Cirkulární RNA CircDVL1 inhibuje progresi karcinomu ledvinových buněk přes osu MiR-412-3p/PCDH7

Abstraktní

Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) je primární rakovina ledvin s vysoce agresivním fenotypem a extrémně špatnou prognózou. Hromadné důkazy naznačují, že cirkulární RNA (circRNA) hrají klíčovou roli ve výskytu a rozvoji různých lidských rakovin. Exprese, klinický význam a regulační role circRNA v ccRCC však zůstávají do značné míry nejasné. Zde uvádíme, že circDVL1 je snížen v séru a tkáních pacientů s ccRCC a negativně koreluje s maligními rysy ccRCC. Nadměrná exprese circDVL1 inhibuje proliferaci, indukuje zástavu G1/S, spouští apoptózu a snižuje migraci a invazi v různých buňkách ccRCC in vitro. V souladu s tím nadměrná exprese circDVL1 potlačuje tumorigenicitu ccRCC v modelu myšího xenoimplantátu. Mechanicky circDVL1 slouží jako houba pro onkogenní miR-412-3p, čímž brání miR-412-3p-zprostředkované represi svého cílového protokadherinu 7 (PCDH7) v buňkách ccRCC. Souhrnně naše výsledky ukazují, že circDVL1 vykonává tumor-supresivní funkci během progrese ccRCC prostřednictvím osy circDVL1/miR-412-3p/PCDH7, a naznačují, že circDVL1 by mohl být novým diagnostickým a prognostickým markerem a terapeutickým cílem pro ccRCC.

Klíčová slova

circDVL1; renální buněčný karcinom; miR-412-3p; PCDH7; biomarker

Kliknutím sem zobrazíte výhody Cistanche

Úvod

Renální buněčný karcinom (RCC) je extrémně letální maligní karcinom urologického systému a závažně ovlivňuje lidské zdraví [1]. Incidence RCC se v posledních desetiletích zvýšila, v roce 2020 bylo ve Spojených státech diagnostikováno 73 750 nových případů [2, 3]. Clear cell RCC (ccRCC), nejběžnější a nejagresivnější podtyp RCC, představuje 70–75 procent případů RCC [4]. Důležité je, že více než 30 procent pacientů s ccRCC je při počáteční diagnóze spojeno s metastázami. Kromě toho, ačkoli je radikální operace hlavní léčebnou možností primárního ccRCC, stále asi 40 procent pacientů zaznamenalo relaps a metastázy s 5-ročním celkovým přežitím nižším než 10 procent [5, 6]. Tato dilemata podtrhují naléhavou potřebu prozkoumat molekulární mechanismy, které jsou základem vývoje ccRCC, a to jak jako diagnostických a prognostických biomarkerů, tak jako potenciálních terapeutických cílů.

Cirkulární RNA (circRNA) jsou nekódující RNA s jednořetězcovými strukturami s uzavřenou smyčkou, které je činí vysoce stabilními [7, 8]. Nedávné studie prokázaly, že circRNA jsou hojné v krvi [9, 10], slinách [11] a exozomech [12], což naznačuje, že by mohly sloužit jako nové diagnostické biomarkery [13]. Vzhledem k tomu, že tekutá biopsie je méně invazivní než tradiční tkáňová biopsie [14], byly circRNA považovány za cenné prediktivní nástroje pro přesnou medicínu [15-17]. Konkrétně několik circRNA, jako je cricNOX4, circEGLN3 a circPRRC2A, může působit jako potenciální biomarkery pro diagnostiku a/nebo prognózu RCC, které byly shrnuty v našem nedávném přehledu [18]. Současný výzkum se navíc zaměřuje především na střídání exprese circRNA v tkáních ccRCC [19, 20], nicméně jejich hladiny v tekuté biopsii zůstávají do značné míry neznámé, což brání zkoumání potenciálních biomarkerů. Kromě toho, ačkoli se ukázalo, že několik circRNA, včetně circHIAT1 [21], circ-AKT3 [22] a cRAPGEF5 [23], hraje důležitou roli v iniciaci a progresi ccRCC [18], systematické zkoumání circRNA zapojených do ccRCC vývoj, stejně jako jejich základní molekulární mechanismy, stále chybí.

Zde jsme nejprve stanovili expresi circRNA ve vzorcích séra od pacientů s ccRCC a zdravých kontrol pomocí mikročipu circRNA. Významně jsme identifikovali novou ccRCC asociovanou circRNA circDVL1 (ID jatečně upraveného těla: hsa_circ_ 0009267), která je kódována v genu DVL1. CircDVL1 je významně snížen v séru pacientů s ccRCC a jeho exprese nepřímo koreluje s ccRCC Fuhrmanovým hodnocením, což naznačuje potenciál jako biomarker. Kromě toho je CircDVL1 snížen v nádorových tkáních ccRCC. V souladu s tím může circDVL1 inhibovat proliferaci, indukovat zastavení buněčného cyklu, spouštět apoptózu a snižovat migraci a invazi buněk ccRCC. Mechanicky circDVL1 funguje jako miR-412-3p houba k upregulaci exprese PCDH7. Souhrnně tato zjištění identifikují circDVL1 jako nádorový supresor pro ccRCC a naznačují jeho potenciál jako diagnostického biomarkeru i terapeutického cíle.

