Charakterizace předtransplantačního a posttransplantačního rizika odmítnutí ledvin pomocí sekvenování imunitního repertoáru B buněk

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Studium imunitního repertoáru v kontextu transplantace orgánů poskytuje důležité informace o tom, jak může adaptivní imunita přispět a modulovat odmítnutí štěpu. Zde charakterizujeme imunitní repertoár periferní krve jedinců před a poledvinatransplantaci pomocí sekvenování B buněčných receptorů v longitudinální klinické studii. Jedinci, u kterých se po transplantaci rozvine rejekce, mají před transplantací rozmanitější imunitní repertoár, což naznačuje predispozici k riziku rejekce po transplantaci. Navíc během 2 let sledování pacienti, u kterých se vyvinula rejekce, prokázali specifickou sadu expandovaných klonů, které přetrvávají i po rejekci. I když došlo k celkovému snížení diverzity periferních B buněk, pravděpodobně v důsledku zvýšené obecné imunosupresivní expozice v této kohortě, detekce použití specifického genu IGHV u všech odmítajících pacientů podporuje, že společný soubor imunogenních antigenů může vést k posttransplantační rejekci. Naše zjištění mohou mít klinické důsledky pro predikci a klinickou léčbu rejekce transplantátu ledviny.

ledvinytransplantace je preferovanou léčbou konečného stádia renálního onemocnění (ESRD) a chronickéledvinachoroba. I když došlo k významným zlepšením v technologiích a tkáňovém párování na základě testování histokompatibility pro lidské leukocytární antigeny dárce/příjemce (HLA)1, předpovídání výsledku štěpu je stále nevyřešeným problémem. Naměřená tkáňová neshoda na jiných menších, non-HLA lokusech23 může také vést k aloimunitnímu poškození s akutní a chronickou rejekcí, což má za následek špatné dlouhodobé výsledky štěpu4. Navíc kolem 50 procentledvinaaloštěpy bez větších neshod HLA jsou stále ztraceny do 10 let po transplantaci². Již dříve jsme předpokládali, že non-HLA lokusy mohou ovlivnit imunitní odpověď příjemce proti jeholedvinadonor graft6. More research needs to be done to better understand and predict the recipient's risk of rejection to substantially improve long-term patient and graft outcomes. Nevertheless, the diversity of the immune response to various immunogenic epi-topes is as yet, poorly understood. The role of T cells in organ transplant rejection has been demonstrated, but there is increasing appreciation of the additional role of B cells and antibodies in triggering this process8. In this regard, B-cell receptor sequencing(BCRSeq)is a promising high-throughput technique that allows the sequencing of millions of Immunoglobulin (Ig)regions in parallel to study the immune response. The key feature of B cells is their enormous diversity. Each individual is capable of producing >1013 různých protilátek0, ​​což jim umožňuje rozpoznat širokou škálu cizích antigenů. Lidské BCR nebo Ig se skládají ze dvou identických těžkých řetězců (I) tvořených pěti izotypy: IgM, IgD, IgA, IgE a IgG a dvěma lehkými řetězci. Intaktní protilátka obsahuje variabilní a konstantní doménu. Vazba antigenu nastává ve variabilní doméně, která je generována rekombinací sady variabilních (V), diverzních (D) a spojujících (J) genových segmentů tvořících imunitní repertoár B-buněk, a její diverzita se koncentruje hlavně v komplementární určující oblast 3 (CDR3). Během procesu afinitního zrání dochází ve variabilní oblasti k somatické hypermutaci (SHM). Silná adaptivní imunitní odpověď je závislá na expanzi klonů B-buněk a procesu zvaném afinitní zrání, během kterého se do přeuspořádání Ig genu zavedou somatické mutace a vyberou se B buňky s vyšší afinitou pro daný antigen.

Studium imunitního repertoáru při transplantaci orgánů je zásadní pro pochopení toho, co spouští a udržuje proces odmítnutí a jak může nakonec urychlit cestu k selhání štěpu. Díky pokrokům v sekvenování nové generace a robustním výpočetním přístupům můžeme studovat oblast VDJ do jemných detailů12. K dnešnímu dni analýza imunitního repertoáru T-buněk vledvinatransplantace byla provedena u velmi omezeného počtu pacientů3-15, a přestože byl BCRSeq aplikován na jiná onemocnění a lidské imunitní reakce, jako je roztroušená skleróza6, vakcína proti chřipce7 nebo poruchy imunitního systému8, chybí studie o transplantaci odmítnutí. Vledvinatransplantaci, BCRSeq byl proveden pouze v rámci tolerance, HLA senzibilizovánledvinakandidátů na transplantaci podstupujících desenzibilizační terapii20 a infiltraci B-buněk porovnávající klonální expanzi v krvi a štěpu2l. Další aplikace na BCRSeq v transplantaci byla dříve publikována v malé kohortě 12 příjemců transplantátu srdce.

