Analýza absorbovaných složek v potkaní plazmě po perorálním podání kvazi estrogenové frakce Cistanche

Analýza absorbovaných složek v potkaní plazmě po perorálním podání kvazi estrogenové frakce Cistanche

Další informace: Ali.ma@wecistanche.com

Kliknutím zobrazíte výhody a vedlejší účinky

Abstraktní:

Analyzovat a identifikovat složky v potkaní plazmě po perorálním podání aktivní frakcecistanchebyly složky v krysí plazmě detekovány vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií-ionizace elektrosprejem-kvadrupólová-čas letu-hmotnostní spektrometrie (HPLC-Q-TOF MS). Struktury složek byly objasněny porovnáním jejich retenčních časů a MS/MS spekter s referenčními sloučeninami a údaji uvedenými v literatuře. Je identifikováno 13 chemických složení, včetně 6 prototypových složek, jako je kyselina geniposidová, salidrosid,Cistanoside A, Echinacoside, Acteoside, Cistanoside D,7 složek metabolitů, jako jsou 3,4-dihydroxyfenylethanolglykosidy, methylační akteosid, acetylace cistanosid G,3,4-dihydroxyfenylethanol, acetyltubulosid B, glukuronidový metabolit a metylace cistanosidu B-3,4 Dihydroxyfenylethanol. Výsledky mohou poskytnout zásadní údaje pro objasnění terapeutického základu kvazi estrogenové regulační aktivitycistanche．

klíčová slova:

cistanche; léčivo obsahující sérum; kvazi estrogen; vysokoúčinná kapalinová chromatografie-ionizace elektrosprejem-kvadrupólová doba letu-hmotnostní spektrometrie (HPLC-Q-TOFMS)

Cistanche deserticolaje parazitická rostlina v kořenech pouštních stromů (jako je haloxylon ammodendron, tamarix atd.). Jako druh vyživující a silné vzácné čínské tradiční medicíny má řadu farmakologických účinků, jako je vyživující ledvinový jang, regulující imunitu, zpomalující stárnutí, protizáření a ochranu centrálního nervového systému. Je známý jako "pouštní ženšen". V současné době většina studií o aktivitě c. deserticola doma i v zahraničí se omezují na hodnocení farmakologické aktivity, přičemž není objasněn základ jeho farmakodynamických látek, což vážně brání racionálnímu vývoji a aplikaciCistanche deserticola.

Složky tradiční čínské medicíny jsou komplexní a rozmanité a teprve po správném podání prostřednictvím vstřebávání a metabolismu v těle mohou složky konečně vstoupit do krve, aby byly farmakodynamickým látkovým základem tradiční čínské medicíny. Tyto účinné látky mohou být prototypem nebo metabolitem TRADIČNÍ čínské medicíny, nebo se může jednat o nové složky vzniklé vzájemnou reakcí různých složek v tradiční čínské medicíně, nebo se může jednat o endogenní fyziologické účinné látky produkované přímým působením léků. na těle. Proto mohou tyto krevní složky představovat farmakodynamický látkový základ tradiční čínské medicíny a kombinované medicíny. Analýza složek a metabolitů, které se mohou po perorálním podání dostat do krve, a hledání interakčních pravidel složek může poskytnout určitý základ pro základní výzkum farmakodynamických látek.

Ke screeningu estrogenu podobných aktivních částí a dávkování cistanche deserticola byla použita metoda přírůstku hmotnosti dělohy myší a kolorimetrie MTT. Předběžné experimentální výsledky ukázaly, že děložní koeficient nezralých myší byl významně zvýšen intragastrickým podáváním ethanolového (95%) extraktu z cistanche deserticola v dávce 30 g/kg za den a sérum obsahující léčivo podporovalo proliferaci McF-7 buněk významně (P < 0,01),="" což="" byla="" aktivní="" část="" estrogenu="" podobného="" účinku="" cistanche="">

V této studii byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie-kvadrupólová hmotnostní spektrometrie s časem letu (HPLC-Q-TOF MS) k analýze a identifikaci krevních složek, prototypových složek a metabolitů aktivních částí cistanche po podání cistanche s estrogenem a spekulovat o metabolické dráze, aby se poskytl základ pro základní výzkum farmakodynamických látek cistanche s estrogenem.

1 Experimentální část

1.1 Nástroje a činidla

Waters-600 Kapalinový chromatograf: Waters Co., LTD., vybavený čtyřprvkovým gradientovým čerpadlem, automatickým vzorkovačem, vakuovým odplyňovacím zařízením, teplotním boxem kolony, detektorem DAD, chemickou pracovní stanicí Empower;

Hmotnostní spektrometr Q-TOF LC-MS řady Agilent: produkty společnosti American Agilent;

Xw-80vírový mixér: Shanghai Yugong Machinery Co., LTD.