Doplněk Cistanche

Materiály a metody

1. Klinické vzorky

Tato studie byla schválena etickou komisí První přidružené nemocnice univerzity Zhejiang (2021-104). Od pacientů s ccRCC bylo odebráno 18 shodných vzorků ccRCC a přilehlých nenádorových tkání. Vzorky byly po operaci rychle konzervovány v kapalném dusíku a poté skladovány při -80 stupních až do dalšího použití. Byly odebrány vzorky séra od 60 pacientů s ccRCC a 66 zdravých kontrol. Poté byly vzorky zpracovány pomocí vhodných metod a získané sérum bylo skladováno při -80 stupni až do dalšího použití.

2. Buněčné linie a buněčné kultury

Všechny buněčné linie byly zakoupeny od National Collection of Authenticated Cell Cultures (Čína). Buňky 786-O a Caki-1 byly kultivovány v RPMI 1640 (HyClone), buňky ACHN byly kultivovány v MEM (HyClone) a buňky 293T byly kultivovány v médiu DMEM (Gibco). Všechna buněčná kultivační média byla doplněna 10 procenty fetálního bovinního séra (Gibco) a 1 procentem směsi penicilinu a streptomycinu (Gibco). Buněčné kultury byly udržovány ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních a 5 procentech CO₂.

3. CircRNA microarray analýza

Profilování CircRNA microarray ve vzorcích séra bylo provedeno pomocí Arraystar human CircRNA Array V2 (Capital Biotechnology, Čína). Pro sumarizaci dat, normalizaci a kontrolu kvality mikročipů byl použit software GeneSpring V13.{2}} (Agilent Technologies). CircRNA s prahem násobné změny větší nebo rovné 2 a menší nebo rovné -2 a P-hodnota < 0,05 byly považovány za statisticky významné. Hierarchická shluková analýza byla provedena pomocí standardizované euklidovské vzdálenosti s kompletní vazbou.

4. Sekvenování RNA (RNA-seq) a analýza dat

RNA-seq nové generace byla provedena tak, jak bylo podrobně popsáno dříve [24, 25]. miR-412-3p a kontrolní mimicky transfekované 786-0 buňky byly použity pro sekvenování RNA. Konstrukce knihovny a bioinformatické analýzy nezpracovaných dat byly provedeny společností Novogene Co., Ltd. (Peking, Čína). Data RNA-seq byla uložena v Gene Expression Omnibus (GEO) pod přístupovým číslem GSE175492.

5. Extrakce RNA a kvantitativní RT-PCR v reálném čase (RT-qPCR)

RT-qPCR byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve [26, 27]. Celková RNA byla izolována ze séra, buněk a nádorových tkání pomocí AG RNAex Pro Reagent (AG, Hunan, Čína). Pro detekci circRNA byl 1 ug celkové RNA štěpen RNázou R (3 U/ug, Epicenter Technologies, Madison, USA, Cat#RNR07250) při 37 stupních po dobu 10 minut a byla vytvořena komplementární DNA (cDNA) pomocí HiScript II 1st Souprava pro syntézu řetězců cDNA (Vazyme). Hladiny exprese CircRNA a mRNA byly normalizovány na -aktin. Ke stanovení exprese miRNA byla provedena reverzní transkripce pomocí soupravy miR-XTM miRNA First-strand Synthesis kit (Takara Bio USA, CA, USA, kat. č. 638313) s expresí U6 (Rnu6–1) jako endogenní kontrolou. Relativní hladina exprese RNA byla stanovena metodou 2-ΔACt. Všechny sekvence primerů pro analýzu qRT-PCR jsou uvedeny v tabulce S2.

6. Konstrukce plazmidu a stabilní transfekce

Pro konstrukci vektoru nadměrné exprese circDVL1 a circDVL1-MUT byly circDVL1 a mutovaná sekvence circDVL1 klonovány do vektoru pcDNA 3.1(plus) Laccase 2 MCS Exon vektoru, který byl objednán od Addgene (#69893) [28]. ACHN a 786-0 buňky byly transfekovány circRNA a negativními kontrolními vektory pomocí Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Po 48 hodinách byly stabilně transfekované buňky exprimující circDVL1 selektovány přidáním 800 ug/ml G418 do kultivačního média.

7. Životaschopnost buněk

Test viability buněk byl stanoven pomocí soupravy CCK8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonsko, kat. č. CK04), jak bylo popsáno dříve [29]. 786-O a ACHN circDVL1 nadměrně exprimující a kontrolní buňky byly nasazeny do 96-jamkových destiček. Roztok CCK8 (10 ul) byl přidán v uvedeném čase a inkubován při 37 stupních po dobu 2 hodin a absorbance byla měřena pomocí spektrofotometru.

