Výběr botanické ingredience pro péči o pleť by měl zahrnovat více než jen hledání přitažlivého příběhu o rostlině. Pro značku péče o pleť, smluvního výrobce nebo distributora přísad jsou užitečnější otázky:

Jaké sloučeniny jsou v extraktu přítomny?

Jak důsledně může výrobce kontrolovat jejich koncentrace?

Jaké experimenty podporují navrhovanou aplikaci?

Vztahuje se důkaz na skutečnou nakupovanou přísadu?

Jaké další testování je potřeba před uvedením hotového produktu na trh?

Technický dokument zkoumaný v tomto článku se zaměřuje naverbascosid odvozený od Cistanchea jeho navrhované aplikace v produkci kožních lipidů, hydrataci a výzkumu souvisejícího s bariérami.

Popisuje jak proces čištění, tak laboratorní experimenty srovnávající purifikovaný verbascosid s několika extrakty Cistanche a dalšími složkami.

 

 

16% extrakt verbascoside cistanche

Ústřední komerční poučka je přímočará: obecný extrakt z Cistanche a vysoce čištěná sloučenina získaná z Cistanche by se neměly považovat za vzájemně zaměnitelné složky.

Důkazní poznámka:Výsledky výzkumu níže jsou uvedeny v textu čínského patentu dodaného k překladu. Dodávaný materiál nezahrnuje původní čísla, kompletní numerické soubory dat, podrobnosti o zveřejnění patentů ani klinické studie na lidech. Mělo by se tedy chápat jako technické zveřejnění, nikoli jako nezávislé potvrzení účinnosti hotového přípravku nebo schválení regulačními orgány.

 

1. Co je Verbascoside?

Verbascoside je také známý jakoakteosid. Jedná se o názvy pro stejnou chemickou látku, nikoli pro dvě různé účinné látky. Registr látek FDA uvádí oba názvy pod stejnou identitou látky. (precision.fda.gov)

 

 

V dodaném popisu je verbascosid popsán jako fenylethanoidový glykosid získaný ze sušených dužnatých stonků druhu Cistanche. Hlavní jmenované botanické zdroje jsou:

Cistanche deserticola

Cistanche tubulosa

Cistanche sinensis

Cistanche salsa

Dokument zkoumá verbascosid jako potenciální botanickou aktivní látku pro topické formulace, se zvláštním důrazem na metabolismus lipidů, produkci kyseliny hyaluronové, proteiny s úzkým spojením a migraci buněk.

Proč na názvu záleží při nákupu ingrediencí

Při porovnávání nabídek dodavatelů si vyžádejte potvrzení:

Botanické druhy a rostlinná část.

Zda je materiálem celý extrakt, standardizovaný extrakt nebo čištěná sloučenina.

Naměřený obsah verbascosidu.

Použitá analytická metoda a referenční standard.

Zda uvedené procento představuje hmotnostní test nebo procento chromatografické plochy.

Samotná citace pro "Cistanche extrakt" neposkytuje dostatek informací pro určení, zda odpovídá materiálu hodnocenému v konkrétním experimentu.

2. Proč se zveřejnění zaměřuje na kožní bariéru?

Dokument představuje víceúčelový výzkumný koncept spíše než jednoduché tvrzení o zvlhčování povrchu.

Jeho navrhovaná sekvence je:

Obnova epidermálních buněk → silnější spojení mezi buňkami → podpora lipidů → produkce kyseliny hyaluronové → aktivita související s opravou

K prozkoumání tohoto konceptu použili vědci buňky HaCaT. HaCaT je imortalizovaná buněčná linie lidských keratinocytů, která byla založena jako laboratorní model pro studium epidermální biologie a keratinizace. Nejedná se o buněčný typ přirozeně nazývaný „HaCaT“ v kůži člověka. (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

Pro kupující přísad je toto rozlišení důležité:výsledky v kultivovaných buňkách jsou výchozím bodem výzkumu, nikoli náhradou za testování hotového produktu na lidské kůži.

Hlášené hlavní koncové body

Oblast výzkumu	Rozměry popsané v dodaném dokumentu	Praktický výklad
Buněčná odezva	CCK-8 test	Koncový bod screeningu; další metody by posílily požadavek na šíření
Aktivita související s lipidy	aktivita syntázy mastných kyselin; Exprese ACC, FASN a N-SMázy	Podporuje další zkoumání metabolismu lipidů, ale přímo nekvantifikuje kompletní lipidový profil kožní bariéry
Kyselina hyaluronová	obsah HA; Exprese HAS2, HAS3 a CD44	Podporuje další zkoumání cest souvisejících s HA
Spojení mezi buňkami	Hladiny Claudinu-1 a okludinu	Spíše než úplnou bariérovou funkci měří vybrané proteiny s úzkým spojením
Činnost související s opravami	Test buněčného poškrábání	Koncový bod in vitro pro uzavření mezery, nikoli klinická studie hojení ran
Zadržování vlhkosti	Retence hmoty na skleněných deskách	Laboratorní test na úrovni složení, nikoli studie hydratace na kůži

Tyto interpretace vyplývají z experimentálních metod popsaných v dodaném textu.

 

3. Proč je tento výzkum užitečný pro podniky v péči o pleť?

Popis porovnává několik materiálů spíše než předpokládat, že každá složka odvozená od Cistanche vytváří stejnou odezvu.

Mezi testované materiály patří:

Polysacharidový extrakt Cistanche.

Několik extraktů obsahujících fenylethanoid-glykosidy.

Celkový fenylethanoidový glykosidový extrakt.

Echinakosid.

Čištěný verbascosid.

Podle dodaného dokumentu čištěný verbascosid vykazoval aktivitu napříč několika měřenými koncovými body. Některé smíšené extrakty vykazovaly aktivitu v určitých testech, ale ne v jiných.

Přehled o nákupu

Kupte si specifikaci, která odpovídá vašemu cíli vývoje – nejen název závodu.

Například:

Pokud je váš projekt založen na experimentech s purifikovaným verbascosidem, vyžádejte si data pro purifikovaný materiál.

Pokud vaše formulace používá standardizovaný celý extrakt, požádejte o testování tohoto extraktu.

Pokud dodavatel uvádí výzkum jiného extrakčního procesu, zeptejte se, zda je testované složení srovnatelné s nabízeným materiálem.

Důkazy pro jednu třídu přísady by neměly být automaticky převedeny na jinou.

4. Jak je verbascosid připraven v popisu?

Popsaný proces má čtyři hlavní fáze:

Botanická příprava:Sušené dužnaté stonky Cistanche předem upravte a rozdrťte na prášek.

Extrakce:Použijte 50%–80% vodný ethanol.

Obohacení:Oddělte frakce pomocí AB-8 makroporézní adsorpční pryskyřice.

Čištění:Použijte chromatografii na silikagelu s následnou koncentrací a lyofilizací.

Uvedená výsledná čistota jealespoň 98%, ačkoli dodaný text nezahrnuje analytickou validaci nebo data šarže potřebná k nezávislému potvrzení této specifikace.

Zásadní výrobní otázka: Zbytková rozpouštědla

Popsaný chromatografický krok používáchloroform a methanol.

V případě komerčního projektu požádejte výrobce o aktuální seznam výrobních rozpouštědel, kontroly odstranění rozpouštědla a výsledky zbytkového rozpouštědla specifické pro šarži. ICH Q3C poskytuje farmaceutický rámec pro hodnocení rizik zbytkových rozpouštědel; neměl by být reprezentován jako univerzální kosmetický akceptační standard. (ema.europa.eu)

Nepředpokládejte, že „rostlinný“ znamená „vyrobený pouze z vody a etanolu“.

 

5. Co vlastně ukazuje test retence vlhkosti?

Dodaný dokument popisuje srovnání:

Sérum obsahující2 % verbascosidu.

Sérum obsahující2 % echinakosidu.

Pozitivní kontrolní sérum obsahující5% glycerinu.

Vzorky byly umístěny na25 stupňů a 50% relativní vlhkosta jejich hmotnost byla měřena v průběhu času.

Zveřejnění uvádí, že vzorek obsahující verbascosid si za těchto podmínek udržel větší hmotnost.

To je potenciálně užitečné pozorování při screeningu formulací. Popsaná metoda však nestanoví:

Vynikající hydratace na lidské pokožce.

Nižší transepidermální ztráta vody.

Klinická převaha nad glycerinem.

Lepší výkon v každé formulaci.

Že pozorovaný rozdíl vyplynul pouze z jmenovaného aktivního, bez plně zveřejněného porovnání shodných vozidel.

Pro značku plánující srovnávací tvrzení otestujte hotové formulace pomocí vhodně navržené studie.

 

6. Praktický kontrolní seznam ingrediencí Cistanche

Při hodnocení dodavatele extraktu Cistanche nebo výrobce purifikovaného verbascosidu použijte následující otázky.

