Abstraktní

Úvod: Propolis je pryskyřičná přírodní látka sbíraná včelami z pupenů a exsudátů různých stromů a rostlin; obecně se uznává, že složení propolisu závisí na fytogeografických charakteristikách místa sběru.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a dokáže vychytávat reaktivní formy kyslíku, bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na doplněk Cistanche Tubulosa

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Cíle: Tato studie měla za cíl určit fytochemické složení etanolových extraktů z osmi šarží propolisu shromážděných v různých oblastech Beninu (sever, střed a jih) a Konga v Africe.

Materiály a metody:Charakterizace vzorků propolisu byla provedena pomocí různých chromatografických metod s pomlčkou v kombinaci s dereplikací uhlíkové -13 nukleární magnetické rezonance (13C NMR) pomocí softwaru MixONat. Jejich antioxidační aktivita nebo aktivita konečného produktu proti pokročilé glykaci (anti-AGE) byla poté hodnocena pomocí testů na difenylpikrylhydrazyl a bovinní sérový albumin.

Výsledek: Chromatografické analýzy v kombinaci s dereplikací 13C NMR ukázaly, že dva vzorky z centra Beninu vykazovaly kromě obrovského množství pentacyklických triterpenů, methoxylovaných stilbenoidů nebo fenantrenů, zodpovědných za antioxidační aktivitu extraktu prvního z nich. Mezi nimi může být kombretastatin cytotoxický. U druhého byly prenylované flavanony známé v propolisu typu Macaranga zodpovědné za jejich významnou anti-AGE aktivitu. Vzorek z Konga byl složen z mnoha triterpenových derivátů patřících k druhu Mangifera indica.

Závěr: Zdá se tedy, že propolis z centra Beninu je obzvláště zajímavý díky svým antioxidačním a anti-AGE vlastnostem. Nicméně vzhledem k tomu, že standardizace propolisu je v tropických zónách obtížná kvůli jeho velké chemické rozmanitosti, je před prosazováním používání propolisu v potravinách a zdravotnických produktech v Africe vyžadována systematická fytochemická analýza.

KLÍČOVÁ SLOVA

13C NMR dereplikace, methoxylované stilbenoidy nebo fenantreny, pentacyklické triterpeny, prenylované flavanony, propolis

1. ÚVOD

Propolis je přírodní pryskyřičná látka sbíraná včelami z pupenů a exsudátů různých stromů a rostlin, smíchaná se včelím voskem a slinnými enzymy.1 Včely ji používají k ochraně vchodu před vetřelci, ucpávání otvorů, vyhlazování vnitřních stěn, mumifikaci mrtvých zvířat (drobný hmyz) uvnitř úlu a vyrovnávat extrémní vlhkost nebo sucho.2,3 Propolis je v lidovém léčitelství široce používán již od starověku díky jeho široké škále terapeutických vlastností.4 Propolis je obecně složen z pryskyřice (50 procent) vosk (30 procent), oleje (10 procent), pyl (5 procent) a další fenolické sloučeniny, jako jsou flavonoidy.5,6 Je známo, že chemické složení propolisu je složité a liší se podle rostlinných druhů rostoucích v okolí úlu , ze kterých včely sbírají exsudáty.7 Je uznáváno, že několik faktorů, jako je floristické složení oblasti, místo a čas sběru, roční období, typ sběrače, dostupnost a nadmořská výška a potravní aktivita se vyvíjely během využívání propolisu má dopad na chemické složení propolisu.8,9 Existují různé typy propolisu v závislosti na zeměpisné oblasti výroby, botanickém zdroji a chemickém složení. Nejběžnějšími typy propolisu jsou mírné, březové, tropické, středomořské a tichomořské.10 Propolis z mírných klimatických pásem, jako je Evropa, Severní Amerika nebo netropické oblasti Asie, pochází převážně z exsudátů pupenů druhu Populus ( Salicaceae) a je proto bohatý na flavonoidy a fenolové kyseliny a jejich estery; tropický propolis pocházející z oblastí, kde neroste ani topol ani bříza, je bohatý na prenylované deriváty kyselin p-kumarových, benzofenony nebo terpenoidy.11 Pacifický propolis, typicky bohatý na prenylované flavanony, je dalším důležitým typem propolisu nalezeným na Tchaj-wanu. , Japonsku a na Šalamounových ostrovech a březový propolis se vyskytuje konkrétně v Rusku.12 Studium propolisu z tropické Asie vedlo k objevu Macaranga denarius L. a Mangifera indica L. jako rostlinných zdrojů indonéského propolisu.13 Na na druhé straně jehličnaté druhy čeledi Cupressaceae jsou hlavním botanickým zdrojem propolisu v oblastech Středomoří.14 Chemické analýzy odhalily, že propolis obsahuje více než 300 různých přírodních produktů (NP), včetně derivátů kyseliny fenolové, kumarinů, flavonoidů, seskviterpenů, diterpenů, triterpeny, steroidy, lignany nebo prenylované benzofenony.15 Biologické účinky propolisu byly popsány především nejen o jeho antioxidačním,16–18 anti-AGE (tj. inhibici tvorby konečného produktu pokročilé glykace [AGE]),19 proti -zánětlivé,20 a protinádorové účinky,21–23 ale také jejich antibakteriální,24–26 protiplísňové,15 antivirové,27 a protiparazitární28 aktivity. O propolisu je také známo, že stimuluje produkci protilátek, což naznačuje jeho potenciální použití jako adjuvans ve vakcínách.29 Zvýšené používání této přírodní látky s různorodým složením, a proto různé biologické aktivity ve farmaceutickém, kosmetickém a potravinářském průmyslu vyvolávají zvláštní zájem. ve vědeckém výzkumu, zejména pokud jde o definování jeho chemického složení. Většina studií byla provedena na vzorcích z Evropy19,30–33 a Latinské Ameriky, konkrétněji Brazílie20,23,34–36, zatímco jen málo studií bylo provedeno v Africe.37–41 Informace o beninském a konžském propolisu42 jsou stále vzácné.