Herba Cistanche

8. Vznik kolonií

Testy tvorby kolonií byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve [24]. ACHN (800 buněk/jamka) a 786-0 buněk (400 buněk/jamka) byly kultivovány po dobu 10 dnů a následně fixovány 4% paraformaldehydem po dobu přibližně 30 minut, poté následovalo barvení 0,1% roztok krystalové violeti po dobu přibližně 15 min. Klony obsahující více než 50 buněk byly počítány jako jedna kolonie.

9. Analýza buněčného cyklu

Buňky byly synchronizovány v médiu RPMI 1640 bez FBS přes noc a převedeny na médium s 10 procenty FBS na dalších 48 hodin. Buňky byly promyty, resuspendovány v 70% ethanolu v PBS a skladovány při -20 stupních přes noc. Dále byly buňky obarveny roztokem propidium jodidu (PI) obsahujícím RNázu A pro analýzu buněčného cyklu.

10. Analýza apoptózy

Analýza apoptózy buněk ACHN a 786-O byla provedena pomocí soupravy pro detekci apoptózy Annexin V-FITC/PI (Beijing Biosea Biotechnology, Čína) podle pokynů výrobce.

11. Testy buněčné migrace a invaze

In vitro byla buněčná migrační kapacita hodnocena pomocí transwell komůrek s 8 μm pórovitými polykarbonátovými membránami (Millipore, MA, USA). Testy buněčné invaze byly provedeny s transwell komůrkami potaženými 100 ul Matrigelu (BD Biosciences, USA). 786-O buňky (2×104) nebo ACHN buňky (4×104) byly suspendovány ve 200 μl RPMI 1640 bez séra a naočkovány do horních transwell komůrek a poté bylo přidáno 600 μl média obsahujícího 20 procent FBS do spodních komor. Poté byly buňky kultivovány po dobu 24 hodin pro měření migrace a po dobu 48 hodin pro vyhodnocení invaze. Buňky v horní komoře byly opatrně seškrábány a buňky ve spodní komoře byly fixovány 4% paraformaldehydem a obarveny krystalovou violetí. Byly získány snímky a buňky byly spočítány mikroskopem.

12. západní skvrna

Celkový protein byl extrahován, kvantifikován a separován na 10% SDS-PAGE gelech a poté přenesen na polyvinylidendifluoridové membrány (Millipore, MA, USA), které byly inkubovány s primární anti-glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázou (GAPDH) (Proteinch, 60004-1-Ig), primární protilátky anti-PCDH7 (Abcam, ab139274) při 4 stupních přes noc.

13. Imunofluorescenční barvení

Buňky byly nasazeny na krycí sklíčka po dobu 24 hodin a fixovány 4% paraformaldehydem, permeabilizovány 0,2% Tritonem X-100 po dobu 20 minut a inkubovány s 5% hovězím sérovým albuminem. Dále byly buňky inkubovány s primární protilátkou specifickou pro Ki67 (1:400, ab48027, Abcam) při 4 stupních přes noc a následně inkubovány s 488-konjugovaným kozím anti-králičím IgG (1:150, D110088, Sangon ) při 37 stupních po dobu 1 hodiny. Buňky byly obarveny 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) a snímky byly získány fluorescenčním mikroskopem Leica (DM4000).

14. Tvorba nádoru in vivo a barvení Ki67

Šestitýdenní samci nahých myší BALB/c (zakoupeni od Shanghai SLAC) byli rozděleni do 2 skupin (n=5 pro každou skupinu). Myši byly naočkovány přibližně 3 x 106 kontrolními buňkami nebo circDVL1 nadměrně exprimujícími ACHN buňkami subkutánní injekcí. Velikost nádoru byla měřena posuvným posuvným měřítkem každé 3 dny, počínaje dnem 6 po injekci. Objem nádoru byl vypočten jako délka × šířka × výška/2. Všechny experimenty byly provedeny podle pokynů pro péči a použití laboratorních zvířat (publikace NIH 80-23, revidovaná v roce 1996) a byly schváleny Výborem pro péči o zvířata na Zhejiang University, Hangzhou, Čína.

Kapsle Cistanche

15. Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)

Byla syntetizována sonda circDVL1 double-digoxigenin (DIG)-křenová peroxidáza (HRP) (Exon Biotechnology, Guangzhou, Čína). Kontrolní buňky a buňky ACHN nadměrně exprimující circDVL1 byly kultivovány na krycích sklíčkách a inkubovány se značenou sondou při 37 stupních po dobu 24 hodin. Po promytí byla sklíčka inkubována v anti-DIG sekundární protilátce při 37 stupních po dobu 1 hodiny. K detekci signálů circDVL1 byla použita metoda amplifikace tyraminového signálu a buňky byly kontrastně obarveny DAPI. Pro co-FISH byla krycí sklíčka inkubována s DIG značeným circDVL1 a biotinem značeným miR-412-3p.