Uvědomujeme-li si důležitost humorální větve imunitní odpovědi při pozdní rejekci transplantátu a chronickém selhání aloštěpu, charakterizujeme imunitní repertoár periferní krve pomocí BCRSeq v prospektivní, longitudinální studii. Zjistili jsme, že diverzita imunitního repertoáru před transplantací je vyšší u jedinců, kteří transplantaci odmítajíledvinaukazující také expanzi určitých klonů a IGHV genů během 24 měsíců sledování. Tyto výsledky mohou pomoci předpovědět riziko rejekce před engraftmentem a mohou mít klinické důsledky při detekci konkrétních antigenů, které rejekci řídí.

Cistanche je dobrá pro funkci ledvin

Výsledek

Studijní předměty. Provedli jsme BCRSeq v 83 vzorcích periferní krve od 27 unikátních pacientů a provedli jsme analytický pipeline znázorněný na obr.1. V této studii byly uvažovány tři klinické fenotypové skupiny definované zaslepenými centrálními patologickými čteními sériových biopsií aloštěpu hodnocených podle Banffových kritérií23,24 a skóre indexu chronického poškození aloštěpu (CADI): Non-progressors (NP; n{6}}) měli nízké neinkrementální skóre CADI bez akutní rejekce, progresoři bez rejekce (PNR;n=10) ​​měli inkrementální skóre CADI během 2 let bez rejekce a progresoři s rejekcí (PR; n=7) měli přírůstkové vysoké skóre CADI během 2 let s epizodami odmítnutí. Demografie, příčinyledvinaselhání a použití imunosuprese je uvedeno v tabulce 1. Je důležité zdůraznit některé charakteristiky těchto pacientů. Rodičovská studie, ze které byli tito pacienti zařazeni, měla celkově nízkou míru (17 procent) biopsií potvrzeného akutního odmítnutí (průměr{min, max}=12 {6,24}měsíční doba odmítnutí). Všichni tito pacienti byli vystaveni nízkému imunologickému riziku rejekce (stav senzibilizace reaktivních protilátek na nejvyšším panelu<20%), and="" also="" had="" low="" rates="" of="" generation="" of="" donor-specific="" antibody(dsa)and="" only="" two="" of="" the="" rejection="" phenotype="" patients="" included="" in="" the="" analysis="" had="" dsa.="" the="" generation="" of="" dsa="" to="" hla="" and="" mica="" was="" measured="" in="" all="" serial="" sera="" throughout="" the="" study25.="" national="" experience="" with="" similar="" immunosuppressive="" protocols="" in="" similar="" patient="" cohorts="" have="" confirmed="" similar="" good="" clinical="" outcomes="" and="" low="" rejection="">

Sekvenování imunitního repertoáru B-buněk. BCRSeq byl proveden na vzorcích genomové DNA (gDNA) extrahovaných z krevních sraženin na 81 vzorcích z 27ledvinapříjemců transplantátu ve třech časových bodech (0,6,24 měsíců). Sekvenování dosáhlo celkového počtu 327 703 čtení (průměr 4045/vzorek) po kontrole kvality (viz část metod). Pro validaci výsledků a další hodnocení každého izotypu jsme dodatečně extrahovali RNA z odpovídajících PBMC, které byly k dispozici pro 55 vzorků, odebraných ve stejnou dobu jako krevní sraženina a provedli jsme komplementární sekvenování DNA (cDNA) ve větší hloubce a získali 1 773 330 čtení. pro IgD (průměr 31 667/vzorek), 1 708 227 čtení pro IgM (průměr 30 504/vzorek), 973 444 čtení pro IgA (průměr 17 383/vzorek), 139 7345 čtení pro IgG9 (průměr 32/27 vzorků), IgG9 (průměr 27 }} uvádí IgE (průměr 5178/vzorek) (doplňkový obrázek 1). Knihovny pro každý izotyp byly amplifikovány odděleně a poté spojeny pro sekvenování; proto není srovnávací zkřížená izotypová analýza proveditelná.

