Identifikace druhů a analýza chemického složení divokých rostlin cistanche z Keni

Abstraktní:Tato studie využívala rostlinnou morfologii, histologii a techniky čárového kódování DNA k identifikaci divokého druhu Cistanche v Keni. Obsahy hlavních aktivních složek, včetně fenylethanoidových glykosidů, cukerných alkoholů a betainu, byly ve volné přírodě Cistanche z Keni stanoveny metodou HPLC. Mezitím byla provedena analýza otisků prstů. Výsledky ukázaly, že divoká rostlina Cistanche shromážděná z Keni byla identifikována jako Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Obsah účinných látek jako napřechinakosid,cistanosid A, akteosid, isoacteosida 2'-acetylakteosid v C. senegalensis z Keni byly nižší než u domácí C. tubulosa, ale vyšší než u domácí C. deserticola. Obsah betainu byl podobný jako u domácí C. deserticola, ale neobsahuje glukózu. Vlastnosti otisku prstu jsou více podobné vlastnostem domácí C. tubulosa. Tato studie poskytuje základ pro ochranu zdrojů, hloubkový výzkum a vývoj zdroje Cistanche v Keni.

Klíčová slova: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Keňa; identifikace druhů; čárové kódování DNA; určení obsahu

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

Cistanche, ceněná bylina v tradiční čínské medicíně, označuje sušené, šupinaté, šťavnaté stonky pouštních rostlin, jako je např.Cistanche deserticolaYC MaaCistanche tubulosa(Schenk) Wight, oba zástupci čeledi Orobanchaceae. Cistanche, známá pro svou schopnost tonizovat jang ledvin, vyživovat esenci a krev a zvlhčovat střeva, aby zmírnila zácpu, je Cistanche oslavována v čínských bylinných textech po staletí. Jeho nejstarší léčebné záznamy se objevují ve starověké klasiceShennongova klasika Materia Medica, kde je Cistanche klasifikována jako bylina "vyššího stupně". V průběhu historie četné tradiční lékařské texty zdokumentovaly mocné výhody Cistanche, což mu vyneslo váženou přezdívku „Ženšen pouště“.

Různorodé farmakologické účinky přípravku Cistanche jsou připisovány jeho řadě bioaktivních sloučenin. Mezi nimi jsou fenylethanoidové glykosidy primárními aktivními složkami odpovědnými za tonizující účinky Cistanche na ledviny a vyživující dřeň. Tyto sloučeniny, jako je echinakosid a akteosid, vykazují neuroprotektivní, anti-demenci, stárnutí a hepatoprotektivní aktivity. Zejména echinakosid a akteosid jsou dvě referenční sloučeniny používané pro kontrolu kvality Cistanche, jak je uvedeno ve vydání čínského lékopisu z roku 2020. Kromě toho je projímavý účinek přípravku Cistanche způsoben hlavně jeho oligosacharidovými alkoholovými složkami, včetně betainu, mannitolu, fruktózy, glukózy a sacharózy. Těchto pět složek je široce uznáváno jako indikátory schopnosti Cistanche zvlhčovat střeva a podporovat pohyb střev.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

V Číně patří mezi hlavní druhy CistancheCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G. aCistanche sinensisG. Beck. Tyto druhy pocházejí z oblastí, jako je Vnitřní Mongolsko, Ningxia, Gansu a Xinjiang. Za severozápadní Čínou jsou druhy Cistanche také rozšířeny v suchých a pouštních oblastech Eurasie a severní a východní Afriky, včetně zemí jako Írán, Afghánistán, Keňa, Pákistán a Mongolsko.

Keňa, která se nachází ve východní Africe a rozprostírá se na rovníku, se většinou skládá z vysočin s průměrnou nadmořskou výškou 1 500 metrů, ale její severní oblasti jsou poušť nebo polopoušť. Domorodí obyvatelé Keni mají dlouhou historii používání léčivých rostlin k léčení. Oblast se může pochlubit bohatstvím léčivé flóry – například výtažky z kůry a kořenů stromu zubního kartáčku (Salvadora persicaL.) jsou známé pro své protizánětlivé a antibakteriální vlastnosti a často se používají k léčbě bolestí zubů a infekcí. The bark of the sandalwood tree (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) se používá k léčbě průjmu, zatímco odvary z masajské kopřivy (Urtica massaicaMildbr.) listů užívá se při bolestech žaludku. Tato bohatá tradice podpořila živou kulturu léčivých rostlin, ale kvůli problémům ekonomického rozvoje nebylo použití těchto léčivých rostlin plně zdokumentováno ani systematicky studováno.