16. Test imunoprecipitace RNA (RIP).

RIP testy byly provedeny s Magna RIP™ RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit (Millipore, MA, USA). 786-O buňky byly lyžovány v kompletním RIP lyzačním pufru a poté inkubovány s imunoprecipitačním pufrem obsahujícím magnetické kuličky, které byly konjugovány s AGO2 (Abcam, MA, USA) nebo komplexem protilátky IgG při 4 stupních přes noc. Poté byly imunoprecipitované RNA testovány pomocí RT-qPCR.

17. Duální luciferázový reportérový test

CircDVL1, PPM1H-3'UTR a PCDH7-3'UTR sekvence, které obsahovaly mutovaná miR-412-3p vazebná místa, a jejich odpovídající mutované sekvence, byly syntetizovány a poté subklonovány do luciferázového reportéru vektor psiCHECK-2 (Promega) k vytvoření circDVL1-WT, circDVL1-Mut1, circDVL1-Mut2, PPM1H-3'UTR-WT, PCDH{ {14}}'UTRWT, PCDH7-3'UTR-Mut1 a PCDH7-3'UTR-Mut2 vektory. Různé 3'UTR sekvence PPM1H a PCDH7 obsahují 500 bp fragment obsahující potenciální miR-412-3p vazebná místa (lemovaná 250 bp). Relativní luciferázová aktivita byla hodnocena duální luciferázovou reportérovou analýzou (Promega, USA). Všechny testy byly provedeny ve třech nezávislých replikátech.

18. Statistická analýza

Statistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPad Prism 7.{1}} (GraphPad Software, La Jolla, CA). Rozdíly mezi skupinami byly hodnoceny Studentovými t-testy nebo jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA). Rozdíly mezi skupinami byly považovány za statisticky významné, když byly P-hodnoty < 0,05.

Diskuse

Byly navrženy a experimentálně vyhodnoceny různé typy biomarkerů ccRCC, včetně mRNA [32], miRNA [33], lncRNA [34] a circRNA [35]. Žádný z nich však nebyl potvrzen jako přesné diagnostické biomarkery pro rutinní klinické použití u pacientů s ccRCC. Zde naše studie ilustrovala, že circDVL1 hraje důležitou roli v progresi ccRCC. Nejprve jsme provedli screening séra pacientů s ccRCC a zdravých kontrol, abychom identifikovali odlišně exprimované circRNA pomocí mikročipu circRNA. Data RT-qPCR odhalila, že circDVL1 byl dramaticky downregulován ve vzorcích ccRCC. Předchozí studie ukázaly, že circRNA mohou sloužit jako latentní sérové ​​biomarkery u různých druhů rakoviny [36, 37]. Například Bei a kol. prokázali, že exosomální has-circ{10}} byl zvýšen v séru odebraném pacientům s kolorektálním karcinomem [38]. Nicméně výzkum specifické role circRNA jako neinvazivního biomarkeru v ccRCC je stále omezený. Naše studie odhalila, že circDVL1 byl významně downregulován v séru pacientů s ccRCC a že snížená exprese sérového circDVL1 může být způsobena nádorem. Kromě toho měla hladina circDVL1 v séru významnou diagnostickou hodnotu při rozlišování mezi pacienty s tumory Fuhrmanova stupně I-II a Fuhrmanova stupně III-IV. Sérový circDVL1 by proto mohl být slibným diagnostickým markerem pro ccRCC. Několik zdravých pacientů však vykazovalo nízké hladiny circDVL1 v jejich séru, což naznačuje, že monitorování pacientů pouze na základě analýzy této cirkulující RNA by mohlo vést k falešně pozitivním výsledkům. Proto je hodnota circDVL1 jako jediného diagnostického markeru poněkud omezená a může být nutné analyzovat kombinaci různých cirkulujících RNA pro získání spolehlivé predikce vývoje nádoru a metastáz.

Jako nově identifikovaná circRNA nebyla biologická a patologická úloha circDVL1 zkoumána. V této studii jsme hodnotili roli a regulační mechanismus circDVL1 v ccRCC. Funkční testy ukázaly, že nadměrně exprimovaný circDVL1 by mohl snížit proliferaci buněk ccRCC, schopnost tvorby kolonií a tumorigenní potenciál, pravděpodobně v důsledku zvýšené buněčné apoptózy in vitro a potlačení vývoje nádoru in vivo. Data naznačovala, že circDVL1 by mohl mít nádorovou supresorovou funkci v ccRCC.