Jak je znázorněno na obr. 1b, definovali jsme klon jako skupinu buněk pocházejících ze společné molekuly předka, která má stejný segment IGHV a IGHJ, stejnou délku CDR3 a 90% nukleotidovou identitu mezi CDR3, jak bylo dříve definováno ve studiích adaptivního B -odpovědi buněk'8. Tato definice umožňuje studovat diverzitu, sdílené nebo společné kužely a klonální expanzi v kontextu aloimunity vledvinatransplantace. Počet jedinečných kuželů na jednotlivce v každém časovém bodě je zobrazen jako barplot v doplňkovém materiálu (doplňkový obr. 1). Pro přísnost analýzy dat jsme vzorky zlevnili<100 clones="" (69="" samples="" from="" gdna="" and="" 55="" samples="" from="" cdna="" were="" left="" for="" further="" study.="" ige="" isotype="" was="" discarded="" completely="" due="" to="" a="" very="" small="" number="" of="" reads).="" in="" addition,="" we="" filtered="" outpatient="" 8="" in="" the="" np="" group="" from="" subsequent="" analysis,="" as="" we="" recognized="" after="" the="" run,="" that="" he="" had="" developed="" ebv+post="" transplant="" lymphoproliferative="" disease(ptld)at="" 2.2="" years="" post="">ledvinatransplantaci, vyznačující se proliferací Epsteina Barra

Obr. 1Celkový sled studie.a Schematické znázornění struktury protilátek a procesu rekombinace VDJ odpovědné za diverzitu produkovanou imunitním repertoárem.b B-buněčný klon definovaný jako buňky od společného předka a c analytický řetězec studie: B-buňka sekvenování pro gDNA a cDNA, analýza diverzity s ohledem na počet klonů (bohatost) a frekvenci každého klonu (Shannonova entropie), síťová analýza a klonální a IGHVgenová analýza

B buňky infikované virem (EBV). U tohoto pacienta jsme pozorovali zvýšený počet klonů v čase 6, dříve s nižší klonální diverzitouledvinatransplantaci a 24 měsíců po transplantaci ledviny. Protože knihovny byly amplifikovány z neměnného množství templátu, vyšší frakce B buněk v krvi mohla vést k většímu počtu klonotypů zastoupených v sekvenovaných produktech. Vzhledem k odlišnému a jedinečnému patologickému procesu u tohoto pacienta byl tento vzorek vyloučen z budoucí analýzy.

Předtransplantační diverzita B-buněk je spojena s rejekcí. Jak je znázorněno na obr. 1c, zkoumali jsme diverzitu imunitního repertoáru B-buněk s ohledem na druhovou bohatost (počet jedinečných klonů) a Shannonovu entropii (rovnice (1) z metod) napříč časovými body a klinickými výsledky pomocí lineárního regresního modelu s ohledem na počet klonů nebo entropie jako závislé proměnné a klinického výsledku nebo SHM jako proměnné nezávislého faktoru. Repertoár předtímledvinatransplantace v PR byla podstatně rozmanitější než v NP (bohatost: P-hodnota=0,005, entropie: P-hodnota=0,01) se stejným trendem přetrvávajícím 6 měsíců poledvinatransplantace (bohatost: P-hodnota=0.02, entropie: P-hodnota=0,02) a bez rozlišitelných skupinových rozdílů 2 roky po transplantaci (obr. 2a a doplňkový obr. 2). Údaje o sekvenování cDNA po transplantaci ukázaly stejný trend ve větší rozmanitosti repertoáru 6 měsíců po transplantaci, převážně pro izotypy IgD (bohatost: P-hodnota=0.02, entropie: P-hodnota=0. 03) (obr. 2b a doplňkový obr. 2). Nebyl zjištěn žádný matoucí vliv na data z různých demografických a klinických proměnných, jako je věk příjemce, pohlaví, rasa, zdroj dárce, typ imunosuprese, HLA nesoulad a příčina selhání ledvin. Protože reakce B-buněk u 1-letého (minimální věk v datech) a 19-letého (maximální věk v datech) se může velmi lišit, provedli jsme citlivost analýzy s vyloučením těchto dvou pacientů a výsledky zůstaly významné (NP vs. PR v čase 0: bohatost: P-hodnota=0,01, entropie: P-hodnota=0,03). V dalším měření diverzity imunitního repertoáru jsme hodnotili SHM, definovaný jako četnost mutací v každém segmentu V genu, a našli trend pro vyšší počet SHM pro PR před transplantací a trend pro vyšší SHM v izotypu IgD v PR 6 měsíců po transplantaci (hodnota P=0.06).