Cílem této studie bylo charakterizovat hlavní sloučeniny ze vzorků propolisu odebraných v různých fytogeografických zónách Beninu a Konga (Afrika) pomocí dereplikace 13C nukleární magnetické rezonance (NMR) pomocí softwaru MixONat.43,44 Předběžná studie využívající databázi (DB) obsahující NP dříve hlášené z propolisu spolu s jejich 13C předpokládanými chemickými posuny (δC) nepřinesly žádná použitelná data ve srovnání s uspokojivými výsledky obvykle získanými s rostlinnými extrakty.43–45 To lze vysvětlit chemickým složením propolisu, které je vysoce závislé. na místní flóře, což znemožňuje konstrukci chemotaxonomické DB. Abychom rozluštili hlavní sloučeniny z beninského a konžského propolisu, v této práci jsme provedli vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii spojenou s hmotnostní spektrometrií s detekcí ultrafialového a odpařovacího rozptylu světla (HPLC-UV-ELSD-MS) a plynovou chromatografií spojenou s hmotnostní spektrometrií ( GC-MS) analýzy na extraktech surového propolisu za účelem identifikace jejich hlavních strukturních rysů a vytvoření odpovídajících DB NP vhodných pro software MixONat.46 Poté, po hrubé frakcionaci vzorků propolisu vybraných podle jejich chemického profilu, umožnila dereplikace založená na 13C NMR identifikaci hlavních NP bez dalšího čištění. Byly také provedeny antioxidační a anti-AGE testy.

2. EXPERIMENTÁLNÍ POSTUPY

2.1 Chemikálie

1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH), Folin-Ciocalteuovo činidlo, kyselina mravenčí a kyselina gallová, všechny analytické kvality, byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Francie). 6-Hydroxy-2,- 5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina (Trolox®) a 50 - kyselina kofeoylchinová (kyselina chlorogenová) byly získané od Acros Organics (Geel, Belgie).

2.2 Vzorky propolisu

Osm vzorků beninského propolisu bylo odebráno seškrábáním z úlů ve třech fytogeografických zónách (tabulka 1 a obrázek SI-1). Vzorek konžského propolisu byl odebrán v umělém lese akácií na náhorní plošině Bateke v centru Konžské republiky (tabulka 1).

2.3 Extrakce propolisu

Etanolické extrakty propolisu (EEP) byly zpočátku připraveny podle následujícího extrakčního protokolu.19 Surový propolis byl nejprve homogenně rozmělněn na prášek v přítomnosti kapalného dusíku. U všech vzorků byl macerován 1 g propolisového prášku ve 20 ml 95% EtOH. Po míchání po dobu 2 hodin při teplotě místnosti byla směs filtrována pomocí nálevkového filtru ze sintrovaného skla (velikost pórů 16–40 μm). Zbytek byl dvakrát reextrahován za použití stejných kroků. Poté byly tři shromážděné filtráty udržovány při 18 °C přes noc, přefiltrovány, aby se odstranily vosky, a odpařeny za sníženého tlaku (40 °C, 10 bar), čímž byly získány EEP.

Množství 8.0 g propolisového prášku BC1 (1) a BC2 (2) nebo 10,3 g CG (3) bylo znovu extrahováno EtOH 95% (SAE, 4 80 ml, 15 min) pro další flash chromatografie.