Otázka k nákupu	Dokumentace na vyžádání
Jaký je botanický zdroj?	Identifikace druhů, prohlášení o části rostliny a informace o sledovatelnosti
Co přesně se dodává?	Kompletní složení, včetně nosičů, pomocných látek a pomocných látek, kde je to vhodné
Jaké množství verbascosidu je přítomno?	Osvědčení o analýze a metodě stanovení specifické pro šarži
Jak se potvrzuje identita?	Chromatografická identifikace a referenční standardní informace
Jaká rozpouštědla se používají?	Aktuální výrobní prohlášení o rozpouštědle a výsledky testů zbytkového rozpouštědla
Jak konzistentní je výroba?	Reprezentativní výsledky z více šarží
Je materiál vhodný pro zamýšlené použití?	Dokumentace k zamýšlenému použití a vhodná bezpečnostní dokumentace
Bude to fungovat ve vybraném vzorci?	Údaje o rozpustnosti, kompatibilitě, stabilitě a vývoji balení
Co podporuje navrhovaná tvrzení?	Zprávy ze studií pro stejnou jakost složky a pokud možno i konečnou formulaci

 

Nepoužívejte jako bezpečnostní závěr výraz „přirozený“.

Dodaný patentový text poskytuje příznivé bezpečnostní prohlášení založené na botanickém původu složky. Toto prohlášení vyžaduje kvalifikaci pro komerční publikování.

FDA vysvětluje, že zdroj složky neurčuje její bezpečnost: materiály rostlinného původu mohou také obsahovat toxické nebo alergenní látky. Bezpečnost musí být posouzena pro zamýšlené podmínky použití. (fda.gov)

Z tohoto důvodu požadujte spíše bezpečnostní zdůvodnění, než abyste se spoléhali na „přírodní“, „bylinné“ nebo „vysoké čistoty“ jako samostatné záruky.

 

7. Jak by měla značka diskutovat o výzkumu?

Udržujte tři vrstvy oddělené:

Co tvrdí zveřejnění.

Co měřily uvedené experimenty.

Co prokázal hotový výrobek.

Například „vyšetřováno v buňkách HaCaT na aktivitu související s lipidy“ se podstatně liší od „klinicky prokázáno, že opravuje kožní bariéru“.

Stejně tak zmínky o léčbě ekzému, léčbě atopické dermatitidy nebo hojení ran by neměly být přímo kopírovány do běžných tvrzení o kosmetických výrobcích. Ve Spojených státech mohou tvrzení o léčbě onemocnění nebo ovlivnění struktury nebo funkce těla způsobit, že produkt bude regulován jako lék. (fda.gov)

Výzkumný článek nebo patentový odkaz nejsou samy o sobě povolením k uplatnění terapeutického marketingového tvrzení.

8. Doporučená cesta rozvoje

Pro firmu zvažující verbascoside odvozený od Cistanche je užitečná vývojová sekvence:

Definujte zamýšlenou kategorii produktu a cílový trh.

Vyberte stupeň přísady a analytickou specifikaci.

Zkontrolujte složení, kontaminanty, zbytková rozpouštědla a bezpečnostní dokumentaci.

Vyvinout prototyp a posoudit kompatibilitu přísad.

Vyhodnoťte stabilitu složení a balení.

Proveďte vhodná mikrobiologická a bezpečnostní posouzení.

Otestujte hotový výrobek podle zamýšlených tvrzení o výkonu.

Před spuštěním zkontrolujte konečný web, štítek a jazyk reklamy.

Rozsah koncentrace v popisu -0.01%–5.0%- by mělo být považováno za zveřejněný rozsah, nikoli jako univerzálně ověřené doporučení ohledně formulace.

 

Sečteno a podtrženo pro nákupčí ingrediencí

Díky dodanému výzkumu je verbascoside odvozený od Cistanche kandidátem pro další vývoj péče o pleť, zejména pro projekty zkoumající hydrataci a laboratorní koncové body související s bariérou.

 

Seznam obsahu akteosidů Cistanche

 

Kliknutím přejdete na jiný obsah seznamu extraktů akteosidů cistanche

 

 

 

Jeho nejužitečnější lekcí není jen to, že "Cistanche je dobrý pro pokožku." To je onometoda extrakce, obsah účinných látek, identita přísad a kvalita důkazů, to vše ovlivňuje to, zda je botanická přísada vhodná pro konkrétní komerční projekt.

Při oslovování výrobce Cistanche začněte přesným požadavkem:

"Uveďte prosím botanickou identitu, specifikaci verbascosidu, analytickou metodu, reprezentativní certifikáty analýzy, výsledky reziduálních rozpouštědel, bezpečnostní dokumentaci a pokyny pro složení přísad navržené pro náš projekt."

Tento požadavek vytváří mnohem silnější základ pro vývoj produktu než obecný dotaz na prášek z bylinných extraktů.

 

(54) Název vynálezu

Způsob přípravy verbascosidu a způsob jeho aplikace pro podporu tvorby kožních lipidů

(57) Abstrakt

[0001] Vynález se týká způsobu přípravy verbascosidu a způsobu jeho aplikace pro podporu tvorby kožních lipidů, patřících do technické oblasti péče o pleť a topických produktů.

Metoda zahrnuje následující kroky:

Výběr sušených dužnatých stonků rostlin OrobanchaceaeCistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensisneboCistanche salsa; drcení stonků po předběžné úpravě; jejich extrakci pod zpětným chladičem 50%-80% vodným roztokem ethanolu dvakrát až čtyřikrát vždy po dobu jedné až tří hodin; kombinování extraktů; a jejich zahuštění za sníženého tlaku, dokud nezůstane žádný zápach ethanolu, čímž se získá koncentrovaný roztok.

Provedení koncentrovaného roztoku přes AB-8 kolonu s makroporézní adsorpční pryskyřicí; sekvenční eluce deionizovanou vodou a 30%-50% vodným roztokem ethanolu k odstranění nečistot; potom eluce cílových složek 60%-90% vodným roztokem ethanolu; sebrání eluátu a jeho zahuštění za sníženého tlaku; čištění pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu za použití směsi chloroform-methanol v objemovém poměru v rozmezí od 5:1 do 2:1 jako eluentu; sběr cílových frakcí; a jejich zahuštění za sníženého tlaku s následným lyofilizací za získání přečištěného verbascosidu.

Prospěšné účinky uvedené pro vynález spočívají v tom, že verbascosid chrání pokožku a vykazuje zlepšenou aktivitu péče o pokožku, když je začleněn do produktů.

 

Nároky

Nárok 1

1. Způsob přípravy verbascosidu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

Výběr sušených dužnatých stonků rostlin OrobanchaceaeCistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensisneboCistanche salsa; jejich rozmělnění po předběžné úpravě; jejich extrakci pod zpětným chladičem 50%-80% vodným roztokem ethanolu dvakrát až čtyřikrát vždy po dobu jedné až tří hodin; kombinování extraktů; a jejich zahuštění za sníženého tlaku, dokud nezůstane žádný zápach ethanolu, čímž se získá koncentrovaný roztok.

Provedení koncentrovaného roztoku přes AB-8 kolonu s makroporézní adsorpční pryskyřicí; sekvenční eluce deionizovanou vodou a 30%-50% vodným roztokem ethanolu k odstranění nečistot; potom eluce cílových složek 60%-90% vodným roztokem ethanolu; sebrání eluátu a jeho zahuštění za sníženého tlaku; čištění pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu za použití směsi chloroform-methanol v objemovém poměru v rozmezí od 5:1 do 2:1 jako eluentu; sběr cílových frakcí; jejich zahuštění za sníženého tlaku; a jejich lyofilizací za získání čištěného verbascosidu s čistotou alespoň 98 %.

 

Nárok 2

2. Způsob přípravy verbascosidu podle nároku 1, kde poměr materiálu k rozpouštědlu během refluxní extrakce je v rozmezí od 1:10 do 1:20 a teplota extrakce je v rozmezí od 60 stupňů do 80 stupňů.

 

Nárok 3

2. Způsob přípravy verbascosidu podle nároku 1, kde poměr průměru k výšce sloupce makroporézní adsorpční pryskyřice AB-8 je v rozsahu od 1:8 do 1:15 a eluční průtok je v rozsahu od 1 do 3 BV/h.

 

Nárok 4

2. Způsob přípravy verbascosidu podle nároku 1, kde podmínky lyofilizace zahrnují teplotu v rozsahu od -40 stupňů do -50 stupňů, podtlak v rozsahu od 10 do 30 Pa a dobu sušení v rozsahu od 12 do 24 hodin.

 

Nárok 5

5. Způsob aplikace verbascosidu k podpoře produkce kožních lipidů, za použití verbascosidu připraveného podle kteréhokoli z nároků 1–4, vyznačující se tím, že způsob aplikace zahrnuje:

Přidání verbascosidu k topickému produktovému základu v předem stanovené hmotnostní frakci a rovnoměrné míchání za vzniku konečného produktu; aplikace hotového výrobku na povrch kůže jednou nebo dvakrát denně; umožnění verbascosidu proniknout a působit na epidermální HaCaT buňky, aby upregulovaly genovou a proteinovou expresi ACC, FASN a N-SMázy a zvýšily aktivitu syntázy mastných kyselin; a pokračující používání po dobu jednoho až čtyř týdnů ke zvýšení syntézy kožních lipidů.

Verbascosid podporuje proliferaci HaCaT buněk, hojení ran, expresi proteinů s pevným spojením a produkci lipidů a kyseliny hyaluronové, čímž poskytuje vícecílové bariérové ​​funkce.

Používá se v celém řetězci údržby kožní bariéry, který zahrnuje obnovu epidermálních buněk, zesílené mezibuněčné spojení, doplnění lipidové matrice a syntézu kyseliny hyaluronové jako přirozeného hydratačního faktoru.

