Jak studovat genetickou diverzitu Herba Cistanches?

Studie o genetické diverzitě Herba Cistanches od RAPD

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Institut Chinese Materia Medica, Čínská akademie čínské medicíny, Peking 100700)

Abstraktní

Účel:Ke studiu populacegenetická rozmanitostzCistanche deserticolaaCistanche tubulosa.

Metody:Dvě divoké populaceCistanche deserticolaa čtyři divoké populaceCistanche tubulosabyly analyzovány pomocí RAPD agenetická rozmanitostpopulací bylo analyzováno softwarem verze 1.31 POPGENE.

Výsledek:Průměrné procento polymorfních lokusůCistanche deserticolabyla 47,37 procenta, polymorfní lokusy těchto dvou populací byly 39,47 procenta a 35,53 procenta a průměrná genová diverzita Nei byla 0.135 8. Shannonova byla víc. Index stavových informací je 0.207 2 a koeficient genové diferenciace Gst {{1{{20}}}}.254 6. Průměrné procento polymorfních lokusů v Cistanche bylo 27,59 procenta a procento polymorfních lokusů v každé populaci se pohybovalo od 19,54 procenta do 25,29 procenta, z čehož populace Andierů měla nejvyšší 25,29 procenta a průměrná Neiova genová diverzita byla 0. { {21}}, Shannonův informační index polymorfismu je 0,1258, koeficient genové diferenciace Gst =0.175 5.

Závěr:Cistanche deserticolaaCistanche tubulosamají mezi populacemi určitou diferenciaci. Thegenetická rozmanitostDesert Cistanche je výrazně vyšší než u Cistanche tubulosa a rozlišuje se do dvou ekotypů.

Klíčová slova: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; genetická rozmanitost

[Klasifikační číslo čínské knihovny] S 567 [Identifikační kód dokumentu] A [Číslo článku] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche je parazitická rostlina patřící do rodu Cistanche z čeledi Lidanaceae, známá také jako Dayun, což je vzácný čínský léčivý materiál. Hlavní zdrojové rostliny Cistanche deserticola v mé zemi jsouCistanche deserticolaYCMa a C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Hostitelskými rostlinami Cistanche deserticola jsou Haloxylon ammodendron a Haloxylon ammodendron, které jsou distribuovány hlavně v Alashan League ve Vnitřním Mongolsku, severním Sin-ťiangu, Qinghai, Gansu a na dalších místech. Rozšíření Cistanche deserticola je stejné jako u hostitelských rostlin. V mé zemi je Cistanche cistanche distribuována pouze v okresech kolem pouště Taklimakan jižně od pohoří Tianshan v Xinjiang a její distribuce není zcela synchronizována s hostitelem Tamarix. Jiné oblasti, jako je severní Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Vnitřní Mongolsko, Shaanxi a další místa rostlin Tamarix nejsou parazitickými Cistanche Tubula[2]. Vzhledem k rychlému nárůstu poptávky po cistanche v posledních letech, což má za následek zánik jejích zdrojů, se zdroje divoké cistanche zmenšily pouze na několik hlavních produkčních oblastí. Oba byly v mé zemi uvedeny jako ohrožené chráněné druhy rostlin [3], mezi nimiž jeCistanche deserticolabyl zařazen do přílohy CITES II [4].

Po několika letech výzkumu byl výzkum umělého odchovu cistanche úspěšný a je ve fázi rozsáhlé propagace a výsadby. Jak však zabránit úbytku druhů Cistanche během průmyslové výroby, jak co nejdříve obnovit omezenou divokou populaci a zachovat vzácné divoké zdroje zárodečné plazmy, to jsou klíče k dosažení jejího udržitelného využití. Pokud jde o chráněné dědictví Cistanche [Datum přijetí], 2004-03-11 [Projekt fondu] Projekt sociální péče Ministerstva vědy a technologie (2001.109); Projekt Ministerstva vědy a technologie „Desátý pětiletý plán“ (2001BA701A09a) [Odpovídající autor] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Studium přenosu stále probíhá prázdný. Tato studie využívá technologii RAPD ke studiu 2 divokých populacíCistanche deserticolaa 4 divoké populaceCistanche tubulosa, a analyzovat oba Rozdíl vgenetická rozmanitostOčekává se, že poskytne důležitý experimentální genetický základ pro ochranu Cistanche, vzácné čínské medicíny.

cistanche

1. Materiál a metody

1.1 Materiály

Cistanche deserticolabyl shromážděn z okresu Jimsar v Xinjiang a oblasti Jilantai ze starověké ligy Alxa ve Vnitřním Mongolsku. Populace Cistanche byly shromážděny z okresu Minfeng a okresu Yutian, Xinjiang. Okres Minfeng je v současnosti oblastí s největším výnosem cistanche cistanche, s nejvyšší hustotou a relativně úplnými společenstvy přirozených lesů. Místa odběru vzorků Andil, Sawuzek, Yatongguz a Daheyan z okresu Yutian jsou hlavní produkční oblasti, které se nacházejí v řece Andir, řece Yeyike, řece Yatongguzi a Kelaniya Na dolním toku řeky je vzdálenost mezi populacemi větší než 50 km. Každá populace náhodně vybrala 19-30 jedinců. Vzorky byly rychle vysušeny na silikagelu a použity pro extrakci DNA (tabulka 1).