2.4 Stanovení celkového obsahu fenolů

Celkový obsah fenolů byl stanoven pomocí Folin–Ciocalteuovy kolorimetrické metody, jak bylo popsáno dříve,19 a nedávno upraven pro přímé použití na mikrodestách. Stručně řečeno, 10 ul každého propolisového extraktu v MeOH (3,5 mg/ml pro BC1, 5 mg/ml pro BN2, BC2 a CG, 7,5 mg/ml pro BN1, BS1a, BS1b a BS2 a 10 mg/ml pro BS3) byl smíchán s 20 ul destilované vody a 10 ul Folin-Ciocalteuova činidla v 96-jamkové mikrodestičky. Po 3 minutách bylo přidáno 120 ul destilované vody a 40 ul 20% vodného uhličitanu sodného. Absorbance byla měřena na mikrodestičkovém spektrofotometru TECAN® (V6.5) při 760 nm po 30 minutách ve tmě při pokojové teplotě. Stejným způsobem byl připraven slepý pokus s použitím MeOH místo roztoku extraktu a pro výpočet kalibrační křivky byla použita kyselina gallová (0,04–0,328 mg/ml; y=2,7241x 0,0039; r2=0 0,9982). Každý vzorek byl analyzován trojmo. Celkový obsah fenolů byl vyjádřen v ekvivalentech kyseliny gallové (mg) na gram extraktu (mg GAE/g).

2.5 Předběžné chromatografické analýzy

2.5.1 Analytická TLC

Analytická chromatografie na tenké vrstvě (TLC) byla prováděna na TLC Alugram Xtra SIL G/UV254 (Macherey-Nagel, Düren, Německo), za použití směsi cyklohexan: AcOEt jako eluentu. Skvrny na chromatogramu byly vizualizovány nejprve pod UV světlem (254 nm) a poté postřikem činidlem vanilin–kyselina sírová (2 ml koncentrované kyseliny sírové v 98 ml roztoku vanilin:95% ethanol 1:99 w/v) a zahřívání chromatogramů na 110 °C po dobu 5 minut.

2.5.2 Postup GC-MS

Analýza GC-MS byla provedena na nederivatizovaných vzorcích pomocí plynového chromatografu Shimadzu GCMS-QP2010 SE (Noisiel, Francie) s ionizačním napětím 70 eV (Electronic Dopad). Vzorky byly připraveny v dichlormethanu (DCM) v koncentraci 2 mg/ml pro extrakty a 1 mg/ml pro frakce. Separace byly prováděny za použití kolony Phenomenex ZB5 (30 m x 0,250 mm vnitřní průměr s tloušťkou filmu 0,25 mm; Phenomenex, Le Pecq, Francie). Teplota byla naprogramována následovně: 180 stupňů C (3 minuty), 180–280 stupňů C rychlostí 10 C/min a 280 stupňů C (27 minut). Jako nosný plyn bylo použito helium s průtokem 2,0 ml/min. Teploty vstřikovače a detektoru byly nastaveny na 250 °C a 280 °C. Metabolity byly identifikovány porovnáním jejich retenčních časů (Rt), nominální hmotnosti a/nebo vzorců fragmentace s původními vzorky a/nebo těmi, které jsou obsaženy v knihovnách vzorců fragmentace zařízení (NIST11, NIST11s a FFNSC2).

2.5.3 Postup HPLC-DAD-ELSD

Chromatografické analýzy byly provedeny pomocí 3D kapalinového chromatografu Shimadzu 2030C (Noisiel, Francie) vybaveného diodovým polemdetektor (DAD) a ELSD (Sedere®) s Lichrospher® kolonou 1{{10}}}0 RP-18 (125 mm * 4 mm id, 5 μm, Merck, Darmstadt, Německo ) chráněna ochrannou patronou Lichrocart® 4–4 (4 mm x 4 mm vnitřní průměr) s průtokem 1 ml/min. Mobilní fáze se skládala z 0,1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě (rozpouštědlo A) a methanolu (rozpouštědlo B) a separace byla provedena následujícím lineárním gradientem: 25–100 procent B (0–40 min), 100 procent (40–45 min). UV–vis spektra byla zaznamenána v rozsahu 190–600 nm a chromatogramy byly pořízeny při 254 a 280 nm. ELSD byl zahřátý na 30stupeňC a na signál byl aplikován zisk 4. Vzorky byly připraveny v koncentraci 10 mg/ml v MeOH a centrifugovány při 13,000 g po dobu 10 minut před injekcí (10 ul), aby se odstranily stopy suspendovaných materiálů.