CircRNA mohou podporovat iniciaci a progresi nádoru tím, že působí jako miRNA houby. Zkoumali jsme tedy, zda circDVL1 může regulovat biogenezi miRNA během karcinogeneze ccRCC. Pomocí softwaru miRanda a miRWalk jsme zjistili, že circDVL1 má potenciální vazebné místo pro miR-412-3p. Luciferázové reportérové ​​testy prokázaly přímou souvislost mezi circDVL1 a miR-412-3p. Předchozí studie ukázaly, že miR-412-3p se podílel na patogenezi různých rakovin prostřednictvím různých molekulárních mechanismů [31, 39, 40]. Například miR-412-3p měl onkogenní roli u rakoviny tlustého střeva, podporoval migraci, invazi a buněčnou proliferaci rakovinných kmenových buněk [31]. Navíc exprese miR-412-3p byla upregulována v extracelulárních vezikulách pacientů s orálním spinocelulárním karcinomem (OSCC) [39]. Podobně naše výsledky naznačovaly, že miR-412-3p byl důležitým promotorem nádorů v ccRCC.

Cistanche prášek

Kromě toho byl také identifikován cíl circDVL1/miR-412-3p. Protokaderiny (PCDH) jsou transmembránové proteiny patřící do superrodiny kadherinů, které hrají významnou roli v buněčné adhezi a signálních drahách. PCDH7 je členem rodiny PCDH a má dobře zavedené role v rozpoznávání mezi buňkami a buněčné adhezi [41]. Je obecně známo, že ztráta adheze je časným krokem invaze nádorových buněk a metastáz. Nové důkazy naznačují, že PCDH7 je aberantně exprimován v různých typech nádorů. Například u lidského nemalobuněčného karcinomu plic byl PCDH7 často nadměrně exprimován a fungoval jako onkogen k indukci buněčné transformace a podpoře tumorigeneze plic zesílením MAPK signalizace [42]. Naopak PCDH7 inhiboval migraci a invazi buněk karcinomu žaludku prostřednictvím E-cadherinu [43]. Snížená exprese PCDH7 byla navíc zjištěna u kolorektálního karcinomu [44] a karcinomu močového měchýře [45]. Tato data naznačují, že PCDH7 má různé funkce v různých typech nádorů. V této studii jsme prokázali, že hladiny PCDH7 byly sníženy ve vzorcích nádorů ccRCC. Je zajímavé, že funkční záchranné experimenty odhalily, že nádorové supresorové vlastnosti circDVL1 jsou částečně způsobeny jeho účinkem na PCDH7. Naše studie silně naznačuje důležitost regulační osy circDVL1/miR-412-3p/PCDH7 v progresi ccRCC.

Tato studie má několik omezení. Testovali jsme tři specifické siRNA pro endogenní circDVL1, ale bohužel všechny tyto siRNA nedokázaly porazit circDVL1 pravděpodobně kvůli jedinečné struktuře této circRNA, stejně jako její nízké bazální expresi v buňkách ccRCC. Naše výsledky navíc ukázaly, že circDVL1 by mohl být terapeutickým cílem u pacientů s ccRCC, k dalšímu prokázání jeho klinického významu jsou nutné klinické studie s velkými kohortami pacientů. V naší studii jsme nezkoumali příčinu downregulace circDVL1 v lézích ccRCC. Bylo hlášeno, že proteiny vázající RNA (RBP), včetně třesení (QKI), regulačního proteinu 1 sestřihu epitelu (ESRP1) a fúzovaného sarkomu (FUS) se podílejí na posttranskripční tvorbě circRNA [{{10 }}]. Kromě toho se některé transkripční faktory (např. ZEB1, c-Myb a c-Jun) také účastní biogeneze specifických circRNA [49-52]. Studie také ukázaly, že modifikace m6A zprostředkovává degradaci circRNA. Park a kol. uvedli, že cirRNA modifikované m6A byly také downregulovány prostřednictvím osy YTHDF2- HRSP12-RNázy P/MRP [53]. Zda jsou tyto RBP, transkripční faktory a metylace m6A zapojeny do downregulace circDVL1, zůstává nejisté. V našem budoucím výzkumu se pokusíme prozkoumat upstream regulační mechanismus circDVL1 ve vývoji ccRCC a tumorigenezi.

V souhrnu jsme prokázali, že hladina circDVL1 byla snížena v séru pacientů s ccRCC. Pozoruhodně jsme dále zkoumali regulační mechanismy circDVL1 a prokázali jsme, že circDVL1 potlačuje tumorigenezi ccRCC podporou exprese PCDH7 houbováním miR-412-3p. Naše studie proto ukázala, že circDVL1 může být potenciálním terapeutickým cílem pro budoucí léčbu ccRCC.

Reference

1.Cheng SK, Chuah KL. Metastatický renální buněčný karcinom do pankreatu: Přehled. Archivy patologie a laboratorní medicíny. 2016; 140: 598-602.

2. Jonasch E, Walker CL, Rathmell WK. Jasnobuněčný karcinom ledviny ontogeneze a mechanismy letality. Nat Rev Nephrol. 2021; 17: 245-61.

3. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin. 2020; 70.