Zajímavé je, že druhy Cistanche jsou v Africe často považovány za plevel a nedostalo se jim příliš pozornosti ani výzkumu. Ve skutečnosti neexistují téměř žádné publikované studie o africkém Cistanche. V reakci na pozvání ministerstva regionálního rozvoje pro aridní a polosuché země Východoafrického společenství provedl náš výzkumný tým terénní studii v Keni, aby prozkoumal místní zdroje Cistanche. Odebrali jsme divoké vzorky Cistanche, provedli botanickou identifikaci a analyzovali jejich primární bioaktivní sloučeniny. Cílem bylo porozumět druhové rozmanitosti a rozvojovému potenciálu Cistanche v Keni a poskytnout vědecký základ pro další výzkum a využití těchto cenných pouštních rostlin.

Cistanche tubulosa sušený celý kořen Prodej v Číně

Whatsapp nám pro více podrobností

 

 

Materiály a metody

Rostlinné materiály

Divoké vzorky cistanche z Keni shromáždili v srpnu 2023 profesoři Pengfei Tu a Yong Jiang z Fakulty farmaceutických věd Pekingské univerzity v Kajiado v Keni (01 stupeň 50'01"S; 36 stupeň 47'00"E). Dvě divoké rostliny Cistanche byly odebrány a označeny K1 a K2 spolu s kořeny jejich hostitelské rostliny (viz obrázek 1). Hostitelskou rostlinu identifikoval Kennedy Matheka, výzkumný asistent ve Východoafrickém herbáři, Národní muzea Keni, jakoSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, patřící do čeledi Amaranthaceae. Ukázky zCistanche deserticolaaCistanche tubulosabyly shromážděny z města Turpan a okresu Yutian v Uygurské autonomní oblasti Sin-ťiang a byly ověřeny profesorem Pengfei Tu jako čerstvé sukulentní stonkyCistanche deserticolaYC Ma aCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Všechny voucherové vzorky jsou uchovány v naší laboratoři.

Nástroje

Systém Waters Arc HPLC

Elektronická váha Quintix125D-1CN (Sartorius, Peking)

Optický mikroskop Olympus BX-50 (Olympus, Japonsko)

Panoramatický skener diapozitivů NanoZoomer-SQ (Hamamatsu Photonics, Japonsko)

Digitální ultrazvuková čistička KQ500DE (Kunshan Ultrasonic Instruments, Čína)

MM400 DNA extrakční mlýnek (Retsch, Německo)

PCR termocykler (Analytik Jena, Německo)

DYY-8C elektroforéza a nádrž (Liuyi Instrument Factory, Peking)

MINI Space 1000 gelový zobrazovací systém (Tanon, Shanghai)

Inkubátor s konstantní teplotou (Yiheng, Shanghai)

Reagencie

Echinakosid (šarže: DST191008-038), akteosid (DSTDL006101), isoakteosid (DST210601-060), D-mannitol (DSTDG006201) byly zakoupeny od Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulosid A (MUST-15040115), 2'-acetylakteosid (MUST-15071504), betain (MUST-23082505), bezvodá D-glukóza (MUST-23030214), fruktóza (MUST-23031403) a sacharóza (MUST-23082505) byly získány od Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. OCEANPAK), kyselina mravenčí (HPLC čistota, VOKA Reagents) všechny měly chromatografickou čistotu. Pro molekulární analýzu byla použita souprava pro extrakci rostlinné genomové DNA (DP305, Tiangen Biotech, Čína) a ultračistá voda.

Příprava, barvení a pozorování řezů sukulentních stonků

Podle metody v odkazu [10] byly čerstvé sukulentní stonky Cistanche nařezány na vhodnou velikost a konzervovány ve fixačním prostředku FAA (70% ethanol: ledová kyselina octová: formaldehyd=90:5:5). Po promytí tekoucí vodou k odstranění zbytkového fixativa byly tkáně změkčeny kyselinou fluorovodíkovou, obarveny safraninem, dehydratovány, zality v parafínu a nařezány. Po montáži byla sklíčka vypálena, parafín roztaven a řezy obarveny 95% roztokem ethanolu Fast Green, poté uzavřeny neutrální pryskyřicí. Morfologie tkáně byla pozorována pod mikroskopem a dobře tvarované řezy byly skenovány pomocí panoramatického skeneru pro získání obrázků s vysokým rozlišením.