2.5.4 Postup HPLC-UV-MS

HPLC-UV-MS analýzy byly provedeny za použití separačního modulu 2795 Waters (Guyancourt, Francie) vybaveného detektorem Dual X 2487 Waters. Kolona, ​​mobilní fáze a gradient byly stejné, jak je popsáno výše pro HPLC-DAD-ELSD. Chromatogramy byly získány při 254 a 280 nm. Hmotnostní analýzy byly provedeny na přístroji Bruker (Brémy, Německo) s ionizací elektrosprejem/chemickou ionizací za atmosférického tlaku (ESI/APCI) Ion Trap Esquire 3000 plus v pozitivním i negativním módu následovně: srážkový plyn, He; amplituda srážkové energie, 1,3 V; nebulizér a sušící plyn, N2, 7 l/min; tlak nebulizačního plynu, 30 psi; suchá teplota, 340 C; průtoková rychlost, 1,0 ml/min; dělicí poměr rozpouštědla, 1:9; rozsah skenování, m/z 100–1,000. Vzorky byly připraveny v koncentraci 10 mg/ml v MeOH, odstředěny při 13 000 g po dobu 10 minut a před injekcí (20 ul) zfiltrovány přes 0,{27}}μm polytetrafluorethylenový (PTFE) membránový injekční filtr (20 ul), aby se odstranily stopy suspendovaných materiálů.

2.6 EEP frakcionace flash chromatografií

Nejprve bylo 3,8 g BC1 (1), 3,5 g BC2 (2) nebo 4{9}} g CG (3) EEP rozpuštěno v minimálním objemu DCM a acetonu a smícháno se silikagelem (silikagel poměr gel:extrakt, 2:1). U všech z nich se rozpouštědlo nechalo odpařit, dokud se nezískal jemný suchý prášek. Pro každý EEP byla poté provedena frakcionace pomocí přístroje CombiFlash Teledyne ISCO (Lincoln, NE, USA) se silikagelovou kolonou (Chromabond® Flash RS 4{{20}} SiOH, 4{{83} } g, Macherey-Nagel, Hoerdt, Francie) při průtoku 25 ml/min s cyklohexanem (rozpouštědlo A) a ethylacetátem (EtOAc) (rozpouštědlo B) za použití následující gradientové eluce: (1) pro BC1 EEP, 5 procento B (0–10 minut), 5–20 procent B (10–30 minut), 20–30 procent B (30–60 minut), 30–50 procent B (60–85 minut) a 50–100 procent B (85–110 min); Odebralo se 160 zkumavek o objemu 20 ml a spojilo se do 14 frakcí (BC1_F1 až BC1_F14) na základě jejich chromatografických profilů TLC (poměr cyklohexan:EtOAc, 90:10 až 50:50 ); (2) pro BC2 EEP, 5 procent B (0–10 minut), 5–10 procent B (10–20 minut), 10–30 procent B (20–40 minut), 30–40 procent B (40–55 min) a 40–100 procent B (55–70 min); Odebralo se 100 zkumavek o objemu 20 ml a spojilo se do 8 frakcí (BC2_F1 až BC2_F8) na základě jejich chromatografických profilů TLC (poměr cyklohexan:EtOAc, 90:10 až 60:40 ); (3) pro CG EEP, 5 procent B (0–10 minut), 5–10 procent B (10–30 minut), 10–20 procent B (30–50 minut), 20–40 procent B (50–70 min), 40–60 procent B (70–80 minut) a 60–100 procent B (80–90 minut); Odebralo se 135 zkumavek o objemu 20 ml a spojilo se do 23 frakcí (CG_F1 až CG_F23) na základě jejich chromatografických profilů TLC (poměr cyklohexan:EtOAc, 80:20 až 60:40 ).

Další frakcionační krok byl proveden na frakci BC{{0}}}F7: 200 mg bylo rozpuštěno v minimálním objemu MeOH a smícháno s C18-silikagelem (C18-silikagel poměr gel:extrakt, 2:1). Separace byla provedena na koloně C18 (Interchim® PF-C18HP, 4 g, Montluçon, Francie) při průtoku 15 ml/min vodou (rozpouštědlo A) a MeOH (rozpouštědlo B) za použití následující gradientové eluce: 50– 70 procent B (0–30 minut) a 70–100 procent B (30–40 minut); Odebralo se 80 zkumavek o objemu 8 ml a spojilo se do 5 frakcí (BC2_F7-1 až BC2_F7-5) na základě jejich HPLC-UV (280 nm) profilů .

2.{1}H a13C NMR analýzy

NMR spektra (1D a 2D) propolisových frakcí (7–58 mg) nebo někdy NP byla zaznamenána v deuterovaném chloroformu (CDCI3) nebo deuterovaném methanolu (CD3OD) (500 ul) na JEOL NMR spektrometru při 400 MHz po dobu 1 H a 100 MHz pro 13C. Experimenty NMR (1H NMR, 13C NMR, DEPT-135, DEPT-90 a 2D NMR) na frakcích a čistých NP byly prováděny při 298 K na spektrometru JEOL 400 MHz H (JEOL Europe, Croissy -sur-Seine, Francie) vybavené inverzní 5-mm sondou (ROYAL RO5). Chemické posuny (5H a 5C) jsou vyjádřeny v ppm a hodnoty J v Hz.