Dk-80 Elektrická termostatická vodní lázeň: Shanghai Yiheng Technology Co., LTD.

Alc-110. 4 Analytické váhy: Shanghai Renhe Scientific Instrument Co., LTD.

Ultrazvukový oscilátor H66MC: Ohaus Technology Co., LTD.

Cistanche deserticola: koupeno na trhu s léčivými bylinami San Ke Shu, identifikované jako Cistanche deserticola profesorem Zhangem Delianem z Harbin Commercial University.;

Mullein (šarže č. 111530-200505), echinosid (šarže č. 111670-200503), salidrosid (šarže č. 110736-200628): vše poskytuje Čínský národní institut pro kontrolu farmaceutických a biologických produktů ;

Ethylenstilbestrol: Guangzhou Hampden Pharmaceutical Co., LTD. Methanol a acetonitril: čistota pro HPLC, produkty Shandong Yuwang Reagent Co., LTD. Ostatní činidla byla analyticky čistá.

Experimentální voda: čistá voda.

Samice potkanů ​​Wistar: Číslo šarže SCXK-(JI) 2003 -- 2004, hmotnost (220 ± 20) g, poskytnuto experimentálním zvířecím centrem Changchun National Biological Industry Base.

1.2 Příprava intragastrického roztoku léčiva

Surový prášek cistanche deserticola byl extrahován refluxní extrakcí 95% ethanolem a poté postupně extrahován 8krát rozpouštědlem po dobu 150 minut, 6krát rozpouštědlem po dobu 75 minut a 6krát rozpouštědlem po dobu 75 minut. Poté byly tyto tři extrakty spojeny a kondenzovány pod tlakem, čímž byl získán extrakt, který byl uložen v chladničce pro pozdější použití. Před použitím byla k přípravě intragastrického roztoku o koncentraci 1,5 g/ml použita destilovaná voda.

1.3 Příprava referenčního roztoku

Přesné množství divizna, salidrosidu a echinakosidu bylo odebráno a zcela rozpuštěno v methanolu za účelem přípravy 1 ml směsného kontrastního roztoku, z nichž každý obsahoval 0,2 mg tří referenčních látek. Roztok referenční látky proveďte přes filtrační membránu 0 0,45 μm a odložte stranou.

1.4 Příprava medikovaného séra a slepého séra

Příprava séra obsahujícího léčivo: zvažte samice potkanů ​​Wistar, podávejte jim 1 ml/100 g denně, podávejte jim destilovanou vodu a žaludeční roztok dvakrát ráno a večer po dobu 3 po sobě jdoucích dnů, 60 minut po poslední dávce, anestetizovat 2 ml/kg 10% chloralhydrátu intraperitoneální injekcí. Krev byla odebrána z jaterní portální žíly a centrifugována při 3 000 r/min po dobu 10 minut po úplné koagulaci. Supernatantem pak bylo sérum obsahující léčivo.

Příprava slepého séra: krysy byly intragastricky podávány stejným objemem destilované vody každý den a další způsoby přípravy byly stejné jako u séra obsahujícího léčivo.

odebralo se ml séra obsahujícího léčivo, přidalo se 5násobné množství methanolu a v centrifugační zkumavce se vířilo 10 min. Centrifugace byla prováděna při 14 000 r/min po dobu 10 min a supernatant byl absorbován a rozpouštědlo bylo vysušeno. K rozpuštění zbytku bylo přidáno 0,5 ml methanolu pomocí mikropipety. Zbytek byl filtrován přes 0,22 um mikroporézní membránu a analyzován chromatografií.

1.5 Experimentální podmínky

Chromatografické podmínky: Kolona Waters Symmetry ShieldTM RP18 (4,6 mm x 25 0 mm x 5 μm); Před sloupec: Nova - PakC18 Guard - PakTM; průtok: 0,5 ml/min; Objem nástřiku: 10 μL; Mobilní fáze: acetonitril{11}},2% vodný roztok kyseliny mravenčí; Podmínky gradientu: 0-35 min, 5 procent -34 procent acetonitrilu, 35-65 min, 24 procent -26 procent acetonitrilu; Teplota kolony: 30 stupňů; Detekční vlnová délka: 254 nm.

Podmíněný iontový zdroj hmotnostní spektrometrie: zdroj ionizace elektrosprejem za atmosférického tlaku (ESI); Průtok: {{0}},5 ml/min; tlak rozprašovacího plynu: 0.2 MPa; Průtok suchého plynu: 8. 0 l/min; Teplota sucha: 30 stupňů; Kapilární napětí: 3,5 kV; Průtok plynného pláště: 12,0 l/min; Teplota pochvy: 400 stupňů. Je vybrán režim skenování pozitivních a negativních iontů a rozsah hromadného skenování je m/z 100 ~ 3 000.

