Typické experimentální orální dávky u myší: 2,5–5,0 g·kg-1 CDP po dobu 2 měsíců; NMN 200 mg·kg-1 jako pozitivní kontrola.
Překladová opatrnost: Dávky pro myši nejsou přímými doporučeními pro lidi. Studie využívá škálování plochy povrchu těla; Před vývojem produktu jsou nezbytné formulace a bezpečnost ekvivalentní lidem, testování identity a výroba GMP.