Pro 13C NMR (100 MHz) spektra byla použita oddělovací sekvence WALTZ-16 s dobou akvizice 1,04 s (32 768 komplexních datových bodů) a relaxačním zpožděním 2 s. Bylo shromážděno 1 500 až 11{11}} skenů, aby se získal uspokojivý poměr S/N. Na každý volný indukční rozpad (FID) před Fourierovou transformací byl aplikován 1 Hz exponenciální filtr pro rozšíření čáry. Spektra byla manuálně fázována a korigována na základní linii pomocí softwaru MestReNova (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Španělsko) a odkazována na centrální rezonanci deuterovaného rozpouštědla při 5C 77,16 ppm (CDCI3) a 5C 49,00 ppm (CD3OD). Pro experimenty bez zkreslení pomocí polarizačního přenosu (DEPT) bylo zapotřebí 512 až 5 500 skenů a bylo provedeno srovnání se spektry 13C s použitím daného 5C. Poté byl použit práh minimální intenzity k ručnímu shromažďování pozitivních signálů 13C NMR a DEPT-90 a pozitivních a negativních signálů DEPT-135 při zamezení potenciálních šumových artefaktů.

Propolis DB1 byl poprvé vytvořen hledáním sloučenin popsaných v propolisu na SciFindern, 47 což vedlo k DB 1 471 NP; Hodnoty 5C byly předpovězeny pomocí NMR prediktorů pokročilého chemického vývoje (ACD) (C, H). Z takových DB obsahujících NP spolu s jejich hodnotami δC-SDF vytvořila rutina CTypeGen obsažená v MixONat vhodnou DB: Načetla soubor prostorových dat (SDF) a seřadila chemické posuny podle typu uhlíku. Poté byl vytvořen požadovaný SDF typu c, tj. Propolis DB1.43,44 typu c

Byl vytvořen Stilbenoids_Fenanthrenoidy DB2. Vyhledávání látek pomocí klíčových slov stilbenoids a phenanthrenes v databázi LOTUS obsahující 276 518 NP48 (LOTUS, 2022) umožnilo získat Stilbenoids_Phenanthrenoidy DB2 s 2 681 NP jako SDF. Poté byly vytvořeny Flavanones DB3: Vyhledávání na SciFindern47 pomocí 2-fenylchromanové-4- jedné substruktury umožnilo vybrat 56 679 molekul. Dále byly sníženy na 2 893 s odkazem na „Výskyt přírodních produktů“ pomocí analýzy látek pomocí filtru „Referenční role“ navrženého společností SciFindern. Po dodatečné rafinaci filtračním krokem na základě očekávané molekulové hmotnosti (MW) (tj. 340 až 424 Da) byly všechny relevantní flavanony následně exportovány jako SDF za účelem získání NP z Flavanones DB3 (684 NP). Pro každý NP DB2 a DB3 byly předpověděny hodnoty 5C-SDF pomocí softwaru ACD NMR prediktorů (C, H) a také metodologie dříve popsané Nuzillard46, aby se přímo získal SDF typu c připravený k použití MixONat. Ten obsahuje pro každou sloučeninu DB předpokládané hodnoty 8C organizované jako methyl, methylen, methin nebo kvartérní uhlíky.

Triterpeny DB4 byly vytvořeny z PNMRNP3 DB49,50 importovaného jako SDF v softwaru ACD NMR prediktory (C, H) vyhledáváním triterpenů s MW mezi 100 a 500 Da (tj. vyhledávací data: triterpeny; vyhledávací MW: 100 až 500) přímo získat DB 6 623 triterpenů v požadovaném formátu souboru typu c.

Alk(en)yl resorcinol a deriváty fenolu DB5 byly vytvořeny z PNMRNP3 DB49,50 importovaného jako SDF v softwaru ACD NMR prediktorů (C, H) vyhledáváním NP pomocí m-alk(en)ylfenolového skeletu a klasifikovaného jako fenoly (tj. 3-(hexadec-8-en-1-yl)fenol hledání podstruktury; hledání třídy Classyfire: fenol), abyste přímo získali DB 44 NP v požadovaném formátu souboru typu c.

2.8 13Dereplikace založená na C NMR pomocí softwaru MixONat

Seznam píku a údaje o intenzitě získané z každého experimentálního spektra (13C NMR, DEPT-135 a DEPT-90) byly exportovány jako soubor . csv pomocí softwaru Microsoft Excel (Microsoft 16.45) a použitý jako vstupní soubor v softwaru MixONat. Tyto soubory se skládají ze seznamu hodnot δC uspořádaných v sestupném pořadí podle jejich intenzit na stejném řádku, oddělených čárkou.