Diverzita B-buněk se v průběhu času mění podle klinického výsledku. Abychom zjistili, zda se diverzita imunitního repertoáru mění v průběhu času podle klinického výsledku, modelovali jsme longitudinální data pomocí lineárních modelů se smíšeným účinkem s ohledem na interakci mezi klinickým výsledkem a časem. Zjistili jsme, že NP a PR se chovaly odlišně v průběhu času po transplantaci, což ukazuje na zvýšení diverzity v NP a snížení diverzity v PR, zatímco pro PNR zůstala diverzita v průběhu času neměnná. To bylo pozorováno pro gDNA (bohatost: P-hodnota=0.007, entropie: P-hodnota=0.001, obr. 3a) a všechny izotypy pro cDNA, přičemž nejvýraznější rozdíly v entropii byly pro izotypy IgM a IgD (IgA: P-hodnota=0,07, IgD: P-hodnota=0,02, IgG: P-hodnota=0,05, IgM: P-hodnota=0.04, obr. 3b). Grafy pro bohatost s odpovídajícími hodnotami P jsou znázorněny na doplňkovém obrázku 3. Jak je na grafech pozorováno, jeden jedinec má vzorek navíc v čase 32 měsíců, což by mohlo zkreslit výsledky, a proto byla provedena analýza citlivosti s vyloučením tohoto vzorku z analýza a pozorování podobných výsledků s výjimkou izotypů IgG a IgM, kde se významnost ztrácí (entropie gDNA: P-hodnota=0.004. entropie cDNA: IgA: P-hodnota=0.1 , IgD: P-hodnota=0,05, IgG: P-hodnota=0,08, IgM: P-hodnota=0,1).

Opatření zaměřená na rozmanitost mohou být ovlivněna biologickými a technickými odběry vzorků. Diverzita vzorku se může výrazně lišit od celkové diverzity v repertoáru, protože je zastoupen pouze zlomek miliard buněk, což je známé jako problém chybějících druhů. Technické vzorkování může existovat, protože každý vzorek se může lišit hloubkou sekvenování a určitým stupněm experimentálních chyb. K řešení problému chybějících druhů jsme použili nástroj Recon (rekonstrukce odhadovaných klonů z pozorovaných čísel)29, který odhaduje celkovou distribuci velikosti klonů. Recon poskytuje přesné a robustní odhady souboru měření diverzity, včetně bohatosti a entropie, což umožňuje robustní srovnání diverzity mezi jednotlivci. Abychom se vypořádali s hloubkou sekvenování a určitým stupněm experimentálních chyb, provedli jsme strategii downsamplingu; velmi dobře používaná strategie v analýze imunitního repertoáru11,17,30. V analýze Recon (doplňkový obrázek S4: A–E) byly pro data gDNA replikovány jak bohatost, tak rozmanitost. V datech cDNA izotyp IgD v čase 6 ukazuje trend, ale nedosáhl významnosti, ačkoli longitudinální výsledky pro izotypy IgA, IgD a IgG byly replikovány. V analýze downsamplingu (doplňkový obrázek S4: F–J) je vše replikováno, ale čas je 0 pro data gDNA. To může být důsledek omezení, které spočívá v převzorkování

Obr. 2 Houslové grafy ukazující počet klonů (bohatost) napříč třemi klinickými výsledky. určitý počet klonů v časech 0, 6 a 24 ze vzorků gDNA. b Počet klonů v čase 6 pro izotyp IgD ze vzorků cDNA. P-hodnoty se získají z úpravy lineárního regresního modelu s ohledem na počet klonů jako závislou proměnnou a klinický výsledek jako proměnnou nezávislého faktoru (n=27 vzorků). Houslové grafy představují hustotu pravděpodobnosti dat pro každou hodnotu. Bodová značka představuje střední hodnotu s mezikvartilovým rozsahem. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor

Obr. 3 Podélná data vynesená s proloženou čarou pro každý klinický výsledek. a Diverzita měřená Shannonovou entropií reprezentovaná napříč časovými body třemi klinickými výsledky (NP, PNR, PR) v gDNA. b Diverzita měřená Shannonovou entropií reprezentovaná napříč časovými body třemi klinickými výsledky (NP, PNR, PR) podle izotypů v cDNA. P-hodnoty odpovídají interakčnímu členu definovanému jako čas × klinický výsledek s úpravou lineárního modelu smíšeného účinku (n=27 vzorků). Každá tečka představuje entropii na vzorek v čase s proloženou čarou a intervalem spolehlivosti. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor

strategie implikované, zejména na datech gDNA, kde je počet sekvencí mnohem nižší než u dat cDNA. V gDNA jsme analýzu omezili na jedince s alespoň 1000 klony, abychom zachovali dostatek sekvencí. Down-sampling byl proveden na minimum 1062 klonů ve srovnání s 62 173 klony v cDNA. Přes toto omezení jsme pozorovali trend pro čas 0, zachovali jsme význam pro longitudinální analýzu v gDNA a replikovali jsme všechny asociace v cDNA. V obou analýzách (recon a downsampling) jsme replikovali výsledky, navzdory některým omezením zde zdůrazněným, což ukazuje platnost dříve hlášených výsledků.

Sítě B-buněk vykazují rozdíly v klonální expanzi. Repertoár B-buněk může být přirozeně reprezentován jako síť založená na sekvenční diverzitě31. V našich datech jsme vyvinuli vizuální síť pro každý vzorek (obr. 4 a doplňkové obrázky 5–7), kde každý vertex představoval jedinečný BCR a počet identických BCR na základě jejich nukleotidových sekvencí definoval velikost vertexu. Mezi vrcholy existuje hrana, pokud patří ke stejnému klonu, takže shluky B buněk lze zobrazit jako skupiny vzájemně propojených vrcholů tvořících klon. Ke kvantifikaci sítě jsme použili Giniho index, což je míra nerovnoměrnosti, která byla aplikována na vertexové a clusterové distribuce. Při aplikaci na velikost vrcholu, Gini(V), je reprezentována celková klonální povaha. Pokud je Gini(V) blíže k 1, vrcholy jsou nestejné a zobrazují expanzi některých z nich, a jinak jsou blíže k 0. Při aplikaci na velikost shluku, Gini(C), je reprezentována klonální dominance. Pokud jsou blíže k 1, jsou shluky nestejné, a proto představují dominantní klony, pokud jsou blíže k 0, jsou všechny shluky stejně velké.

Na obr. 4 ukazujeme příklad výrazných vizuálních a kvantitativních rozdílů mezi reprezentativními repertoáry B-buněk z každé ze tří skupin klinických výsledků ve třech různých časových bodech (před transplantací a po transplantaci 6 a 24 měsíců) . V repertoáru PR je množství B-buněčných sekvencí tvořících více a větších shluků klonů ve srovnání s NP, zatímco PNR se nachází mezi nimi. V průběhu času skupina PR vykazuje pokles počtu BCR a jedinečných klonů ve srovnání s NP. Podrobné sítě B-buněk každého jednotlivce ve studii jsou uvedeny na doplňkových obrázcích. 5–7. Je zajímavé pozorovat velmi rozmanitý vzor sítě B-buněk u jedince, u kterého se vyvinula PTLD ve skupině NP (doplňkový obrázek 5), bez expanze B-buněk před transplantací, po čemž následoval nárůst B-buněk po 6. měsíců a jasnou klonální expanzi doprovázenou poklesem diverzity 24 měsíců po transplantaci.

Při dalším hodnocení míry Giniho indexu (obr. 5) skupina PR konzistentně vykazovala významně vyšší míry pro vertex i shluk oproti skupině NP, což naznačuje, že pacienti ve skupině PR měli vyšší klonální expanzi na začátku,

Obr. 4 Repertoárové sítě B-buněk od tří jedinců představující tři klinické výsledky napříč časovými body. Každý vertex představuje jedinečný BCR, což je velikost vertexu definovaná počtem identických BCR s ohledem na nukleotidové sekvence. Hrana existuje mezi vrcholy, pokud patří ke stejnému klonu, jak bylo definováno dříve, takže shluky jsou skupiny vzájemně propojených vrcholů tvořících klon. Každý vzorek ukazuje index gini získaný pro velikost vrcholu (Gini(V)) a velikost shluku (Gini(C)). BCR odráží celkový počet B-buněčných receptorů pro tento specifický vzorek a klony odrážejí celkový počet jedinečných klonů. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor

a další potransplantační expanzi podskupiny dominantních klonů (P-hodnota [lineární regrese] < 0.05,="" obr.="" 5).="" skupina="" pnr="" spadá="" mezi="" np="" a="" pr,="" jak="" bylo="" ukázáno="" dříve,="" i="" když="" tato="" doba="" je="" významně="" odlišná="" od="" skupiny="" np="" v="" čase="" 24="" (p-hodnota="" [lineární="" regrese]="">< 0,05).="" ačkoli="" data="" pro="" obr.="" 5="" byla="" vytvořena="" z="" dat="" gdna,="" izotyp="" igm="" pro="" cdna="" vykazoval="" stejné="" rozdíly="" (p-hodnota="" [lineární="" regrese]="0.05)" (doplňkový="" obr.="">