4. Shuch B, Amin A, Armstrong AJ, Eble JN, Ficarra V, Lopez-Beltran A, et al. Pochopení patologických variant renálního karcinomu: využití terapeutických příležitostí z biologické složitosti. Evropská urologie. 2015; 67: 85-97.

5. Koul H, Huh JS, Rove KO, Crompton L, Koul S, Meacham RB a kol. Molekulární aspekty karcinomu ledvin: přehled. Am J Cancer Res. 2011; 1: 240-54.

6. Sanchez-Gastaldo A, Kempf E, Gonzalez Del Alba A, Duran I. Systémová léčba karcinomu ledvin: Komplexní přehled. Cancer Treat Rev. 2017; 60: 77-89.

7. Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. Biogeneze, biologie a charakterizace cirkulárních RNA. Nature Reviews Genetics. 2019; 20: 675-91.

8. Patop IL, Wüst S, Kadener S. Minulost, přítomnost a budoucnost circRNA. Deník EMBO. 2019; 38: e100836.

9. Perez de Acha O, Rossi M, Gorospe M. Cirkulární RNA u krevních malignit. Přední Mol Biosci. 2020; 7:109.

10. Zhang SJ, Chen X, Li CP, Li XM, Liu C, Liu BH a kol. Identifikace a charakterizace cirkulárních RNA jako nové třídy domnělých biomarkerů u diabetické retinopatie. Investigativní oftalmologie a vizuální věda. 2017; 58: 6500-9.

11. Bahn JH, Zhang Q, Li F, Chan TM, Lin X, Kim Y a kol. Krajina mikroRNA, RNA interagující s Piwi a kruhové RNA v lidských slinách. Klinická chemie. 2015; 61: 221-30.

12. Li Y, Zheng Q, Bao C, Li S, Guo W, Zhao J a kol. Cirkulární RNA je obohacená a stabilní v exozomech: slibný biomarker pro diagnostiku rakoviny. Buněčný výzkum. 2015; 25: 981-4.

13. Li S, Han L. Cirkulární RNA jako slibné biomarkery u rakoviny: detekce, funkce a další. Genomová medicína. 2019; 11:15.

14. Ye Q, Ling S, Zheng S, Xu X. Tekutá biopsie u hepatocelulárního karcinomu: cirkulující nádorové buňky a cirkulující nádorová DNA. Mol Cancer. 2019; 18:114.

15. Wen G, Zhou T, Gu W. Potenciál použití krevní cirkulární RNA jako biomarkeru tekuté biopsie pro lidská onemocnění. Proteinová buňka. 2020.

16. Zhang Z, Yang T, Xiao J. Circular RNAs: Promising Biomarkers for Human Diseases. EBioMedicine. 2018; 34: 267-74.

17. Wang S, Zhang K, Tan S, Xin J, Yuan Q, Xu H a kol. Cirkulární RNA v tělesných tekutinách jako biomarkery rakoviny: nová hranice tekutých biopsií. Mol Cancer. 2021; 20:13.

18. Wang Y, Zhang Y, Wang P, Fu X, Lin W. Cirkulární RNA u renálního karcinomu: důsledky pro tumorigenezi, diagnostiku a terapii. Mol Cancer. 2020; 19:149.

19. Chen D, Chen W, Xu Y, Zhu M, Xiao Y, Shen Y a kol. Upregulovaný imunitní kontrolní bod HHLA2 u karcinomu ledvin z jasných buněk: nový prognostický biomarker a potenciální terapeutický cíl. J Med Genet. 2019; 56: 43-9.

20. Lv Q, Wang G, Zhang Y, Shen A, Tang J, Sun Y a kol. CircAGAP1 podporuje progresi nádoru houbovitým působením miR-15-5p u karcinomu ledvin z jasných buněk. J Exp Clin Cancer Res. 2021; 40:76.

21. Wang K, Sun Y, Tao W, Fei X, Chang C. Androgenní receptor (AR) podporuje migraci a invazi karcinomu ledvin z jasných buněk (ccRCC) prostřednictvím změny circHIAT1/miR-195-5p/29a{{ 4}}p/29c-3p/CDC42 signály. Rak dopisy. 2017; 394: 1-12.

22. Xue D, Wang H, Chen Y, Shen D, Lu J, Wang M a kol. Circ-AKT3 inhibuje metastázy karcinomu ledvin z jasných buněk prostřednictvím změny signálů miR-296-3p/E-cadherinu. Molekulární rakovina. 2019; 18:151.

23. Chen Q, Liu T, Bao Y, Zhao T, Wang J, Wang H a kol. CircRNA cRAPGEF5 inhibuje růst a metastázy renálního karcinomu cestou miR-27a-3p/TXNIP. Rak dopisy. 2019; 469: 68-77.

24. Guo X, Lin W, Wen W, Huyghe J, Bien S, Cai Q a kol. Identifikace nových genů náchylnosti k riziku kolorektálního karcinomu z celotranskriptomové asociační studie 125 478 subjektů. Gastroenterologie. 2021; 160.