Extrakce DNA, PCR amplifikace a sekvenování

Celková DNA ze vzorků Cistanche a kořenů hostitelských rostlin byla extrahována pomocí soupravy pro extrakci rostlinné genomové DNA (Tiangen), podle protokolu výrobce. Koncentrace DNA a poměry OD260/OD280 byly měřeny mikroobjemovým UV spektrofotometrem pro posouzení kvality před pokračováním.

PCR amplifikace byla zaměřena na oblast vnitřního transkribovaného spaceru 2 (ITS2) ribozomální DNA a genu chloroplastu psbA-trnH pro molekulární identifikaci [11]. Sekvence primerů byly následující:

ITS2 vpřed: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 reverzní: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH vpřed: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH reverzní: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

PCR reakce (25 μl) zahrnovaly 12,5 μl 2× Taq Master Mix, 1 μl každého přímého a reverzního primeru (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μl templátu DNA a 8,5 μl ddH₂O. ITS2 zesílení: 94 stupňů 5 min; poté 35–40 cyklů 94 stupňů 30 s, 56 stupňů 30 s, 72 stupňů 45 s; konečné prodloužení při 72 stupních 10 min. psbA-trnH amplifikace: 95 stupňů 4 min; 35 cyklů 94 stupňů 30 s, 55 stupňů 1 min, 72 stupňů 1 min; konečné prodloužení při 72 stupních 10 min. Produkty PCR byly analyzovány gelovou elektroforézou a cílové pásy byly podrobeny Sangerovu obousměrnému sekvenování. Sekvenční chromatogramy byly analyzovány pomocí CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., USA), aby se získaly cílové sekvence DNA, které byly identifikovány pomocí systému čárových kódů DNA Chinese Materia Medica a analýzy BLAST v databázi GenBank. Fylogenetické stromy byly konstruovány pomocí softwaru MEGA X pro identifikaci druhů.

Kvantitativní stanovení pěti fenylethanoidních glykosidů

Obsah pěti fenylethanoidových glykosidů byl stanoven podle dříve zavedených metod [13]. Příprava referenčních roztoků: přesně navážíme echinakosid, tubulosid A, akteosid, isoakteosid a 2'-acetylakteosid a rozpustíme v 50% methanolu, aby se připravil směsný standardní roztok předem stanovené koncentrace. Chromatografické podmínky: kolona Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 um); mobilní fáze A: acetonitril–methanol (6:1, v:v); mobilní fáze B: 0,1% pufr kyseliny mravenčí; gradientová eluce: 0–5 min, 10 %–18 % A; 5–15 min, 18 %–24 % A; 15–20 min, 24 %–26 % A; 20–28 min, 26 %–30 % A; 28–35 min, 30 %–35 % A. Průtok: 1,0 ml·min⁻¹; teplota kolony: 30 stupňů; detekční vlnová délka: 330 nm. Metoda: vstříkněte po 10 μl roztoku standardu a roztoku vzorku do HPLC pro analýzu.

Kvantitativní stanovení betainu, mannitolu, fruktózy, glukózy a sacharózy

Tyto složky byly kvantifikovány podle předchozích metod [14]. Referenční roztoky: přesně navážíme betain, mannitol, fruktózu, glukózu a sacharózu, rozpustíme ve vodě a připravíme smíšený standardní roztok. Roztoky vzorků: roztok vzorku Cistanche (připravený výše uvedeným způsobem) nařeďte 50% methanolem na 1/5 původní koncentrace, dobře promíchejte a přefiltrujte přes 0,22 μm mikroporézní membránu. Chromatografické podmínky: Kolona Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobilní fáze: acetonitril–voda (77:23); průtok: 0,7 ml.min-1; teplota kolony: 25 stupňů; detekce s odpařovacím detektorem rozptylu světla (ELSD): teplota driftové trubice 100 stupňů, průtok nosného plynu 3 L·min⁻¹. Kvantifikace byla provedena nástřikem 5 μl a 10 μl standardních roztoků a 5 μl roztoku vzorku a výpočtem obsahu pomocí externí standardní dvoubodové logaritmické rovnice.