Některé klony a geny IGHV se podílejí na odmítnutí.

Ačkoli naším primárním cílem bylo charakterizovat repertoár B-buněk podle skupin s klinickými výsledky, což poskytuje globální obraz imunitní odpovědi před a po transplantaci, naše data nám také umožnila provést analýzu specifickou pro Ig sekvenci u klonu a IGHV. genová úroveň.

Pro klonální analýzu jsme hodnotili asociaci přítomnosti nebo nepřítomnosti každého konkrétního klonu (celkem 118 223 klonů) s klinickým výsledkem (PR, PNR, NR) v každém časovém bodě. Aplikováním Fisherova exaktního testu jsme našli 8, 4 a 21 klonů nominálně spojených s klinickými výsledky v každém z 0, 6 a 24 měsíců, v daném pořadí (doplňková tabulka 1). Zatímco žádný neprošel opravou vícenásobného testování, hlavně kvůli nedostatku výkonu, protože máme omezenou velikost vzorku v analýze s tisíci parametry (klony), mohli jsme pozorovat, že těch několik klonů, které se přiblížily významnosti (P-hodnota < {{="" 11}}.05)="" byly="" sdíleny="" mezi="" pacienty="" pouze="" ve="" skupině="" pr="" a="" obohaceny="" 24="" měsíců="" po="">

Zvažovali jsme také, zda některé klony přetrvávaly po dobu odběru vzorků, více než jiné, v rámci každého klinického výsledku (doplňkový obrázek 9). Zvažujeme dvě různá měřítka: (1) počet přetrvávajících klonů a (2) klonální expanzi. Pozorovali jsme, že klony, které byly persistentní v PR, byly výrazně více expandované (P-hodnota [lineární regrese]=0.01, PR vs. NP) a vykazovaly trend vyššího počtu persistentních klonů (P- hodnota [lineární regrese]=0.09). Dále jsme zkoumali, zda tyto perzistentní klony byly také sdíleny mezi různými jednotlivci v každém klinickém výsledku. Z 263 detekovaných perzistentních klonů bylo 23 sdíleno mezi jednotlivci. Pět bylo sdíleno v rámci stejné PNR a šest v rámci skupiny PR a mezi skupinou NP nebyly sdíleny žádné klony. Celkem 12 sdílených klonů bylo společných pro obě skupiny pacientů s progresivním chronickým transplantačním poškozením a fibrózou v průběhu času (PR a PNR). Seznam klonů sdílených mezi jednotlivci je uveden v doplňkovém materiálu (doplňková tabulka 2).

Dále jsme provedli analýzu genu IGHV, přičemž jsme se podívali na využití genu IGHV na vzorek, definovanou jako počet použití každého genu IGHV, normalizovanou počtem klonů (abychom se vyhnuli vzorkování určitých genů IGHV), odfiltrováním nízko exprimovaných genů

Obr. 5 Vertex Gini Index vynesený proti Cluster Gini Index. Bodový graf představuje každý vzorek v časech 0, 6 a 24. Boxplochy ukazují rozdíly Gini(V) a Gini(C) v čase 24. P-hodnoty jsou získány z úpravy lineárního regresního modelu uvažování Gini(V) a Gini(C) jako závislé proměnné a klinického výsledku jako nezávislé proměnné faktoru pro každý časový bod (n=27 vzorků). V krabicovém grafu je zobrazen pouze čas 24, ale čas 0 a 6, kde jsou také významné pro NP vs. PR: čas 0: P (Gini (V))=0.1, P ( Gini(C))=0.05; čas 6 P (Gini(V))=0,02, P (Gini(C))=0,01; čas 24: P (Gini(V))=0.003, P (Gini(C))=0.01. Pás uvnitř rámečku představuje střední hodnotu, rámeček definuje mezikvartilové rozmezí (IQR) a vousy definují první a třetí kvartil ± 1,5 × IQR. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor

geny (použití genu IGHV > {{0}}.05 v alespoň 10 procentech vzorků) a použití lineárního regresního modelu k nalezení těch genů, které byly asociovány s každým klinickým výsledkem, v každém časovém bodě. Z 27 genů IGHV, které prošly filtrem s nízkou expresí, jsme našli významné geny mezi skupinou PR a NP (hodnota P < 0,05)="" se="" třemi="" geny="" v="" čase="" 0,="" 7="" v="" čase="" 6="" a="" 16="" v="" čase="" čas="" 24="" (obr.="" 6a–c).="" z="" těchto="" genů="" 1="" (ighv3-11)="" v="" čase="" 0,="" 5="" genů="" (ighv3-7,="" ighv3-15,="" ighv3-21,="" ighv3-23,="" ighv{="" {22}})="" v="" čase="" 6="" a="" 16="" genů="" (ighv1-8,="" ighv1-18,="" ighv1-46,="" ighv2-="" 5,="" ighv3-7,="" ighv{{="" 30}},="" ighv3-15,="" ighv3-23,="" ighv3-30,="" ighv3-33,="" ighv3-48,="" ighv3-74,="" ighv{{37="" }},="" ighv4-59,="" ighv4-61,="" ighv5-51)="" v="" čase="" 24="" prošlo="" vícenásobnou="" opravou="" testu="" false="" discovery="" rate="" (fdr).="" je="" zajímavé,="" že="" jsme="" zjistili,="" že="" ighv3-23="" byl="" nejvýznamnější="" a="" nejhojnější="" gen="" ve="" všech="" třech="" časových="" bodech="" v="" porovnání="" np="" vs.="" pr="" (čas="" 0:="" p-hodnota="0,04," čas="" 6:="" p-="" hodnota="0.003," čas="" 24:="" p-hodnota="0.02)" (obr.="" 6d).="" kromě="" toho="" jsme="" hodnotili,="" zda="" byly="" sekvence="" ighv3-23="" nadměrně="" zastoupeny="" mezi="" sdílenými="" sekvencemi="" z="" předchozí="" klonální="" analýzy.="" pomocí="" analýzy="" obohacení="" pomocí="" fisherova="" exaktního="" testu="" jsme="" zjistili,="" že="" sekvence="" ighv3-23="" byly="" významně="" nadměrně="" zastoupeny="" v="" obou,="" perzistentní="" klony="" sdílené="" mezi="" jednotlivci="" (doplňková="" tabulka="" 2)="" (hodnota="" p="">< 2,2="" ×="" 10="" −="" 16="" )="" a="" klony="" spojené="" s="" klinickým="" výsledkem="" v="" čase="" 24="" (doplňková="" tabulka="" 1)="" (hodnota="" p="">< 2,2="" ×="" 10–16).="" pozorovali="" jsme,="" že="" jednotlivec="" 9="" ve="" skupině="" nr,="" u="" kterého="" bylo="" zjištěno,="" že="" sdílí="" některé="" perzistentní="" klony="" s="" progresory="" v="" předchozích="" analýzách,="" byl="" ve="" všech="" časových="" bodech="" klasifikován="" se="" skupinou="" pr.="" nebyl="" zjištěn="" žádný="" matoucí="" vliv="" na="" data="" z="" různých="" demografických="" a="" klinických="" proměnných,="" jako="" je="" věk="" příjemce,="" pohlaví,="" rasa,="" zdroj="" dárce,="" typ="" imunosuprese,="" hla="" nesoulad="" a="" příčina="" selhání="" ledvin.="" kromě="" toho="" bylo="" také="" zjištěno,="" že="" tento="" gen="" je="" významný="" v="" obou="" izotypech="" igm="" (p-hodnota="" [lineární="" regrese]="0.008)" a="" igd="" (p-hodnota="" [lineární="" regrese]="0.05)" na="" základě="" cdna="" 24="" měsíců="" po="" transplantaci,="" v="" souladu="" s="" předchozími="" výsledky,="" které="" ukazují="" shodu="" s="" těmito="" dvěma="" izotypy,="" které="" jsou="" nejvíce="" obohaceny="" ve="" skupině="" pr.="" pouze="" tři="" další="" geny="" byly="" shledány="" jako="" významné="" v="" analýze="" cdna="" a="" všechny="" byly="" 24="" měsíců="" po="" transplantaci="" u="" izotypů="" igd="" a="" igm="" (ighv3-15="" a="" ighv4-="" 61="" u="" igd="" a="" ighv4-39="" v="" roce="">