25. Wang J, Nie W, Xie X, Bai M, Ma Y, Jin L a kol. MicroRNA-874-3p/ADAM (A dezintegrin a metaloproteáza) 19 zprostředkovává aktivaci makrofágů a renální fibrózu po akutním poškození ledvin. Hypertenze. 2021; 77: 1613-26.

26. Kun-Peng Z, Chun-Lin Z, Jian-Ping H, Lei Z. Nový cirkulující hsa_circ{5}} působí jako potenciální biomarker pro diagnostiku a prognózu osteosarkomu. Int J Biol Sci. 2018; 14: 1513-20.

27. Yuan Y, Bao J, Chen Z, Villanueva AD, Wen W, Wang F a kol. Multi-omická analýza k identifikaci genů náchylnosti na kolorektální karcinom. Hum Mol Genet. 2021.

28. Kramer MC, Liang D, Tatomer DC, Gold B, March ZM, Cherry S, et al. Kombinační kontrola exprese cirkulární RNA Drosophila pomocí intronových repetic, hnRNP a SR proteinů. Genes Dev. 2015; 29: 2168-82.

29. Guo X, Lin W, Bao J, Cai Q, Pan X, Bai M a kol. Komplexní cis-eQTL analýza odhalila cílové geny v lokusech náchylnosti k rakovině prsu identifikovaných v celogenomových asociačních studiích. Am J Hum Genet. 2018; 102: 890-903.

30. Zhong S, Wang J, Zhang Q, Xu H, Feng J. CircPrimer: software pro anotaci circRNA a stanovení specificity primerů circRNA. Bioinformatika BMC. 2018; 19: 292.

31. Zhu K, Wang Y, Liu L, Li S, Yu W. Dlouhá nekódující RNA MBNL1-AS1 reguluje proliferaci, migraci a invazi rakovinných kmenových buněk u rakoviny tlustého střeva interakcí s MYL9 prostřednictvím houbovité mikroRNA -412-3str. Kliniky a výzkum v hepatologii a gastroenterologii. 2020; 44: 101-14.

32. Schrödter S, Braun M, Syring I, Klümper N, Deng M, Schmidt D, et al. Identifikace dopaminového transportéru SLC6A3 jako biomarkeru pro pacienty s renálním karcinomem. Molekulární rakovina. 2016; 15:10.

33. Ran L, Liang J, Deng X, Wu J. miRNAs in Prediction of Prognosis in Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Biomed Res Int. 2017; 2017: 4832931.

34. Li JK, Chen C, Liu JY, Shi JZ, Liu SP, Liu B a kol. Dlouhá nekódující RNA MRCCAT1 podporuje metastázy karcinomu ledvin ze světlých buněk prostřednictvím inhibice NPR3 a aktivace signalizace p38-MAPK. Molekulární rakovina. 2017; 16:111.

35. Sheng JQ, Liu L, Wang MR, Li PY. Cirkulární RNA u rakoviny trávicího systému: potenciální biomarkery a terapeutické cíle. Am J Cancer Res. 2018; 8: 1142-56.

36. Vea A, Llorente-Cortes V, de Gonzalo-Calvo D. Cirkulární RNA v krvi. Adv Exp Med Biol. 2018; 1087: 119-30.

37. Vo JN, Cieslik M, Zhang Y, Shukla S, Xiao L, Zhang Y a kol. Krajina kruhové RNA u rakoviny. Buňka. 2019; 176.

38. Pan B, Qin J, Liu X, He B, Wang X, Pan Y a kol. Identifikace sérového exosomálního has-circ-0004771 jako nového diagnostického biomarkeru kolorektálního karcinomu. Přední Genet. 2019; 10: 1096.

39. Gai C, Camussi F, Broccoletti R, Gambino A, Cabras M, Molinaro L a kol. MiRNA asociované se slinnými extracelulárními vezikuly jako potenciální biomarkery u orálního spinocelulárního karcinomu. BMC rakovina. 2018; 18: 439.

40. Lenherr SM, Tsai S, Silva Neto B, Sullivan TB, Cimmino CB, Logvinenko T, et al. Profil exprese MicroRNA identifikuje vysoce kvalitní neinvazivní nádory močového měchýře se zvýšeným rizikem progrese k invazivnímu fenotypu. Geny (Basilej). 2017; 8.

41. Yoshida K. Tvar a adheze fibroblastových buněk in vitro se mění nadměrnou expresí izoforem 7a a 7b protocadherinu 7, ale ne izoformy 7c. Cell Mol Biol Lett. 2003; 8: 735-41.

42. Zhou X, Updegraff BL, Guo Y, Peyton M, Girard L, Larsen JE a kol. PROTOCADHERIN 7 Působí prostřednictvím SET a PP2A k potenciaci MAPK signalizace prostřednictvím EGFR a KRAS během plicní tumorigeneze. Cancer Res. 2017; 77: 187-97.