Hodnocení podobnosti otisků prstů

Roztoky vzorků byly připraveny tak, jak je popsáno výše, a podmínky a metody HPLC byly stejné jako pro kvantifikaci fenylethanoidových glykosidů. Chromatografická data byla importována do „systému pro hodnocení podobnosti podobnosti otisků prstů tradiční čínské medicíny (vydání 2012)“. Jako referenční byl použit chromatogram vzorku K1 s pěti píky fenylethanoidních glykosidů označenými pro vícebodovou korekci, generování překryvných a referenčních chromatogramů a výpočet podobnosti otisků prstů.

 

 

Výsledky a analýza

1. Morfologická identifikace Cistanche

Divoké exempláře Cistanche shromážděné v Keni vykazují výrazné morfologické vlastnosti. Květenstvím je klas s jedním listenem dlouze vejčitě kopinatého tvaru a dvěma malými listeny, které jsou po obou stranách lysé. Kalich je trubkovitý, na vrcholu má pět tupých laloků. Koruna je trubkovitě zvlněná, měří 3–4 cm na délku, asi 2,5krát delší než kalich, s pěti laloky na vrcholu a zahnutými okraji. Koruna má žlutou barvu (obrázek 1A, B), sušením zhnědne. Vlákna jsou přibližně 3 cm dlouhá, s několika jemnými chloupky na bázi. Styl je o něco delší než tyčinky a stigma je téměř kulovité, hladké a lysé. Tyčinky jsou čtyři, s dlouze vejčitými prašníky, které jsou hustě pokryty dlouhými vlněnými chlupy; základna prašníku je náhle špičatá. Tato funkce je v souladu s popisyCistanche deserticolaaCistanche salsav "Flóře Číny"; naproti tomu prašník základnaCistanche tubulosaje tupá a zaoblená, což ji výrazně odlišuje od ostatních druhů stejného rodu [7].

Kromě toho hostitelská rostlina,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, je hodně rozvětvený keř. Jeho mladé větve jsou hustě pokryty světle žlutými nebo bílými vlnitými chlupy. Listy jsou široce lopatkovité-obvejčité s úzkou bází (obrázek 1D, E). Květenství jsou hustě seskupená podél stopky, která je spolu s osou květenství pokryta šedobílou nebo světle šedou nebo bílou vlněnou chloupkou.

Sukulentní stonek divokého Cistanche je zploštělý válcovitý, s bledě žlutým nebo nahnědlým povrchem hustě pokrytým jehličkovitými, masitými šupinami uspořádanými v řadách. Textura je pevná, ale mírně pružná (obrázek 2A). Průřez sukulentním stonkem je světle žlutý nebo nahnědlý, s rozptýlenými světle hnědými cévními svazky viditelnými pouhým okem (obrázek 2B). Pod mikroskopem se cévní svazky jeví jako vejčité nebo vřetenovité, složené z xylému a floému, často přítomné jako osamocené rozptýlené svazky nebo seskupené do párů či trojic, s floémem orientovaným v různých směrech (obrázek 2C, D). Podle vydání čínského lékopisu z roku 2025 je průřezCistanche deserticolaje nahnědlý, vyznačuje se bleděhnědými tečkovitými cévními svazky uspořádanými do zvlněného prstence, často tvořící uvnitř přeložený prstencový svazek; v kontrastu,Cistanche tubulosazobrazuje rozptýlené tečkovité cévní svazky, což je klíčový rozlišovací znak pro identifikaci těchto dvou typů řezů Cistanche [1]. Divoká Cistanche z Keni také vykazuje v příčném řezu rozptýlené tečkovité cévní svazky, které jsou v souladu s charakteristikamiCistanche tubulosa.

 

 

Obrázek 2 Vzhled a charakteristiky průřezu divoké rostliny Cistanche (K2) v Keni. A: Vzhled stonku; B: Průřez dužnatého stonku; C: Parafínový řez dužnatého stonku (zelené barvení rychle na safraninu); D: Zvětšený pohled na cévní svazek v parafínovém řezu