 

Nárok 6

6. Způsob aplikace podle nároku 5, kde hmotnostní podíl verbascosidu v topickém produktu je v rozmezí od 0,01 % do 5,0 %.

 

Nárok 7

6. Způsob aplikace podle nároku 5, kde se na jednu aplikaci použije 0,1 až 0,5 g hotového produktu, po kterém následuje jemná masáž po dobu jedné až tří minut pro podporu vstřebávání.

 

Nárok 8

6. Způsob aplikace podle nároku 5, kde topickým produktem je lékařský obvaz, produkt pro opravu po zákroku, produkt pro doplňkovou léčbu atopické dermatitidy, produkt pro péči o pleť specificky určený pro citlivou pokožku nebo produkt pro intenzivní hydrataci a opravu pleti.

 

Nárok 9

6. Způsob aplikace podle nároku 5, kde během aplikace verbascosidu mohou být dodatečně začleněny pomocné látky.

 

Nárok 10

10. Způsob aplikace podle nároku 9, kde pomocná látka je vybrána ze zvlhčovadla, emulgátoru, konzervantu, vůně nebo zklidňujícího činidla a dávková forma kompozice obsahující pomocnou látku je vybrána z lotionu, krému, gelu, séra nebo roztoku masky.

 

Způsob přípravy verbascosidu a způsob jeho aplikace pro podporu tvorby kožních lipidů

 

Technický obor

[0001]Vynález spadá do technické oblasti péče o pleť a topických produktů. Zejména se týká způsobu přípravy verbascosidu a způsobu jeho aplikace pro podporu produkce kožních lipidů.

Konkrétněji se jedná o způsob přípravy verbascosidu, který má vyvolat účinky napříč kompletní reparační sekvencí kožní bariéry při obnově epidermálních buněk → zesílená mezibuněčná těsná spojení → doplnění lipidů a matrice → syntéza kyseliny hyaluronové → hojení ran, pro použití při ochraně kůže.

 

Pozadí umění

[0002]Obnova epidermálních buněk, vylepšená mezibuněčná těsná spojení, doplňování lipidové matrice, syntéza kyseliny hyaluronové a hojení ran hrají nepostradatelnou roli při udržování homeostázy kožní bariéry.

Obnova epidermálních buněk je základem konstrukce bariéry. Urychlením proliferace a diferenciace bazálních keratinocytů zajišťuje, že se dostatečný počet buněk pohybuje nahoru uspořádaným způsobem a dodává adekvátní buněčný materiál pro tvorbu bariéry.

Mezibuněčné spojovací struktury, včetně těsných spojení a desmozomů, ukotvují nově vytvořené buňky dohromady a vytvářejí hustou, souvislou fyzickou bariéru, která účinně odolává vstupu vnějších dráždivých látek.

Lipidová matrice vyplňující prostory mezi buňkami tvoří organizovanou lamelární strukturu a je hlavním prostředkem k utěsnění cest, kterými se ztrácí voda.

Kyselina hyaluronová syntetizovaná v epidermis a dermis tvoří silnou síť zadržující vodu, dodává vlhkost do stratum corneum a udržuje buněčnou homeostázu. Může také poskytovat vhodné vlhké prostředí pro tyto fyziologické procesy a přenášet buněčné signály.

Hojení ran do značné míry závisí na těchto čtyřech procesech. Za prvé, kyselina hyaluronová poskytuje provizorní matrici a signalizační funkce. K pokrytí rány je pak nutná obnova epidermálních buněk. Nově vytvořené buňky musí znovu vytvořit těsná spojení a doplnit lipidovou matrici, aby byla dokončena obnova bariérové ​​funkce.

Těchto pět procesů se spouští postupně během hojení ran. Jejich vzájemně propojené, koordinované působení – od obnovy buněk a strukturálního zpevnění až po vyplnění matrice a skladování vody – společně vedou k plně stabilizované kožní bariéře.

Poskytují nejen fyzickou sílu potřebnou k tomu, aby odolávaly vnějším dráždidlům, ale také schopnost zadržovat vlhkost potřebnou k zabránění vnitřní ztrátě vody, což umožňuje pokožce dlouhodobě udržovat zdraví ve stavu dynamické rovnováhy.

V souladu s tím je vícerozměrná, systematická rekonstrukce zásadnější než pouhé zlepšení povrchové vlhkosti. Může zlepšit odolnost pokožky a zadržování vlhkosti u jejich zdroje, čímž podporuje odolnější a stabilnější zdravý stav.

[0003]Vlastní produkce lipidů a kyseliny hyaluronové v pokožce je zásadní pro udržení zdraví pokožky, odolnost vůči podráždění okolním prostředím a zachování mladistvého stavu.

Zadržováním vlhkosti a obranou proti mikroorganismům a škodlivinám tyto látky pomáhají zajistit normální fyziologickou funkci pokožky.

Ve srovnání se samotnou externí suplementací je podpora vlastní produkce lipidů a kyseliny hyaluronové v pokožce popisována jako zásadnější a trvalejší strategie, která přímo posiluje její „samoopravnou kapacitu“ a „odolnost“.

U kožních onemocnění, jako je atopická dermatitida a ekzém, se uvádí, že posílení produkce lipidů a kyseliny hyaluronové má centrální preventivní a terapeutický význam.

Zdroj vysvětluje, že tyto stavy často zahrnují genetické defekty, které oslabují strukturu "cihel a malty" pokožky, což umožňuje alergenům a dráždivým látkám pronikat snadněji a spouštět trvalý imuno-zánětlivý cyklus.

Proto identifikace aktivních složek, které aktivují klíčové enzymy pro syntézu lipidů, jako jsou FASN a ACC, nebo přímo indukují produkci kyseliny hyaluronové, může proaktivně udržovat a opravovat produkci buněčných lipidů a kyseliny hyaluronové.

Podle zveřejnění může tato strategie zmírnit suchost, svědění a zánětlivé epizody a zároveň snížit vnější spouštěče u jejich zdroje, snížit frekvenci a závažnost recidivy a pomoci posunout management onemocnění z pasivní léčby směrem k aktivní prevenci.

 

[0004]Verbascosid je fenylethanoidní glykosid a jedna z hlavních složek rostlin Orobanchaceae:

Cistanche deserticolaYC Ma;

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight;

Cistanche sinensisKývnutí; a

Cistanche salsa(CA Mey.) Beck.

 

Výzkum ukázal, že verbascosid je silný antioxidant a má farmakologické účinky včetně protizánětlivých, neuroprotektivních, hepatoprotektivních účinků a účinků proti stárnutí.

Během screeningu na činidla chránící kůži z mnoha rostlin vynálezci zjistili, že verbascosid nejen podporuje proliferaci buněk HaCaT a expresi proteinu s těsným spojením, ale také reguluje aktivitu syntázy mastných kyselin, čímž zvyšuje syntézu kožních lipidů.

Aktivuje také dráhy podílející se na produkci kyseliny hyaluronové a následně podporuje hojení ran.

Tyto akce zahrnují kompletní sekvenci údržby a opravy kožní bariéry při obnově epidermálních buněk → vylepšené mezibuněčné spojení → doplnění lipidů a matrice → syntéza kyseliny hyaluronové → hojení ran.

Verbascosid lze proto použít jako vícecílové ochranné a zvlhčující činidlo ve funkčních produktech péče o pleť a topických produktech.

Příklady zahrnují lékařské obvazy a produkty pro opravy po zákroku; doplňkové přípravky pro atopickou dermatitidu nebo ekzém; produkty péče o pleť speciálně určené pro citlivou pleť nebo růžovku; a intenzivní hydratační a opravné produkty pro každodenní použití.

 

Shrnutí vynálezu

[0005]Vynález poskytuje způsob přípravy verbascosidu a způsob jeho aplikace pro podporu produkce kožních lipidů.

Způsob přípravy se týká verbascosidu určeného k podpoře kompletní reparační sekvence kožní bariéry při obnově epidermálních buněk → zesílené mezibuněčné spojení → doplnění lipidů a matrice → syntéza kyseliny hyaluronové → hojení ran.

Řeší technický problém poskytnutí nové základní aktivní složky s více cílovými účinky pro produkty péče o pleť nebo topické produkty.

O verbascosidu je popsáno, že má výhodu v tom, že působí v celém řetězci opravy kožní bariéry, s účinky lepšími než existující jednocílové složky péče o pleť, jako jsou složky, které podporují pouze syntézu kyseliny hyaluronové, podporují pouze buněčnou proliferaci nebo poskytují samotnou hydrataci.

[0006]Aby bylo dosaženo výše uvedených cílů, vynález přijímá následující technické řešení.

[0007]Způsob přípravy verbascosidu zahrnuje následující kroky.

[0008]Vyberte sušené dužnaté stonky rostlin OrobanchaceaeCistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensisneboCistanche salsa.

Po blanšírování, vysušení a rozmělnění materiál extrahujte pod zpětným chladičem 50%–80% vodným roztokem ethanolu dvakrát až čtyřikrát vždy po dobu jedné až tří hodin.

Extrakty se spojí a koncentrují se za sníženého tlaku, dokud nezůstane žádný zápach ethanolu, čímž se získá koncentrovaný roztok.