43. Chen HF, Ma RR, He JY, Zhang H, Liu XL, Guo XY a kol. Protocadherin 7 inhibuje buněčnou migraci a invazi prostřednictvím E-cadherinu u rakoviny žaludku. Tumor Biol. 2017; 39: 1010428317697551.

44. Bujko M, Kober P, Mikula M, Ligaj M, Ostrowski J, Siedlecki JA. Změny exprese genů souvisejících s adhezí buňka-buňka u kolorektálních nádorů. Oncol Lett. 2015; 9: 2463-70.

45. Lin YL, Wang YL, Fu XL, Li WP, Wang YH, Ma JG. Nízká exprese protocadherinu7 (PCDH7) je potenciálním prognostickým biomarkerem primárního nesvalově invazivního karcinomu močového měchýře. Oncotarget. 2016; 7: 28384-92.

46. ​​Conn SJ, Pillman KA, Toubia J, Conn VM, Salmanidis M, Phillips CA, et al. Třesení proteinu vázajícího RNA reguluje tvorbu circRNA. Buňka. 2015; 160: 1125-34.

47. Errichelli L, Dini Modigliani S, Laneve P, Colantoni A, Legnini I, Capauto D a kol. FUS ovlivňuje expresi cirkulární RNA v motorických neuronech odvozených z myších embryonálních kmenových buněk. Nat Commun. 2017; 8: 14741.

48. Yu CY, Li TC, Wu YY, Yeh CH, Chiang W, Chuang CY a kol. Kruhová RNA circBIRC6 se účastní molekulárního obvodu řídícího lidskou pluripotenci. Nat Commun. 2017; 8: 1149.

49. Lee YH, Kim HS, Kim JS, Yu MK, Cho SD, Jeon JG a kol. C-my reguluje autofagii pro vitalitu dřeně při glukózovém oxidativním stresu. J Dent Res. 2016; 95: 430-8.

50. Li Q, Wang Y, Wu S, Zhou Z, Ding X, Shi R a kol. CircACC1 reguluje sestavení a aktivaci komplexu AMPK při metabolickém stresu. Cell Metab. 2019; 30.

51. Ren C, Zhang Z, Wang S, Zhu W, Zheng P, Wang W. Cirkulární RNA hsa_circ_0001178 usnadňuje invazi a metastázy kolorektálního karcinomu prostřednictvím upregulace ZEB1 prostřednictvím spongingu více miRNA. Biol Chem. 2020; 401: 487-96.

52. Zeng K, Chen X, Xu M, Liu X, Hu X, Xu T a kol. CircHIPK3 podporuje růst kolorektálního karcinomu a metastázování houbou miR-7. Cell Death Dis. 2018; 9:417.

53. Park OH, Ha H, Lee Y, Boo SH, Kwon DH, Song HK a kol. Endoribonukleolytické štěpení RNA obsahujících mA komplexem RNázy P/MRP. Mol Cell. 2019; 74.

Ying Wang1,2, Yunjing Zhang1,2, Xinwan Su3, Qiongzi Qiu4, Yuan Yuan2, Chunhua Weng2, Sailan Zou5, Yan Tian5, Weidong Han6, Pengyuan Liu4, Xingyi Guo7, Jianhua Mao8, Xianghui,3 Weng Wang

1. Čtvrtá přidružená nemocnice a mezinárodní lékařské instituty, Lékařská fakulta univerzity Zhejiang, Jinhua 322000, Zhejiang, Čína.

2. Centrum pro onemocnění ledvin, první přidružená nemocnice a institut translační medicíny, lékařská fakulta univerzity Zhejiang, Hangzhou 310003, Zhejiang, Čína.

3. Urologická klinika, První přidružená nemocnice, Lékařská fakulta univerzity Zhejiang, Hangzhou 310003, Zhejiang, Čína.

4. Oddělení respirační medicíny, nemocnice Sir Run Run Shaw a Institut translační medicíny, Lékařská fakulta univerzity Zhejiang, Hangzhou 310016, Zhejiang, Čína.

5. Divize endokrinologie a metabolismu, Státní klíčová laboratoř bioterapie a onkologického centra, Západočínská nemocnice, Sichuanská univerzita a kolaborativní inovační centrum bioterapie, Chengdu 610041, Sichuan, Čína.

6. Oddělení lékařské onkologie, nemocnice Sir Run Run Shaw, Lékařská fakulta univerzity Zhejiang, Hangzhou 310016, Zhejiang, Čína.

7. Division of Epidemiology, Department of Medicine, Vanderbilt Epidemiology Center, and Vanderbilt-Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville 37203, TN, USA.

8. Oddělení nefrologie, Národní centrum klinického výzkumu pro zdraví dětí, Dětská nemocnice, Lékařská fakulta univerzity Zhejiang, Hangzhou 310003, Zhejiang, Čína.