Tabulka 1 Vzorkovací populace a produkční oblasti Cistanche deserticola a Cistanche tubulosa

1.2 Extrakce DNA

Metoda celkové extrakce DNA využívá metodu s vysokým obsahem soli a nízkým pH [5]. Vzorek DNA byl podroben spektrofotometru pro detekci koncentrace templátu DNA, poté byla pro analýzu RAPD použita elektroforéza na 1% agarózovém gelu, barvení EB, pozorování a fotografování pod ultrafialovým světlem, elektroforéza DNA s čirými pásy a menší tailing.

1.3 Screening primerů RAPD

Protože experiment zjistil, že stejný primer má neuspokojivý účinek na současnou amplifikaci obouCistanche deserticolaa Cistanche tubulosa byly primery testovány nezávisle. Pro amplifikaci a screening bylo použito 150 náhodných primerů (10 bp), 25 ul reakčního systému Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. každý primer použil 2 populační templáty a 1 sterilizovanou dvakrát destilovanou vodu jako slepou kontrolu a získal 10 primerů pro amplifikaci Cistanche deserticola s jasnými pásy, silným polymorfismem a dobrou opakovatelností: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 primerůCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 PCR amplifikace a detekce produktu

Vybrané primery byly použity k amplifikaci templátové DNACistanche deserticolaaCistanche tubulosapomocí PCR. Genomová DNA byla naředěna na 50 ng·μL -1 podle naměřené koncentrace jako templátu. Celkový reakční objem je 25 μl, z toho 10 × PCR Buffer 2,5 μL, Mg2 plus 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, směs dNTP (každý 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, templátová DNA 1 μL, sterilizovaná dvakrát destilovaná voda 18,8 μL, výše uvedený amplifikační roztok PCR je produktem Shanghai Sangon. Amplifikace byla provedena na PTC-100 tepelném cykléru. Amplifikační program byl 94 stupňů předdenaturace po dobu 5 minut a poté 40 cyklů. Každý cyklus zahrnoval 94 stupňů 45 s, 34 stupňů 1 min, 72 stupňů 1 min 30 s a nakonec Extend při 72 stupních po dobu 5 minut. Amplifikované produkty byly podrobeny elektroforéze na 2,0% agarózovém gelu (obsahujícím EB) v 1 x TAE pufru a pozorovány a fotografovány pomocí zobrazovacího systému gelu SYNGENE.

1.5 Statistika a analýza dat

Ve spektru elektroforézy se porovnává odpovídající poloha reakčního produktu na gelu podle standardu molekulové hmotnosti a odhaduje se molekulová hmotnost amplifikovaného produktu. Pás s pásem je zaznamenán jako 1 a pás bez pásma je zaznamenán jako 0, čímž se vytvoří maticový graf 0/1 a vloží se do počítače pomocí POPGENE32 k výpočtu procenta polymorfních míst (PPL) každé populace, Neiův index genové diverzity (H), Shannonův informační index polymorfismu (I), koeficient genové diferenciace (Gst), genová diverzita (Ht),Genetická rozmanitost(Hs), Neiova (1978) genetická identita (I) a genetická vzdálenost (D) v rámci populace a shluková analýza byla provedena pomocí metody UPGMA.

2. Výsledky a analýza

2.1 Genetická diverzita Cistanche

Všechny vzorky získaly pásy s molekulovou hmotností v rozmezí od 200 do 2 200 bp (obrázek 1, 2). Celkem bylo detekováno 76 lokusů v 60 vzorcích ze 2 populacíCistanche deserticola, z nichž 36 bylo polymorfních lokusů, což představuje 47,37 procenta, H=0.135 8, I=0.207 2. Mezi nimi je Jimsarův PPL 39,47 procenta a Gilantyho 35,53 procenta. H je 0. 0 95 3 a 0.1 070 a I je 0.15 12 a 0.163 7, v tomto pořadí. Celkem 87 lokusů bylo detekováno u {{20}} jedinců ze 4 populací Cistanche, z nichž 24 bylo polymorfních lokusů, což představuje 27,59 procenta , H=0.084 8, Já=0.1278. Nejvyšší PPL byl Andil s 25,29 procenta, zatímco PPL byl nižší v Savuzek a Yatungusi (oba 19,54 procenta). H je 0.062 1 -0.080 0, I je 0.095 0 -0.116. Velikost H a I je v souladu s trendem velikosti PPL každé populace a koeficienty jsou největší v Andierovi, následovaném Dayanem. V případě stejného PPL je Savuzekovo H=0.{40}} Součet I=0.097 0 je mírně vyšší než 0.{{44 }} a 0.{46}} Yatunguska (tabulka 2).