[0009]Koncentrovaný roztok se nechá projít přes AB-8 kolonu s makroporézní adsorpční pryskyřicí.

Postupně eluujte deionizovanou vodou a 30%–50% vodným roztokem ethanolu k odstranění nečistot, poté 60%–90% vodným roztokem ethanolu k eluci cílových složek.

Eluát se shromáždí a koncentruje se za sníženého tlaku.

Koncentrát se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi chloroform-methanol v objemovém poměru v rozmezí od 5:1 do 2:1 jako eluentu.

Sesbírejte cílové frakce, koncentrujte je za sníženého tlaku a lyofilizujte, abyste získali purifikovaný verbascosid s čistotou alespoň 98 %.

[0010]Volitelně se poměr materiálu k rozpouštědlu během refluxní extrakce pohybuje od 1:10 do 1:20, vyjádřeno v g/ml, a extrakční teplota se pohybuje od 60 stupňů do 80 stupňů.

Poznámka překladatele: Zdroj navíc uvádí, že tento poměr znamená "1 g suroviny se přidá k 1 ml rozpouštědla." Toto tvrzení není v souladu se specifikovaným rozsahem 1:10–1:20, který odpovídá 10–20 ml rozpouštědla na gram suroviny.

[0011]Volitelně se poměr průměru k výšce sloupce s makroporézní adsorpční pryskyřicí AB-8 pohybuje od 1:8 do 1:15, kde poměr je průměr kolony d k výšce sloupce h. Eluční průtok se pohybuje od 1 do 3 BV/h.

[0012]Volitelně podmínky lyofilizace zahrnují teplotu v rozmezí od -40 stupňů do -50 stupňů, tlak ve vakuu v rozmezí od 10 do 30 Pa a dobu sušení v rozmezí od 12 do 24 hodin.

[0013]Způsob aplikace verbascosidu k podpoře produkce kožních lipidů je poskytnut následovně.

[0014]Přidejte verbascosid k topickému základu produktu v předem stanovené hmotnostní frakci a rovnoměrně promíchejte, aby se vytvořil konečný produkt.

Hotový produkt nanášejte na povrch pokožky jednou až dvakrát denně.

Prostřednictvím penetrace působí verbascosid na epidermální HaCaT buňky, aby podpořil buněčnou proliferaci a zpevnil těsná spojení.

Současně upreguluje genovou a proteinovou expresi ACC, FASN a N-SMázy, zvyšuje aktivitu syntázy mastných kyselin, upreguluje HAS2, HAS3 a CD44 a zvyšuje obsah kyseliny hyaluronové.

Pokračujte v používání po dobu jednoho až čtyř týdnů, abyste dosáhli celkového zlepšení kožní bariéry.

[0015]Případně se hmotnostní podíl verbascosidu v topickém produktu pohybuje od 0,01 % do 5,0 %.

[0016]Případně použijte 0,1–0,5 g hotového produktu na jednu aplikaci a po aplikaci jednu až tři minuty jemně masírujte, abyste podpořili vstřebávání.

[0017]Volitelně je topickým produktem lékařský obvaz, produkt na opravu po zákroku, produkt doplňkové léčby atopické dermatitidy, produkt péče o pleť speciálně určený pro citlivou pokožku nebo produkt intenzivní hydratace a opravy pleti.

[0018]Případně mohou být během aplikace verbascosidu přidány také pomocné látky.

[0019]Dále je pomocná látka vybrána ze zvlhčovadla, emulgátoru, konzervačního činidla, vůně nebo zklidňujícího činidla.

Dávková forma kompozice obsahující excipient je vybrána z lotionu, krému, gelu, séra nebo roztoku masky.

 

Příznivé účinky vynálezu

[0020]Prospěšné účinky vynálezu jsou následující.

[0021]Vynález ukazuje, že verbascosid má hlavní aktivity při podpoře produkce kožních lipidů a kyseliny hyaluronové.

Může také podporovat proliferaci kožních buněk, posilovat mezibuněčná těsná spojení a urychlovat hojení ran, čímž vytváří uzavřený mechanismus „podpory buněčné proliferace → stabilizace mezibuněčných spojení → zvýšení produkce lipidů a kyseliny hyaluronové → urychlení opravy a hojení“.

Ve srovnání s dosavadním stavem techniky je vynález popsán tak, že má následující výhody.

[0022]Verbascoside je přírodní účinná látka rostlinného původu s vysokou úrovní bezpečnosti a jasně definovanou farmakologickou aktivitou, která zabraňuje potenciálnímu riziku podráždění kůže spojenému s chemicky syntetizovanými složkami.

Redakční kvalifikace: Toto je bezpečnostní tvrzení zdroje, nikoli závěr stanovený pouze botanickým původem.

[0023]Účinnost přípravy a výtěžek verbascosidu jsou zlepšeny.

[0024]Verbascoside působí na komplexní řadu cílů a současně reguluje několik klíčových procesů, včetně buněčné proliferace, exprese proteinů s pevným spojením, syntézy lipidů, produkce kyseliny hyaluronové a hojení ran.

Tím integrovaným způsobem zlepšuje funkci kožní bariéry s účinky popsanými jako lepší než u jednocílových složek.

[0025]Jeho aplikace jsou široké, včetně lékařských oprav, doplňkové léčby kožních onemocnění, péče o citlivou pokožku a každodenního zvlhčování a opravy, splňující potřeby zdraví pokožky různých populací.

 

Stručný popis výkresů

[0026]Pro jasnější vysvětlení technických řešení provedení vynálezu nebo dosavadního stavu techniky jsou níže stručně uvedeny výkresy potřebné pro popis provedení nebo dosavadního stavu techniky.

Níže popsané výkresy představují pouze určitá provedení vynálezu. Osoba s běžnými znalostmi v oboru z nich může odvodit další kresby bez tvůrčího úsilí.

[0027]Obrázek 1 je schematický vývojový diagram způsobu přípravy podle vynálezu.

[0028]Obrázek 2 uvádí data životaschopnosti buněk HaCaT.

[0029]Obrázek 3 uvádí data aktivity syntázy mastných kyselin.

[0030]Obrázek 4 uvádí údaje o obsahu kyseliny hyaluronové.

[0031]Obrázek 5 uvádí data životaschopnosti HaCaT buněk pro vynález.

[0032]Obrázek 6 uvádí data aktivity syntázy mastných kyselin pro vynález.

[0033]Obrázek 7 znázorňuje expresi genů spojených se syntézou mastných kyselin.

[0034]Obrázek 8 znázorňuje expresi proteinů spojených se syntézou mastných kyselin.

[0035]Obrázek 9 uvádí výsledky Western blotu spojené se syntézou mastných kyselin.

[0036]Obrázek 10 uvádí údaje o obsahu kyseliny hyaluronové.

[0037]Obrázek 11 představuje expresi genů spojených se syntézou kyseliny hyaluronové.

[0038]Obrázek 12 znázorňuje expresi proteinů spojených se syntézou kyseliny hyaluronové.

[0039]Obrázek 13 uvádí výsledky Western blotu spojené s kyselinou hyaluronovou.

[0040]Obrázek 14 znázorňuje úrovně exprese claudinu-1.

[0041]Obrázek 15 znázorňuje úrovně exprese okludinu.

[0042]Obrázek 16 ukazuje míru uzavření rány.

[0043]Obrázek 17 představuje snímky z testu buněčného škrábání.

[0044]Obrázek 18 představuje vyhodnocení zvlhčovacího výkonu různých vzorků.

 

Podrobný popis provedení

[0045]Provedení aplikace jsou podrobně popsána níže s odkazem na doprovodné výkresy.

Příklad 1: Příprava přečištěného verbascosidu

[0046]Příklad 1

[0047]Jak je znázorněno na obrázku 1, tento příklad poskytuje způsob přípravy verbascosidu, zkráceně Ver, zahrnující následující kroky.

[0048]Vyberte sušené dužnaté stonkyCistanche deserticolaneboCistanche tubulosa, oba patřící do čeledi Orobanchaceae.

Materiál nakrájejte, blanšírujte ve vroucí vodě po dobu 10–25 minut a sušte v troubě při teplotě 40–60 stupňů, čímž se obsah verbascosidu zvýší více než čtyřnásobně.

 

 

Poznámka:* vs. prázdná kontrolní skupina, P<0.05P < 0.05P<0.05.

 

Po pulverizaci materiál extrahujte pod zpětným chladičem 50%–80% vodným roztokem ethanolu dvakrát až čtyřikrát vždy po dobu jedné až tří hodin.

Extrakty se spojí a koncentrují se za sníženého tlaku, dokud nezůstane žádný zápach ethanolu, čímž se získá koncentrovaný roztok.

 

[0049]Koncentrovaný roztok se nechá projít přes AB-8 kolonu s makroporézní adsorpční pryskyřicí.

Postupně eluujte deionizovanou vodou a 30%–50% vodným roztokem ethanolu k odstranění nečistot, poté 60%–90% vodným roztokem ethanolu k eluci cílových složek.

Eluát se shromáždí a koncentruje se za sníženého tlaku.

Čistí se sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi chloroform-methanol v objemovém poměru v rozmezí od 5:1 do 2:1 jako eluentu.