Data were then processed using MixONat, which exploits any dataset that provides molecular structures in the previously described SDF (i.e., c-type DB1–5 file format). Based on this information, MixONat was used to compare the experimental δC values of the fractions to the predicted δC-SDF values from the DB and made suggestions for specific NPs potentially present in the analyzed sample. In the end, MixONat provided NP proposals with scores ranging from 0 to 1, i.e., from 0% to 100% (where 1 corresponds to a perfect match and 0 indicates no similarity for a given compound from the used DB). Acceptable values for putative identification were >0.70. Poté byla experimentální data NP s nejlepším skóre porovnána s literaturou.

2.9 Čištění

2.9.1 Preparativní HPLC

Purifikace frakcí BC{{0}}F6 a BC1_F8 (40 mg ve 2 ml MeOH) byla provedena pomocí Shimadzu LC-20AP preparativu kapalinový chromatograf vybavený UV–vis detektorem SPD-40 (Noisiel, Francie), injekční smyčkou o objemu 2 ml a sběračem frakcí FRC-10A, s použitím preparativní kolony C18 (25{{39 }} mm 21,2 mm id, 5 μm) (Pursuit XRs 5, Agilent, Les Ulis, Francie) při průtoku 21,24 ml/min. Mobilní fáze se skládala z 0,1 procenta kyseliny mravenčí ve vodě (rozpouštědlo A) a methanolu (rozpouštědlo B) a separace byla provedena s použitím následujícího gradientu: (1) pro BC1_F6, 40 procent B (0–5 min), 40–70 procent B (5–20 minut) a 70–90 procent (20–30 minut); (2) pro BC1_F8, 40–70 procent B (0–15 min) a 70–90 procent (15-25 min). Chromatogramy byly získány při 254 a 280 nm.

2.9.2 Extrakce na pevné fázi (SPE)

Pro získání nejpolárnější frakce BC2-EPP (200 mg v 5 ml MeOH smíchaného s 350 mg C18-silikagelu po odpaření) bylo čištění provedeno pomocí extrakční kolony na pevné fázi C18 (2 g/15 ml, Thermo Scientific™, Villebon-sur-Yvette, Francie) s vodou: MeOH 7:3 (10 ml) a vodou: MeOH 6:4 (10 ml). Zkumavky 4–10 byly spojeny za vzniku polární frakce BC2 (BC2_SPE) na základě jejich profilů HPLC-UV (330 nm).

2.10 Antioxidační a anti-AGE testy

2.10.1 Vychytávání radikálů DPPH

Hodnocení DPPH pohlcování radikálů beninských EEP bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve.51 Stručně řečeno, testované vzorky byly zředěny v absolutním EtOH na 0.02 mg/ml ze zásobních roztoků na 1 mg/ml v dimethylsulfoxidu (DMSO). Alikvoty (100 ul) těchto zředěných roztoků byly umístěny do 96-jamkových destiček v triplikátech. Asi 25 ul čerstvě připraveného roztoku DPPH (1 mM) bylo přidáno k 75 ul absolutního EtOH za použití injektoru čtečky mikrodestiček (Infinite® 200, Tecan, Francie), aby se získal konečný objem 200 ul na jamku. Po 30 minutách ve tmě při teplotě okolí byla stanovena absorbance při 517 nm. EtOH byl použit jako slepý pokus, zatímco 10, 25, 50 a 75 μM roztoky Troloxu (hydrofilní analog -tokoferolu) byly použity pro kalibrační křivku. Jako standard kontroly kvality byl použit vzorek ethanolického roztoku kyseliny chlorogenové (0,02 mg/ml). Výsledky byly vyjádřeny jako ekvivalenty Troloxu (mikromoly TE na g extraktu).

2.10.2 Anti-AGE test

Účinky propolisových extraktů a pěti hlavních izolovaných derivátů naringeninu na tvorbu AGE byly stanoveny, jak bylo popsáno dříve.51 Stručně, hovězí sérový albumin (BSA) (10 mg/ml) byl inkubován s D-ribózou ({{ 13}},5 M) spolu s testovanou sloučeninou (3 uM až 3 mM) nebo extraktem (1 ug až 1 mg) v 50 mM fosfátovém pufru při pH 7,4 (NaN3, 0,02 procent). Roztoky byly inkubovány v 96-jamkových mikrotitračních destičkách při 37 °C po dobu 24 hodin v uzavřeném systému před měřením fluorescence AGE. Pro každé měření byla odečtena fluorescence z inkubovaného vzorku za identických podmínek bez D-ribózy. Fluorescence AGE podobná pentosidinu (excitace při 335 nm, emise při 385 nm) byla měřena fluorometrií.52 Hodnoty IC50 byly definovány jako množství extraktu (ug/ml) nebo pozitivní kontroly (μM) potřebné ke snížení tvorby AGE o 50 procent vzhledem k negativní kontrole. Podle statistického validačního testu53 stačí pro přesné stanovení IC50 jediná analýza.