Obrázek 1 RAPD zesílené pásy některých vzorků pouštěCistanche deserticola, primer S490 1-10. Garantie vzorky; 11-20. Jimpster vzorky M-DNA Marker (200 - 2 000 bp)

Obrázek 2 RAPD amplifikované pásy některých vzorků Cistanche Tubulosa, primer S2 042 1-20. Xinjiang Andier ukázkový M-DNA marker (200 - 2 000 bp)

Tabulka 2genetická rozmanitostzCistanche deserticolaaCistanche tubulosapopulace

2.2 Analýza genetických variací Cistanche

Podle úrovněgenetická rozmanitostv populacích (Hs), diferenciaci mezi populacemi (Dst) a podílu genetických rozdílů mezi populacemi na celkových genetických rozdílech (Gst), lze vidět, že celková genetická diverzita Cistanche deserticola Ht=0.{{{{101} 1}}, kde Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, z toho Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabulka 3). Výše uvedené výsledky naznačují, že mezi populacemi existuje určitý stupeň genetických variací. Variace mezi pouštními populacemi Cistanche deserticola představovala 25,46 procenta z celkové variace a variace populací Cistanche tubulosa představovala 17,55 procenta z celkové variace.

Tabulka 3 Analýza genetických variacíCistanche deserticolaaCistanche tubulosa.

2.3 Genetická vzdálenost a shluková analýza mezi populacemi Cistanche deserticola

Genetická vzdálenost dvou populacíCistanche deserticolaje {{0}}.080 0 a genetická identita je 0.9231. Genetická vzdálenost čtyř populací Cistanche byla 0.012 0-0.031 5 a genetická identita byla 0.9690-0.988 1 (Tabulka 4) . Shlukování jedinců Cistanche deserticola a cistanche tubulosa ukazuje, že Cistanche deserticola lze seskupit do dvou odlišných skupin podle populace, zatímco různé jedince cistanche tubulosa nelze seskupit podle populace, což také naznačuje, že genetická diferenciace mezi Cistanche deserticola populace je poměrně vysoká. Velká, ale genetická diferenciace mezi populacemi Cistanche tubulosa je malá.

Tabulka 4 Genetická identita (vlevo dole) a genetická vzdálenost (vpravo nahoře).cistanche tubulosa.

3. Diskuse

3.1 Genetická diverzita Cistanche

Úroveňgenetická rozmanitostrostlin je neoddělitelná od jejich biologických vlastností, stanovišť, původu a evoluce. Mezi nimi má největší vliv systém šlechtění, rozsah rozšíření, forma života a metody šíření pylu a semen [6]. Podle statistických výsledků alozymových dat 499 rostlinných druhů ve 165 rodech od Ge Song et al. [7], polymorfismus Cistanche na úrovni druhu by měl být asi 50 procent a polymorfismus na úrovni populace by měl být asi 40 procent. Kolem 0,17. Úrovně polymorfismu získané v tomto experimentu jsou všechny nižší než tyto průměrné hodnoty. Současně ve srovnání s úrovněmi polymorfních lokusů získaných metodami RAPD pro několik běžných ohrožených rostlin, jako je 32 procent ohrožených druhů jedle stříbrná[18], 22,5 procenta zakrslé pivoňky a 27,6 procenta pivoňky nachové. [9] ] Je vidět, že genetická rozmanitostCistanche deserticola je mírně nižší než průměrná úroveň, zatímco genetická diverzita Cistanche tubulosa je již extrémně nízká.

3.2 Důvody nízké genetické diverzity Cistanche

Cistanche je specifická parazitická rostlina, rozšířená zároveň v úzkých pouštních oblastech. Jedinečný životní styl a relativně úzká obytná plocha proto může být neodmyslitelným důvodem, pročgenetická rozmanitostCistanche je obecně nižší než u běžných rostlin.