Sesbírejte cílové frakce, koncentrujte je za sníženého tlaku a lyofilizujte, abyste získali purifikovaný verbascosid s čistotou alespoň 98 %.

[0050]Konkrétně se poměr materiálu k rozpouštědlu během refluxní extrakce pohybuje od 1:10 do 1:20 a extrakční teplota se pohybuje od 60 stupňů do 80 stupňů.

[0051]Poměr průměru k výšce sloupce s makroporézní adsorpční pryskyřicí AB-8 se pohybuje od 1:8 do 1:15 a eluční průtok se pohybuje od 1 do 3 BV/h.

[0052]Podmínky lyofilizace zahrnují teplotu v rozmezí od -40 stupňů do -50 stupňů, tlak vakua v rozmezí 10 až 30 Pa a dobu sušení v rozmezí 12 až 24 hodin.

 

Tabulka 2. Souhrn bioaktivity různých vzorků

Index	Prázdné ovládání	Pozitivní kontrola	CTE	Ech	Ver
Životaschopnost buněk (%)	100 ± 8.347	/	122.052 ± 8.051*	117.868 ± 7.941*	128.894 ± 9.528*
Aktivita FAS (U/mg prot)	2.712 ± 0.419	18.488 ± 4.56*	2.069 ± 0.27	9.799 ± 1.356*	10.4 ± 0.697*
Obsah HA (ng/ml)	10.908 ± 0.968	19.925 ± 4.306*	21.644 ± 2.037*	13.517 ± 1.653*	18.486 ± 1.341*
Exprese Claudinu-1 (pg/ml)	414.58 ± 25.05	/	505.556 ± 20.518*	478.937 ± 12.419*	554.057 ± 22.106*
Exprese okludinu (pg/ml)	3.287 ± 0.683	/	4.285 ± 0.575	4.666 ± 0.582*	7.258 ± 0.774*
Rychlost hojení ran za 24 hodin (%)	30.581 ± 1.308	70.075 ± 1.781*	40.762 ± 9.68	37.102 ± 7.038	45.173 ± 5.508*
48h rychlost hojení ran (%)	55.458 ± 6.674	87.545 ± 3.155*	76.47 ± 2.684*	67.883 ± 5.678*	76.704 ± 4.8*

Poznámka:* vs. prázdná kontrolní skupina, P<0.05P < 0.05P<0.05.

 

Příklad 2: Příprava polysacharidového extraktu Cistanche

[0053]Příklad 2

[0054]Cistanche se extrahuje dvakrát pod zpětným chladičem 20násobným a 15násobným množstvím vody po dobu tří hodin, respektive dvou hodin.

Filtrujte, spojte filtráty a koncentrujte při 80 až 90 stupních.

Přidejte 215 ml 95% ethanolu pro dosažení konečné koncentrace ethanolu 80% a nechte přes noc při 4 stupních.

Sraženina se shromáždí buď filtrací, ponecháním filtračního koláče, nebo centrifugací při 4000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut.

Sraženina se třikrát promyje absolutním ethanolem a suší se při 50 stupních, aby se získal polysacharidový extrakt Cistanche, označený POL.

 

Příklad 3: Příprava fenylethanoidového glykosidového extraktu

[0055]Příklad 3

[0056]Cistanche se extrahuje dvakrát pod zpětným chladičem 20násobným a 15násobným množstvím vody po dobu tří hodin, respektive dvou hodin.

Filtrujte, spojte filtráty a koncentrujte při 80 až 90 stupních.

Přidejte 215 ml 95% ethanolu pro dosažení konečné koncentrace ethanolu 80% a nechte přes noc při 4 stupních.

Filtrát se shromáždí filtrací nebo supernatant odstředěním při 4000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut.

Zakoncentrujte a vysušte, abyste získali fenylethanoidový glykosidový extrakt Cistanche, označený POLS.

Testování ukázalo obsah echinakosidu 21,8 % a obsah verbascosidu 1,2 %.

 

Příklad 4: Příprava extraktu RE1

[0057]Příklad 4.

[0058]NamočitCistanche deserticolav šestinásobném množství 52% ethanolu při pokojové teplotě po dobu 10 dnů.

Přefiltrujte a uchovejte rostlinné zbytky.

Po vysušení se zbytek jednou extrahuje pod zpětným chladičem šestinásobným množstvím 95% ethanolu po dobu dvou hodin.

Filtrujte, spojte filtráty, koncentrujte při 60 stupních a vysušte, abyste získali extrakt fenylethanoidových glykosidů Cistanche a jejich derivátů, označených RE1.

Extrakt obsahuje složky včetně echinakosidu, verbascosidu, isoverbaskosidu a 2'-acetylverbaskosidu.

 

Příklad 5: Příprava extraktu RE2

[0059]Příklad 5.

[0060]VýpisCistanche tubulosadvakrát 75% ethanolem pokaždé po dobu jedné hodiny.

Filtrujte a uschovejte zbytek.

Po vysušení se zbytek jednou extrahuje pod zpětným chladičem šestinásobným množstvím 95% ethanolu po dobu dvou hodin.

Filtrujte, spojte filtráty, koncentrujte při 60 stupních a vysušte, abyste získali extrakt fenylethanoidových glykosidů Cistanche a jejich derivátů, označených RE2.

Extrakt obsahuje složky včetně echinakosidu, verbascosidu, isoverbaskosidu a 2'-acetylverbaskosidu.

 

Příklad 6: Příprava celkového fenylethanoidového glykosidového extraktu

[0061]Příklad 6.

[0062]Nakrájejte Cistanche a extrahujte dvakrát 75% roztokem ethanolu pokaždé po dobu 1,5 hodiny.

Extrakty se spojí, koncentrují se a suší se, aby se získal fenylethanoidový glykosidový extrakt Cistanche, označený CTE.

Testování ukázalo obsah echinacosidu 22,6 % a obsah verbascosidu 4,5 %.

 

Příklad 7: Způsob aplikace

[0063]Příklad 7.

[0064]Na základě příkladu 1 tento příklad poskytuje aplikační metodu, jejímž prostřednictvím verbascosid uplatňuje účinky napříč kompletní reparační sekvencí kožní bariéry obnovy epidermálních buněk → vylepšená mezibuněčná spojení → doplnění lipidů a matrice → syntéza kyseliny hyaluronové → hojení ran.

Konkrétní způsob aplikace je následující.

[0065]Přidejte verbascosid k topickému základu produktu v předem stanovené hmotnostní frakci a rovnoměrně promíchejte, aby se vytvořil konečný produkt.

Hotový produkt nanášejte na povrch pokožky jednou až dvakrát denně.

Prostřednictvím penetrace působí verbascosid na epidermální HaCaT buňky, aby podpořil buněčnou proliferaci a zpevnil těsná spojení.

Současně upreguluje genovou a proteinovou expresi ACC, FASN a N-SMázy, zvyšuje aktivitu syntázy mastných kyselin, upreguluje HAS2, HAS3 a CD44 a zvyšuje obsah kyseliny hyaluronové.

Pokračujte v používání po dobu jednoho až čtyř týdnů, abyste dosáhli celkového zlepšení kožní bariéry.

[0066]Konkrétně se hmotnostní podíl verbascosidu v topickém produktu pohybuje od 0,01 % do 5,0 %.

[0067]Použijte 0,1–0,5 g hotového produktu na jednu aplikaci a po aplikaci jednu až tři minuty jemně masírujte, abyste podpořili vstřebávání.

[0068]Lokálním produktem je lékařský obvaz, produkt na opravu po zákroku, produkt doplňkové léčby atopické dermatitidy, produkt péče o pleť speciálně určený pro citlivou pokožku nebo produkt intenzivní hydratační a regenerační péče o pleť.

[0069]Během aplikace verbascosidu mohou být také přidány pomocné látky.

Dále je pomocná látka vybrána ze zvlhčovadla, emulgátoru, konzervačního činidla, vůně nebo zklidňujícího činidla.

Dávková forma kompozice obsahující excipient je vybrána z lotionu, krému, gelu, séra nebo roztoku masky.

 

Příklad 8: Experimentální materiály a vybavení

[0070]Příklad 8.

[0071]Na základě příkladů 1 a 7 jsou experimentální materiály použité ve vynálezu následující.

[0072]Experimentální buňky byly imortalizované lidské epidermální HaCaT buňky zakoupené od Shanghai Yaji Biotechnology.

Buňky byly kultivovány v DMEM s vysokým obsahem glukózy doplněném 10% fetálním bovinním sérem a 1% penicilin-streptomycinem při 37 stupních v atmosféře obsahující 5% oxidu uhličitého při nasycené vlhkosti.

[0073]Experimentální materiály byly:

Echinacoside, zkráceně Ech, z Národního institutu pro kontrolu potravin a léčiv, Čína.

Fetální hovězí sérum, FBS, od EXCELL.

DMEM s vysokým obsahem glukózy od Gibco.

0,25% trypsin-EDTA od Gibco.

Fosfátem pufrovaný solný prášek od Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology.

CCK-8 Souprava pro stanovení buněčné proliferace/cytotoxicity od TransGen Biotech.

Human Occludin, OCLN, ELISA Kit od Wuhan CUSABIO.

Human Claudin-1, CLDN1, ELISA Kit od Wuhan CUSABIO.

Fatty Acid Synthase, FAS, Activity Assay Kit od Solarbio.