3. VÝSLEDKY A DISKUZE

3.1 Chromatografické profilování

Obecné LC profilování osmi beninských a konžských EPP pomocí kvaziuniverzálního ELSD detektoru ukázalo, že všechny vzorky obsahovaly nepolární sloučeniny, eluované na konci chromatogramů (obrázek 1). BC1 také představovala velké množství polárních sloučenin a BC2 vykazovala některé středně polární sloučeniny v menším množství. Nepolární sloučeniny v CG EEP se zdály být zcela odlišné od beninských.

Profilování ELSD tedy vedlo ke třem různým a originálním vzorkům, jejichž složení bylo dále zkoumáno: BC1, BC2 a CG.

Nejprve byly provedeny analýzy GC-MS, které porovnávaly fragmentaci MS s NIST DB, aby se charakterizovaly chemické třídy a pokud to bylo možné, aby se identifikovaly složky. Předpokládaná identifikace (na základě procenta shody s NIST DB) a chemické třídy sloučenin jsou uvedeny v tabulce 2 (údaje o profilování GC – celkový iontový proud [TIC] jsou uvedeny na obrázku SI-2).

Všechny beninské EEP představovaly stejné profily nepolárních sloučenin, označené písmeny A až F, ale jejich množství se mohlo lišit. Byly údajně identifikovány jako - nebo -amrinon (A), -amyrin (B), lupenon (C), -amyrin (D), - nebo -amyrin acetát (E) a lupeol acetát (F) (srov. obrázek SI -3), již byly popsány jako hlavní NP v mexickém propolisu.54 Zhang et al. (2014) a Tamfu a kol. (2020) také popsali triterpenoidy jako amyrin/lupeol a amyrin/lupeol acetáty v různých vzorcích afrického propolisu.41,55 Pouze BC1 představoval další NP eluované mezi Rt 10 a 15 minutami, které byly podle jejich fragmentačních vzorů navrženy jako methoxylované stilbenoidy nebo fenantreny. Konžská EEP vykazovala odlišný profil od beninských, s ethylestery kyselin C16 a C18 jako těkavějšími sloučeninami spojenými s dobrým skóre shody 94 procent, derivát fenolu při Rt 13,1 min, tři deriváty resorcinolu v rozmezí 14– 17 min a různé typy triterpenových derivátů po Rt 21 min.

Kromě toho byly EPP analyzovány pomocí HPLC-DAD-MS pro vizualizaci netěkavých NP (srov. obrázek SI -4). Různé profilování ukázalo, že BC1 EEP vykazovalo velké množství středně polárních sloučenin s chromofory absorbujícími při 280 nm, stejně jako BC2 v menších proporcích, a CG měl velmi špatný UV profil při 280 nm.

3.2 Chemické složení BC1 a BC2

K identifikaci jejich hlavních NP pomocí 13C NMR dereplikace založené na MixONat a vhodných DB bylo poté dosaženo hrubé frakcionace BC1 a BC2 EEP pomocí flash chromatografie. U BC1 analýza GC-MS skutečně odhalila přítomnost methoxylovaných stilbenoidů nebo fenantrenů, což nás vedlo k vytvoření specifických stilbenoidů_fenantrenoidů DB2. Pro BC2, s výjimkou polárnějších sloučenin při Rt 3,8 min, všechny sloučeniny vykazovaly UV spektra flavanonů-dihydroflavonolů, což naznačovalo vytvoření Flavanonů DB3.

Jak je znázorněno v tabulce 3, dihydrofenantreny 1 a 3–5, fenantreny 2 a 6 a dihydrostilben 7 (obrázek 2) byly navrženy v BC1 EEP společností MixONat a validovány srovnáním s údaji z literatury (srov. podpůrné informace). V případě potřeby byl použit MW filtr na základě dat HPLC-MS.

Přesněji, mezi 9,10-dihydrofenantrenovými deriváty z 2 681 NP v DB2, MixONat navrhl 6-methoxycoelonin (2,7-dihydroxy-3,5-dimethoxy{ {10}},10-dihydrofenantren; 3, pořadí 1, skóre 0,75, čísla SI-13 a SI-14) v BC{{ 18}}F5 a jeho přítomnost byla potvrzena srovnáním s publikovanými NMR daty. Dosud byl identifikován u druhů Combretaceae56 au orchideje Bulbophyllum vaginatum; 57 a 2,7-dihydroxy-3,4,6-trimethoxy- 9,10-dihydrofenantren (4, pořadí 1, skóre 0,88, obrázky SI{{33 }} a SI-16) byla předpokládaná v BC1_F2. Sloučenina 4 již byla popsána v senegalském propolisu58 a její přítomnost byla ověřena na základě údajů publikovaných Pettitem a kol. z afrického stromu Combretum caffrum59 a Lu et al. od Dioscorea nipponica Makino.60