Rozdíl vgenetická rozmanitostmezi Cistanche deserticola a Cistanche tubulosa může souviset s rozdílem v distribučním rozsahu těchto dvou a s tím, zda jsou synchronizovány s distribucí hostitele. Oblast rozšíření Cistanche tubulosa je výrazně menší než oblast Cistanche deserticola a její rozšíření je extrémně nesynchronizované s hostitelskou rostlinou. Studie prokázaly, že mezi druhy Tamarix je velká rozmanitost. Například Zhang Juan et al. uvedli, že genetická diverzita Tamarix sibiricus byla až 98,7 procenta [10], zatímco genetická diverzita Cistanche je extrémně špatná, což ukazuje na dlouhodobý vývoj. Cistanche tubulosa mohla mít v historii vážné překážky, které vedly ke ztrátě velkého množstvígenetická rozmanitost.

Zároveň bylo podle šetření zjištěno, že žádný zCistanche deserticolado 20 km od lidských sídel mohla být objevena a normálně kvést. Velké a malé jámy Cistanche byly vyhloubeny, zejména v hlavních produkčních oblastech květiny Cistanche. Proto to bylo způsobeno velkým množstvím výkopů. Nedostatek původu a ničení stanovišť mohou být hlavními lidmi způsobenými důvody nízkého stavugenetická rozmanitostz Cistanche.

3.3 Genetická diferenciace Cistanche

Vzhledem ke geografické vzdálenosti mezi Xinjiangem a Vnitřním Mongolskem způsobila geografická izolace diferenciaci a izolaci meziCistanche deserticolapopulací a tyto dvě populace vytvořily různé geneticky odlišné ekotypy v důsledku jejich přizpůsobení místním podmínkám stanoviště. Vzhledem k úzkému rozsahu distribuce a častým výměnám genů mezi populacemi je genetická diferenciace mezi populacemi menší než u Cistanche deserticola.

3.4 Doporučení pro ochranu Cistanche

Genetická rozmanitostje předpokladem pro dlouhodobé přežití druhů, aby nedošlo k vyhynutí. Sníženígenetická rozmanitostsníží schopnost populací adaptovat se na změny prostředí v krátkodobém i dlouhodobém horizontu [11]. Proto je ochrana genetické rozmanitosti Cistanche velmi důležitá pro ochranu této vzácné a vzácné čínské medicíny. Vzhledem k tomu, že Cistanche je druh se zvláštním ekologickým typem, měl by být chráněn především in situ a podle jeho genetické rozmanitosti by měla být vytvořena přirozená základna ochrany Cistanche. Například proCistanche tubulosaVzhledem k tomu, že genetická diverzita pochází hlavně zevnitř populace, budou prioritními objekty ochrany populace s velkou genetickou diverzitou [12], jako je Minfengův Angier a Yutianův Daheyan. Je uveden jako přirozená základna ochrany pro Cistanche. jako proCistanche deserticola, populace Vnitřního Mongolska a Sin-ťiangu prošly významnými změnami, takže experimentální výzkum by měl být dále posílen, aby bylo možné určit populace, které mají prioritu ochrany. Zároveň provést základní výzkum reprodukční biologie a opylovací ekologie Cistanche, aby poskytl informace pro její další ochranu.

Reference

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei a kol. IdentifikaceCistanchea zkoumání komerčních léčivých materiálů. Chinese Medicinal Materials, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mingting. Komplexní výzkum a obecná aplikace rostlin Tamarix. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.

[3] Fu Guoli. Červená kniha čínských rostlin. Peking: Science Press, 1992.

[4] Řídící úřad pro dovoz a vývoz ohrožených druhů v Čínské lidové republice, Vědecký výbor pro ohrožené druhy v Čínské lidové republice. Úmluva o mezinárodním obchodu s ohroženými druhy volně žijících živočichů a planě rostoucích rostlin (CITES), příloha II. 2003,41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding a kol. Extrakce a identifikace celkové DNA několika ohrožených rostlin a jejich příbuzných. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Systém šlechtění rostlin, genetická struktura a ochranagenetická rozmanitost. Biodiverzita, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Evoluční biologie rostlin. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming a kol. RAPD analýza genetické diverzity jedle bělokoré. Čínská věda (C), 1997, 40 (2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen a kol. Předběžná zpráva o RAPD analýze zakrslé pivoňky a nachové pivoňky. Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Předběžná studie naGenetická rozmanitostpřirozených populací Tamarix kopinaté. Yunnan Botanical Research, 2003, 25 (5): 557.

[11] Ellstrand NC, Elam D R. Důsledky populační genetiky malé velikosti populace: Důsledky pro ochranu rostlin. Výroční revue Ekologie a systematika, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Princip populační genetiky a jeho aplikace při ochraně vzácných a ohrožených rostlin. Biodiverzita, 1999, 7 (4): 340.

Z: China Journal of Chinese Materia Medica; sv. 29, vydání 8. srpna 2004