Human Hyaluronic Acid ELISA Kit od Wuhan CUSABIO.

Recombinant Human EGF Protein, bez nosiče, od R&D Systems.

DEPC od společnosti Amresco.

M5 HiClear DL2000 DNA Marker od Mei5 Biotechnology.

TRIzol Reagent od Ambion.

5X All-In-One RT MasterMix od abm.

EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix–Low ROX od abm.

Easy II Protein Quantitative Kit, BCA, od TransGen Biotech.

RIPA lyzační pufr od Boster.

Inhibitor proteázy od Boster.

Kozí anti-králičí IgG H&L, HRP, od Abcam.

Kozí anti-myší IgG H&L, HRP, od Abcam.

Předbarvený proteinový marker od Solarbio.

-Merkaptoetanol od Amresco.

PVDF přenosová membrána, 0,45 μm, od Millipore.

Glycin od Sangon Biotech.

Glycerol od Sangon Biotech.

SuperSignal West Pico PLUS od Thermo Fisher.

Protilátka pro kontrolu zátěže beta-aktinu, myší monoklonální, od Sino Biological.

ACC1 protilátka od Affinity.

Protilátka FASN od společnosti Affinity.

Protilátka SMPD2 od společnosti Affinity.

Protilátka hyaluronan syntáza 2, HAS2, od Affinity.

Protilátka HAS3 od společnosti Affinity.

Protilátka CD44 od společnosti Affinity.

[0074]Experimentální zařízení obsahovalo:

Inkubátor pro buněčnou kulturu oxidu uhličitého SmartCell HF-90, Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd. [上海力康仪器有限公司].

Biologická bezpečnostní skříň HF1200LC od stejného výrobce.

DK-80 stolní nízkorychlostní odstředivka, Shanghai Feige Instrument Co., Ltd.

Vysokorychlostní chlazená odstředivka Heraeus Multifuge X1R, Thermo Fisher Scientific.

Mikrotitrační spektrofotometr xMark, Bio-Rad.

GL-88B vírový mixér, Haimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.

Gelový zobrazovací systém Model 2500, Shanghai Tianneng.

Přístroj MyCycler Thermal Cycler PCR, Bio-Rad.

7500 Fast Real-Time PCR přístroj, ABI.

Chemiluminiscenční zobrazovací systém Chemiscope 3000, Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd.

Mini-PROTEAN Zařízení pro přenos proteinů systému Tetra, Bio-Rad.

DYCZ-24DN elektroforézní přístroj, Beijing Liuyi.

Poznámka překladatele: Výše ​​uvedený popis výrobce a přístroje se řídí dodaným zdrojem; katalogové údaje nebyly nezávisle ověřeny.

 

 

 

Příklad 9: Experimentální metody

[0075]Příklad 9.

[0076]Na základě příkladů 1 až 8 byly experimentální metody použité ve vynálezu následující.

CCK-8 Test buněčné proliferace

[0077]Připravte jednobuněčnou suspenzi HaCaT buněk v kompletním kultivačním médiu v hustotě 5x1045 x 10^45x104 buněk/ml.

Nasaďte buňky do 96jamkové destičky v množství 100 μl na jamku.

Poté, co se buňky nechají přilnout po dobu 24 hodin při 37 stupních pod 5% oxidem uhličitým, kultivační médium zlikvidujte a podejte různé testované látky. Zahrňte prázdnou kontrolní skupinu s n=5n=5n=5.

Po 48 hodinách působení médium zlikvidujte a do každé jamky přidejte 100 μl čerstvě připraveného 10% roztoku CCK-8.

Pokračujte v inkubaci v inkubátoru pro buněčnou kulturu po dobu jedné hodiny, poté změřte optickou hustotu při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček.

Test aktivity syntázy mastných kyselin

[0078]Připravte jednobuněčnou suspenzi HaCaT buněk v kompletním kultivačním médiu o hustotě 5x1045 x 10^45x104 buněk/ml a nasaďte buňky do kultivačních baněk.

Poté, co se buňky nechají přilnout po dobu 24 hodin při 37 stupních pod 5% oxidem uhličitým, kultivační médium zlikvidujte a podejte různé testované látky.

Zahrňte slepou kontrolní skupinu a pozitivní kontrolní skupinu ošetřenou rekombinantním lidským epidermálním růstovým faktorem, rhEGF, v koncentraci 20 ng/ml, s n=3n=3n=3.

Po 48 hodinách působení odeberte buňky a změřte aktivitu syntázy mastných kyselin podle instrukcí testovací soupravy.

Test obsahu kyseliny hyaluronové

[0079]Připravte jednobuněčnou suspenzi HaCaT buněk v kompletním kultivačním médiu o hustotě 5x1045 x 10^45x104 buněk/ml a nasaďte buňky do kultivačních baněk.

Poté, co se buňky nechají přilnout po dobu 24 hodin při 37 stupních pod 5% oxidem uhličitým, kultivační médium zlikvidujte a podejte různé testované látky.

Zahrňte prázdnou kontrolní skupinu a pozitivní kontrolní skupinu léčenou rhEGF v dávce 20 ng/ml, s n=3n=3n=3.

Po 48 hodinách působení odeberte supernatanty buněčné kultury a změřte obsah kyseliny hyaluronové podle instrukcí testovací soupravy.

Kvantitativní reverzní transkripční PCR

[0080]Připravte jednobuněčnou suspenzi HaCaT buněk v kompletním kultivačním médiu o hustotě 5 x 1045 x 10^45 x 104 buněk/ml a nasaďte buňky do šestijamkových destiček.

Poté, co se buňky nechají přilnout po dobu 24 hodin při 37 stupních pod 5% oxidem uhličitým, kultivační médium zlikvidujte a podejte různé testované látky.

Zahrňte prázdnou kontrolní skupinu a pozitivní kontrolní skupinu léčenou rhEGF v dávce 20 ng/ml, s n=3n=3n=3.

Po 48 hodinách působení zlikvidujte supernatant a do každé jamky přidejte 1 ml TRIzolu, aby se buňky oddělily a lyžovaly a zajistilo se, že činidlo pokryje buněčnou vrstvu.

Opakovaně protřepávejte kultivační nádobu, dokud se buňky neuvolní, a přeneste materiál do 1,5ml mikrocentrifugační zkumavky.

Extrahujte celkovou RNA a použijte qRT-PCR ke stanovení exprese ACC, FASN, N-SMázy, HAS2, HAS3 a CD44.

Western blotting

[0081]Připravte jednobuněčnou suspenzi HaCaT buněk v kompletním kultivačním médiu o hustotě 5x1045 x 10^45x104 buněk/ml a nasaďte buňky do kultivačních baněk.

Poté, co se buňky nechají přilnout po dobu 24 hodin při 37 stupních pod 5% oxidem uhličitým, kultivační médium zlikvidujte a podejte různé testované látky.

Zahrňte prázdnou kontrolní skupinu a pozitivní kontrolní skupinu léčenou rhEGF v dávce 20 ng/ml, s n=3n=3n=3.

Po 48 hodinách působení odeberte buňky.

Extrahujte celkový protein a použijte Western blotting ke stanovení exprese ACC, FASN, N-SMázy, HAS2, HAS3 a CD44.

Hodnocení exprese proteinu v těsném spojení

[0082]Připravte jednobuněčnou suspenzi HaCaT buněk v kompletním kultivačním médiu o hustotě 5x1045 x 10^45x104 buněk/ml a nasaďte buňky do kultivačních baněk.

Poté, co se buňky nechají přilnout po dobu 24 hodin při 37 stupních pod 5% oxidem uhličitým, kultivační médium zlikvidujte a podejte různé testované látky.

Zahrnout prázdnou kontrolní skupinu s n=3n ​​= 3n=3.

Po 48 hodinách působení odeberte buněčné lyzáty a změřte okludin a claudin-1 pomocí ELISA podle pokynů k soupravě.

Cell Scratch Assay

[0083]Připravte jednobuněčnou suspenzi HaCaT buněk v kompletním kultivačním médiu v hustotě 5x1055 x 10^55x105 buněk/ml.

Nasaďte 500 μl na jamku do 24jamkové destičky.

Po připojení buněk aplikujte ošetření, rozdělte buňky do slepé kontrolní skupiny, pozitivní kontrolní skupiny ošetřené fetálním bovinním sérem a skupiny s testovanou látkou.

Ošetřujte 48 hodin.

Po ošetření jemně vytvořte rovný škrábanec pomocí špičky pipety.

Vyměňte médium za médium bez séra ve všech skupinách kromě pozitivní kontrolní skupiny.

Poškrábaná místa vyfotografujte po 0, 24 a 48 hodinách.

Použijte ImageJ k výpočtu škrábací oblasti a posouzení kapacity buněčné migrace.

 

Příklad 10: Hodnocení retence vlhkosti

[0084]Příklad 10.

[0085]K vyhodnocení hydratačního účinku sér obsahujících Ver, Ech nebo glycerin byla použita gravimetrická metoda in vitro.

Zvažte specifikovaná množství předem upraveného Vzorku 1, obsahujícího 2 % Ver; Vzorek 2, obsahující 2 % Ech; a pozitivní kontrola obsahující 5 % glycerinu.

Vzorky skladujte v komoře s konstantní teplotou a konstantní vlhkostí při 25 stupních a 50% relativní vlhkosti.