2 Výsledky a diskuse

2.1 HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS analýza chemických složek v séru estrogenně aktivních částí Cistanche deserticola

Kvalitativní analýza byla provedena na vzorcích séra s obsahem léčiva od potkanů ​​v estrogen-aktivní části Cistanche deserticola pomocí ESI-MS detektoru. Pro skenování byl použit pozitivní iontový mód a negativní iontový mód a výsledky jsou uvedeny na obrázku 1. Porovnáním diagramů toku celkových iontů první úrovně hmotnostní spektrometrie dvou režimů skenování na obrázku 1 bylo zjištěno, že celkový iont tok získaný v režimu negativních iontů měl silné charakteristiky a vysokou citlivost, takže v tomto experimentu bylo zvoleno skenování v režimu negativních iontů.

V režimu negativních iontů byl esI-MS detektor použit k provedení kvalitativní analýzy krysího séra po podání estrogenně aktivní části Cistanche deserticola. Prostřednictvím komparativní analýzy první úrovně skenovacího diagramu celkového iontového toku slepého séra a podávaného séra bylo označeno celkem 13 píků molekulárních iontů, jak je znázorněno na obrázku 2. Píky 2, 3, 5, 7, 9 a 10 byly považovány za byly prototypové složky a píky 1, 4, 6, 8, 11, 12 a 13 byly považovány za metabolické složky.

Podle píku molekulárních iontů detekovaných každým chromatografickým píkem v režimu negativních iontů a relativní molekulové hmotnosti dané odpovídajícím charakteristickým fragmentem bylo označeno celkem 13 ms píku. Chemické složky 13 píku byly identifikovány porovnáním informací UV-MS každé standardní látky a odkazem na složky uvedené v literatuře, které jsou uvedeny v tabulce 1.

Šest prototypových složek byly geniposid, salidrosid, Cistanche glykosid a, Echinacea glykosid, Mullein glykosid a Cistanche glykosid D;

Sedm metabolických složek bylo 3,4-dihydroxyfenylethanolglykosid, methylovaný glykosid Mullein, acetylovaný glykosid Cistanche g, 3,4-dihydroxyfenylethanol, acetyltubulosid B, metabolit kyseliny glukuronové Cistanche glykosid B a methylovaný{{ 4}},4-dihydroxyfenylethanol. Mezi sedmi metabolity se spekuluje, že vrchol 1 (3,4-dihydroxyfenylethanol), vrchol 8 (3,4-dihydroxyfenylethanol) a vrchol 13 (methylovaný 3,4-dihydroxyfenylethanolglykosid) jsou hydrolytické fragmenty fenylethanolových glykosidů v Cistanche deserticola; Vrchol 4 (methylovaný mulleinový glykosid) je metabolitem mulleinového glykosidu; Vrchol 6 (acetylovaný glykosid Cistanche g) je metabolitem glykosidu Cistanche G; Vrchol 11 (acetyl guanosin b) je metabolit guanosinu B; Vrchol 12 (metabolit kyseliny glukonové glykosidu b Cistanche) je metabolit glykosidu B Cistanche.

Čínské znaky rozšiřují vysvětlení:

质谱信息 představuje informace o hmotnostním spektru.

相对分子质量 představuje relativní molekulovou hmotnost

化合物推测结果 představuje výsledky složených spekulací

代谢 představuje metabolické složky

原型 představuje prototypové komponenty

2.2 Diskuse

V tomto experimentu byla použita hplc-q-tof MS k identifikaci 13 hlavních chromatografických píku v séru po podání estrogenu podobné aktivní části Cistanche deserticola. Mohou to být přímo působící látky Cistanche deserticola in vivo. Zároveň také odráží, že účinnost tradiční čínské medicíny je výsledkem vícesložkové koordinace, komplementarity nebo omezení. Analýzou 13 přechodných složek v krvi bylo prokázáno, že hlavní aktivní složkou Cistanche deserticola jsou fenylethanolglykosidy. V následné studii bude stanoven odpovídající vztah spektrálního účinku ke studiu korelace účinku léčiva, aby se dále objasnil materiální základ účinku léčiva a stanovil se vztah mezi dávkou, časem a účinkem vícesložkových látek v různé době. body v těle, aby se odhalila metabolická dráha a metabolický režim Cistanche deserticola.

3 Závěry

V tomto experimentu byla použita technologie hplc-esi-q-tof MS/MS k analýze krevních složek estrogenu podobných aktivních částí Cistanche deserticola a bylo identifikováno 13 chemických složek, což má velký význam pro objasnění farmakodynamického materiálového základu. estrogenu podobných aktivních složek Cistanche deserticola a může také poskytnout spolehlivý základ pro další výzkum a klinickou léčbu Cistanche deserticola.