Proces dereplikace založený na 13C NMR také předpověděl 2,6-dihydroxy-3,4,7-trimethoxy-9,10-dihydrofenantren (5, pořadí 8, skóre 0.76, čísla SI-15 a SI-16) v BC1_F2 a 2,6,7-trihydroxy{{20 }},4-dimethoxy-9,10-dihydrofenantren (1, pořadí 2, skóre 0,5, čísla SI-5 a SI-6 ) v BC{{30}}}F6-1, když byl použit molekulární filtr o MW 288 Da. Pro 1 bylo skóre poměrně nízké (0.5); proto byly provedeny další 2D NMR experimenty (heteronukleární vícenásobné kvantové korelace [HMQC], heteronukleární vícenásobná konektivita [HMBC], jaderná spektroskopie Overhauserova efektu [NOESY], srov. obrázky SI-7–SI-10). proveden k potvrzení struktury; pro 5 bylo skóre 0,76, tj. vyšší než 0,70. Tyto dva NP (1 a 5) byly poprvé zmíněny Letcherem et al. u druhů Combretum61,62 a 1 byl již nalezen v senegalském propolisu.58

Mezi deriváty fenantrenu MixONat předpokládal 2,6,7-trihydroxy-3,4-dimethoxyfenantren (2, pořadí 1, skóre 0,88, obrázky SI-11 a SI{{10}}) v BC1_F8-1, což bylo potvrzeno srovnáním s jeho spektrálními daty popsanými Letcherem a kol. v Combretum apiculatum. 61 2,7-dihydroxy-3,4,6-trimethoxyfenantren (6, pořadí 5, skóre 0,94, čísla SI-17 a SI-18) dříve izolovaný z Photolida Chinensis63 byl navržen v BC1_F4.

Combretastatin B{{0}} (7), dihydrostilben, byl navržen společností MixONat na prvním místě (skóre 1,0, obrázky SI-17 a SI-19) v BC1 EPP při použití MW filtr (MW 304 Da) a validováno srovnáním s NMR daty popsanými Pettitem a kol. v Combretum caffrum. 59

Sloučeniny 2, 6 a 7 již byly identifikovány v senegalském propolisu.58

Údaje 1H a 13C NMR 1–7 jsou k dispozici v podpůrných informacích.

Pro BC2 bylo identifikováno sedm sloučenin patřících do dvou strukturních tříd polyfenolů, chromon-C-glukosid a deriváty prenylflavanonu (8–14), z nichž některé byly poprvé popsány v propolisu (obrázek 3).

Proces založený na 13C NMR využívající MixONat a DB1 až DB5 neposkytoval relevantní výsledky naznačující původní NP. Dva hlavní produkty (8–9) byly plně charakterizovány jako směs pomocí hmotnostních spekter a dat 1D a 2D NMR (1H, 13C, HMQC, HMBC, viz obrázek SI-20–SI-23) a identifikovány jako florin (8) a isobiflorin (9), dva chromanon-glukosidy nově popsané v propolisu, dříve popsané v Pancratium biflorum64 a hřebíčku Eugenia caryophyllata, v tomto pořadí.65

Pokud jde o deriváty flavanonu, mezi 688 NP v DB3 navrhl MixONat 6-prenylnaringenin (10, pořadí 1, skóre 0,95, obrázky SI- 24 a SI{{8 }}) již popsán v nigerijském červeném propolisu66 v BC{{10}}}F7-1. 6,8-diprenylaromadendrin (12, pořadí 1, skóre 1.0, čísla SI-28 a SI-29) a 6,8-diprenylnaringenin (lonchocarpol A ) (13, pořadí 10, skóre 0,84, čísla SI-30 a SI-31), dříve nalezené ve vzorcích propolisu z Kamerunu,42 byly ověřeny v BC2_F{ {30}} a BC2_F5. 6-Geranylnaringenin (14, pořadí 1, skóre 0,84, obrázky SI-32 a SI-33), dříve popsaný v propolisu ze Šalamounových ostrovů,67 byl předpokládán a potvrzen v BC{{41 }}F7-5. Nakonec 6-dimethylallylnaringenin (11) navrhl na druhé místo MixONat v BC2_F6 (2. pořadí, skóre 0,65, obrázky SI-26 a SI- 27). Izomer v poloze 8 byl navržen na první pozici, ale srovnání s údaji z literatury 68,69 ukázalo, že jde o izomer v poloze 6. Sloučenina 11 byla nová v propolisu, ale již byla popsána v organických extraktech Monotes africanus. 70 1 Údaje H a 13C NMR 8–14 jsou k dispozici v podpůrných informacích.

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】