Zvažte vzorky v různých časových bodech a vykreslete křivky retence vlhkosti.

[0086]Míra zadržování vlhkosti se vypočítá takto:

Míra zadržování vlhkosti (%)=M2−M0M1−M0×100%\\text{Míra zadržování vlhkosti (\\%)}=\\frac{M_2-M_0}{M_1-M_0}\\times100\\%Míra zadržování vlhkosti (%)=M1​−M0​M2​−M0​​×100 %

[0087]Kde:

[0088]M0M_0M0​ je hmotnost prázdné desky v gramech.

[0089]M1M_1M1​ je hmotnost skleněné desky po přidání vzorku v gramech.

[0090]M2M_2M2​ je hmotnost po několikahodinovém skladování v exsikátoru, v gramech.

Poznámka překladatele: Odstavec [0085] popisuje skladování v komoře s řízenou teplotou a řízenou vlhkostí, zatímco [0090] odkazuje na exsikátor. Oba popisy jsou zachovány ze zdroje.

 

Experimentální výsledky

[0091]Experimentální výsledky tohoto příkladu jsou následující.

Účinky na buněčnou proliferaci HaCaT

[0092]Jak je znázorněno na obrázku 2, různé extrakty Cistanche měly různé účinky na životaschopnost buněk HaCaT.

Ver a POL významně zvýšily životaschopnost buněk, přičemž P<0.05P < 0.05P<0.05, and Ver produced the highest viability.

Účinky na aktivitu syntázy mastných kyselin

[0093]Jak je znázorněno na obrázku 3, mezibuněčné lipidy ve stratum corneum jsou základní „maltovou“ složkou struktury „cihel a malty“ kůže.

Ceramidy, cholesterol a volné mastné kyseliny tvoří hustou lamelární dvouvrstvou strukturu ve specifických poměrech.

Udržování normální syntézy lipidů může posílit tuto strukturu, zabránit ztrátě vody, odolávat vnějšímu poškození, udržovat rovnováhu kožního mikrobiomu a podporovat samoopravu.

Může tak řešit suchost, citlivost a sníženou obranyschopnost pokožky u jejich zdroje.

[0094]Syntáza mastných kyselin je popsána jako hlavní enzym omezující rychlost a centrální zásobovací motor regulující syntézu kožních lipidů.

Jeho hlavní funkcí je katalyzovat syntézu kyseliny palmitové, C16:0, z acetyl-CoA a malonyl-CoA. Kyselina palmitová je popsána jako hlavní endogenní nasycená mastná kyselina s dlouhým řetězcem v kůži.

Kyselina palmitová má dvě funkce.

Za prvé, jako základní strukturální stavební blok se přímo používá při syntéze lipidů bariéry stratum-corneum, včetně ceramidů a volných mastných kyselin, které poskytují materiálový základ pro tvorbu lamelární dvojvrstvy.

Za druhé, jako důležitý prekurzor a signální molekula může být dále zpracována downstream elongázami, jako je ELOVL1, na mastné kyseliny s velmi dlouhým řetězcem. Tyto výrazné mastné kyseliny jsou nutné pro integritu bariéry.

Aktivita syntázy mastných kyselin tedy přímo určuje přísun surovin dostupných pro vlastní produkci bariérových lipidů kůží.

Upregulace jeho funkce je počátečním a kritickým krokem při podpoře syntézy epidermálních lipidů, a tím k opravě a posílení fyzické kožní bariéry, což v konečném důsledku podporuje zadržování vlhkosti a obranyschopnost.

[0095]Data ukázala, že pozitivní kontrola rhEGF a Ver významně zvýšily aktivitu syntázy mastných kyselin, přičemž P<0.05P < 0.05P<0.05.

POL, POLS, RE1 a RE2 nezvýšily aktivitu syntázy mastných kyselin.

Although RE2 increased fatty acid synthase activity, the difference was not statistically significant, with P>0.05P > 0.05P>0.05.

Poznámka překladatele: Zdroj nejprve zahrnuje RE2 mezi materiály, které nezvýšily aktivitu, pak hlásí nevýznamný nárůst pro RE2. Tato nekonzistence je zachována.

 

Účinky na obsah kyseliny hyaluronové

[0096]Jak je znázorněno na obrázku 4, kyselina hyaluronová je přirozeně se vyskytující polysacharid v kůži se silnou schopností vázat vodu, popsanou ve zdroji jako přítomný hlavně v dermis a stratum corneum.

Zvýšení obsahu kyseliny hyaluronové může udržet vlhkost na hlubších úrovních, udržovat zdravou dermální strukturu, poskytovat antioxidační a protizánětlivé účinky, podporovat hojení a hojení ran a zlepšit funkci stratum-corneum.

Tyto účinky jsou popsány jako způsobující hydrataci, plnost a odolnost zevnitř.

[0097]Data ukázala, že pozitivní kontrola rhEGF, Ver a RE2 významně zvýšila obsah kyseliny hyaluronové, přičemž P<0.05P < 0.05P<0.05.

POL, POLS a RE1 nezvyšovaly obsah kyseliny hyaluronové.

 

Porovnání tříd extraktů a čištěného verbascosidu

[0098]Cistanche obsahuje především fenylethanoidní glykosidy a polysacharidy.

Aktivity polysacharidového extraktu, POL; fenylethanoidové glykosidové extrakty, POLS, RE1 a RE2; a verbascoside, Ver, byly proto porovnány.

Výsledky na obrázcích 2–4 ukazují, že extrakty fenylethanoidových glykosidů Cistanche připravené různými metodami a jednotlivé sloučeniny vykazovaly různé aktivity při podpoře proliferace buněk HaCaT, zvýšení aktivity syntázy mastných kyselin a zvýšení obsahu kyseliny hyaluronové.

Pouze Ver vykazoval aktivitu ve všech třech oblastech, jak je shrnuto v tabulce 1.

[0099]–[0101] Tato čísla odstavců a obsah tabulky 1 nebyly v dodaném zdroji přítomny. Chybějící materiál není možný překlad ani rekonstrukce.

Tabulka 1. Souhrn bioaktivity různých vzorků

Index	Prázdné ovládání	Pozitivní kontrola	POL	POL	RE1	RE2	Ver
Životaschopnost buněk (%)	100 ± 7.008	/	119.008 ± 7.379*	105.312 ± 6.494	85.851 ± 8.381	95.234 ± 10.065	128.894 ± 9.528*
Aktivita FAS (U/mg prot)	2.712 ± 0.419	18.488 ± 4.56*	3.786 ± 1.715	2.399 ± 0.717	2.145 ± 0.889	9.34 ± 10.756	10.63 ± 2.228*
Obsah HA (ng/ml)	10.908 ± 0.968	19.925 ± 4.306*	6.881 ± 2.411	6.321 ± 1.021	6.53 ± 1.342	16 ± 2.531*	17.86 ± 3.27*

 

Další srovnání CTE, Echinacoside a Verbascoside

[0102]Jak je znázorněno na obrázku 5, hlavní fenylethanoidní glykosidy v Cistanche zahrnují echinakosid a verbascosid.

Účinky celkového fenylethanoidového glykosidového extraktu Cistanche, CTE, obsahujícího 22,6 % echinakosidu a 4,5 % verbascosidu; echinakosid, Ech; a verbascoside, Ver, na proliferaci HaCaT buněk byly proto dále porovnávány.

[0103]Data ukázala, že CTE, Ech a Ver všechny podporovaly proliferaci HaCaT buněk.

CTE a Ver produkovaly nejsilnější účinky, což naznačuje ochranné účinky na kožní buňky.

Další účinky na aktivitu syntázy mastných kyselin

[0104]Jak je znázorněno na obrázku 6, účinky na aktivitu syntázy mastných kyselin byly následující.

[0105]Data ukázala, že pozitivní kontrola rhEGF, Ech a Ver významně zvýšila aktivitu syntázy mastných kyselin, přičemž P<0.05P < 0.05P<0.05.

CTE nezvýšil aktivitu syntázy mastných kyselin.

 

Exprese genů a proteinů spojených se syntézou mastných kyselin

[0106]Obrázky 7–9 ukazují účinky na expresi genů a proteinů spojených se syntézou mastných kyselin.

[0107]ACC a FASN jsou popsány jako enzym omezující rychlost a hlavní motor lipidového anabolismu.

Společně katalyzují tvorbu mastných kyselin s dlouhým řetězcem, včetně kyseliny palmitové, které poskytují základní suroviny pro syntézu klíčových bariérových lipidů, jako jsou ceramidy.

N-SMáza je klíčovým iniciátorem rozkladu lipidů a stresové signalizace s dvojí rolí.

Aktivuje se během poranění a hydrolyzuje sfingomyelin za vzniku signálních ceramidů, spouští zánět a apoptózu a potlačuje normální syntézu lipidů.

V normálních buňkách má však regulační roli v metabolismu lipidů.

[0108]Jak je znázorněno na obrázcích 7–9, výsledky qPCR a Western blot ukázaly, že Ver, stejně jako rhEGF, významně upreguloval genovou a proteinovou expresi ACC, FASN a N-SMázy s P<0.05P < 0.05P<0.05, and the effects were comparable.

Výsledky ukazují, že Ver upreguluje ACC a FASN, aby reguloval syntézu buněčných lipidů pro stavbu membrány, ukládání energie nebo sekreci.

Současně může upregulace N-SMázy aktivovat sfingolipidový metabolický cyklus.

Produkované ceramidy nejsou pouze stresovými signály. Za normálních fyziologických podmínek jsou také důležitými prekurzory pro syntézu dalších komplexních sfingolipidů, jako jsou glykosfingolipidy, nebo pro dynamickou remodelaci membrány.

Koordinovaná upregulace těchto tří genů a proteinů tedy zvyšuje celkovou buněčnou anabolickou aktivitu a kapacitu membránové remodelace.

 

Další účinky na obsah kyseliny hyaluronové

[0109]Jak je znázorněno na obrázku 10, data naznačují, že rhEGF, CTE, Ech a Ver všechny významně zvýšily obsah kyseliny hyaluronové, přičemž P<0.05P < 0.05P<0.05.

Pořadí účinku bylo CTE, následované Ver, následované Ech.

 

Exprese genů a proteinů spojených se syntézou kyseliny hyaluronové

[0110]Jak je znázorněno na obrázcích 11–13, HAS2, HAS3 a CD44 tvoří zpětnovazební smyčku „syntéza – snímání – odezva“ v metabolismu kyseliny hyaluronové v buňkách HaCaT.

HAS2 a HAS3 jsou hlavní enzymy katalytické syntézy.

HAS2 produkuje především vysokomolekulární kyselinu hyaluronovou a je spojena s udržováním homeostázy pokožky a protizánětlivými účinky.

HAS3 má tendenci produkovat kyselinu hyaluronovou s nižší molekulovou hmotností a přímo se účastní procesů včetně migrace a proliferace buněk.

CD44 je hlavní buněčný povrchový receptor pro kyselinu hyaluronovou.

Nejenže zprostředkovává intracelulární a extracelulární přenos signálu zahrnující kyselinu hyaluronovou, ale také dynamicky reguluje kyselinu hyaluronovou prostřednictvím endocytózy a recyklace a následně reguluje expresi a aktivitu HAS2 a HAS3.

[0111]Jak je znázorněno na obrázcích 11–13, výsledky qPCR a Western blot ukázaly, že Ver, stejně jako rhEGF, významně upreguloval genovou a proteinovou expresi HAS2, HAS3 a CD44 s P<0.05P < 0.05P<0.05.

Regulační účinky Ver na genovou expresi HAS2, HAS3 a CD44 byly větší než účinky rhEGF.

Výsledky naznačují, že Ver reguluje HAS2, HAS3 a CD44, aby řídil kompletní proces „syntéza-sestavení-přenos signálu“ kyseliny hyaluronové, což přispívá k hydrataci, opravě a bariérové ​​funkci epidermis.

Účinky na expresi proteinů v těsném spojení

[0112]Udržování produkce kožních lipidů a kyseliny hyaluronové je popisováno jako poskytování základní, synergické podpory a stabilizace proteinů těsného spojení mezi HaCaT buňkami.

Adekvátní lipidy umožňují keratinocytům tvořit kompletní, organizované mezibuněčné lipidové dvojvrstvy.

Tyto struktury jsou popsány nejen jako fyzický rámec bariéry, ale také jako stabilní, hydrofobní strukturní prostředí pro sestavení a ukotvení proteinů s pevným spojením.

Příznivý stav hydratace udržovaný kyselinou hyaluronovou zároveň pomáhá zajistit normální metabolismus a signalizaci keratinocytů.

Prostřednictvím drah zahrnujících receptory, jako je CD44, kyselina hyaluronová také nepřímo reguluje expresi a distribuci proteinu s pevným spojením.

Lipidy a kyselina hyaluronová společně poskytují fyzikální a biochemické základy potřebné pro tvorbu a udržování těsných spojení z příslušných perspektiv strukturální stability a mikroenvironmentální homeostázy.

Posilují tak fyzické mezibuněčné spoje a celkovou integritu bariéry.

[0113]Předchozí výsledky ukázaly, že Ver vykazoval nejsilnější aktivitu při podpoře produkce kožních lipidů a kyseliny hyaluronové.

Další zkoumání jeho účinků na mezibuněčná těsná spojení ukázala, že všechny CTE, Ech a Ver významně podporovaly expresi proteinu těsných spojení claudin-1 s P<0.05P < 0.05P<0.05, as shown in Figure 14.

Jak je znázorněno na obrázku 15, pouze Ech a Ver významně podporovaly expresi okludinu.

Účinek Ver byl významně větší než účinek Ech, přičemž P<0.05P < 0.05P<0.05.

To bylo v souladu s nejsilnější aktivitou připisovanou Ver při podpoře produkce kožních lipidů a kyseliny hyaluronové.

 

Účinky na hojení ran

[0114]Jak je znázorněno na obrázcích 16–17, HAS3 se přímo účastní procesů včetně migrace a proliferace buněk.

CD44 přenáší informace z kyseliny hyaluronové do buněk a v konečném důsledku reguluje buněčnou migraci, proliferaci a hydrataci, přičemž hraje ústřední roli při hojení ran, zvlhčování kůže a homeostáze bariéry.

Předchozí experimenty ukázaly, že verbascosid významně podporoval expresi HAS3 a CD44.

Jeho schopnost podporovat hojení ran byla proto dále zkoumána.

[0115]Jak je znázorněno na obrázcích 16–17, výsledky ukázaly, že CTE, Ech a Ver všechny podporovaly hojení ran.

Avšak pouze Ver vykazoval významný podpůrný účinek po 24 hodinách.

Vykazoval nejsilnější aktivitu podporující hojení ran, což je v souladu s jeho významnou podporou exprese genu HAS3 a proteinu.

Redakční kvalifikace: Experimentální metoda dodávaná pro tento výsledek je test škrábání buněk. „Hojení ran“ je terminologie použitá ve zdroji a neměla by zde být interpretována jako prokázaný klinický výsledek.

 

Účinnost formulací zadržující vlhkost

[0116]Jak je znázorněno na obrázku 18, schopnost vzorku zadržovat vlhkost byla vyhodnocena z trendů v křivkách zadržování vlhkosti, aby se vyhodnotila hydratační účinnost pro pokožku.

Data ukázala, že křivka retence vlhkosti u vzorku 1 byla vyšší než u vzorku 2 a pozitivní kontroly.

Za podmínek 25 stupňů a 50% relativní vlhkosti měl vzorek 1 lepší zvlhčující výkon než vzorek 2 a kontrola s 5% glycerinem, což ukazuje na nejsilnější zvlhčující výkon.

Vzorek 1 obsahoval Ver a vzorek 2 obsahoval Ech.

Podle zdroje tyto výsledky naznačují, že když je Ver začleněn do produktů, má lepší homogenitu a zvlhčující aktivitu než Ech, jak je shrnuto v tabulce 2.

[0117]Tabulka 2. Souhrn činností různých vzorků.

Obsah tabulky nebyl součástí dodaného zdroje.

[0118]Poznámka: [Symbol významnosti nebyl v dodaném textu reprodukován.] Ve srovnání s prázdnou kontrolní skupinou P<0.05P < 0.05P<0.05.

 

Celkový výklad uvedený ve zveřejnění

[0119]Předchozí výsledky naznačují, že verbascosid vykazuje výjimečnou hydratační aktivitu tím, že přesně aktivuje kompletní mechanismus opravy kožní bariéry s uzavřenou smyčkou.

Nejprve působí na bazální vrstvu, aby výrazně urychlil obnovu epidermálních buněk a řádnou diferenciaci, čímž poskytuje dostatečné buněčné stavební bloky pro stavbu bariéry.

Poté podporuje posílení těsných spojení a desmosomálních struktur mezi keratinocyty, posiluje fyzické ukotvení mezi buňkami a zvyšuje hustotu bariéry a mechanickou pevnost.

Zároveň účinně aktivuje klíčové enzymy metabolismu lipidů a doplňuje mezibuněčnou lipidovou matrici, vyplňuje „maltové“ prostory mezi „cihlami“, aby se zabránilo ztrátě vody.

A konečně, upregulací exprese syntázy kyseliny hyaluronové současně zvyšuje obsah kyseliny hyaluronové v dermis a epidermis, zachycuje a zadržuje podstatné množství vody.

To tvoří kompletní funkční smyčku zahrnující obnovu u zdroje, strukturální zpevnění, doplňování matrice a akumulaci vody.

Může tak dosáhnout sekvence s uzavřenou smyčkou „podpora buněčné proliferace → posílení fyzických mezibuněčných spojení → podpora produkce lipidů a kyseliny hyaluronové → podpora hojení ran“.

Zdroj dochází k závěru, že má lepší aplikační účinky než echinacosid od Cistanche a běžně používaný zvlhčující glycerin a může být použit jako prostředek na ochranu pokožky ve funkčních produktech péče o pleť a topických produktech.

[0120]Předchozí popisy jsou pouze konkrétními provedeními vynálezu.

Rozsah ochrany vynálezu není omezen na tato provedení.

Jakékoli změny nebo náhrady, které by si odborník v oboru mohl snadno představit v rámci technického rozsahu popsaného ve vynálezu, spadají do rozsahu ochrany vynálezu.

V souladu s tím bude rozsah ochrany vynálezu určen nároky.