Diskuse

Rozmanitost je základní charakteristikou imunitního systému a u zdravých lidí je rozhodující proti patogenům, aby se vypořádali s nemocemi. Při transplantaci orgánů se klinicky zavádí záměrná terapeutická manipulace, která umožní cizí orgán aktivně ignorovat nebo přijmout imunitním systémem vlastního pacienta, aby nedošlo k aloimunitní reakci vedoucí k odmítnutí. B buňky jsou důležitou složkou tohoto procesu a naše skupina a další ukázaly, že jsou klíčové jak při prezentaci antigenu32,33, tak při produkci aloprotilátek34,35. V této práci jsme použili vysoce výkonné sekvenování B-buněk, abychom lépe porozuměli diverzitě a klonalitě B-buněk vledvinaoběhu příjemce transplantátu, jak před přihojením, tak po 24 měsících sledování, s longitudinálním hodnocením imunitního repertoáru B-buněk. Celkově naše analýza ukazuje vyšší diverzitu B-buněk před přihojením, podélné rozdíly s poklesem diverzity doprovázeným klonální expanzí a zvýšením využití určitých genů IGHV mezi těmi, kteří štěpy odmítají.

Klíčovou nesplněnou klinickou potřebou transplantace orgánu je nedostatek neinvazivní, citlivé a přesné predikce transplantačního poranění a špatných výsledků. Tento úkol je komplikován skutečností, že existují různé faktory, které ovlivňují přežití štěpu36. V této studii jsme zjistili, že stabilní jedinci měli před transplantací sníženou diverzitu imunitního repertoáru B-buněk ve srovnání s těmi, kteří orgán odmítli. Dalším krokem by mělo být prokázání prediktivní hodnoty diverzity repertoáru B-buněk, poskytnutí potenciálních lepších biomarkerů pro predikci rejekce před přihojením a možnost implementace do klinické péče a volby imunosuprese před a poledvinatransplantace. Pokud je tato vlastnost výsledkem jakéhokoli faktoru přispívajícího ke snížení diverzity u stabilních jedinců, jako jsou faktory prostředí nebo genetické faktory, mohli bychom odmítnutí nejen předvídat, ale také mu zabránit. Velmi nedávná zjištění skutečně ukázala, že změny v imunitním systému jsou řízeny environmentálními a genetickými faktory37,38. V naší studii jsme nenalezli žádnou souvislost s žádnými demografickými a jinými klinickými charakteristikami pacienta (věk, pohlaví, rasa, imunosuprese, zdroj orgánů, neshody HLA a ESRD). V tomto ohledu potřebujeme novou analýzu, která by potvrdila, zda specifické faktory ovlivňují rozmanitost repertoáru B-buněk a výsledky transplantací.

Další zajímavé zjištění v naší studii ukazuje, že imunitní repertoár se v průběhu času chová odlišně v závislosti na skupině klinických výsledků. U těch, kteří vykazují posttransplantační odmítnutí orgánu, je diverzita B-buněk zpočátku vyšší a pak se časem snižuje, zatímco opačný trend diverzity je pozorován u pacientů, u kterých nedochází k rejekci nebo chronickému poškození štěpu. I když všichni jedinci dostávali po transplantaci stejnou imunosupresivní zátěž, určité možné vysvětlení snížené diverzity u pacientů, u kterých se vyvinula rejekce, může souviset se skutečností, že tito pacienti dostávají dočasně výrazně zvýšenou zátěž imunosupresí pro léčbu rejekce a poté se drží na vyšší základní linii. Ačkoli by to mohlo vysvětlit snížení diverzity B-buněk v průběhu času a vysvětlit rozdíl 24 měsíců po transplantaci, je nepravděpodobné, že by to byla příčina, protože snížená diverzita ve skupině PR je

Obr. 6 Heatmap a boxplot pro analýzu využití genů IGHV. Teplotní mapa zobrazující geny IGHV vybrané jako nominálně významné (P-hodnota < 0.05)="" v="" čase="" 0="" (a),="" 6="" (b)="" a="" 24="" (c)="" pro="" np="" vs.="" pr.="" červená="" barevná="" škála="" představuje="" expresi="" každého="" genu="" ve="" vzorcích.="" pásy="" nahoře="" ukazují="" klinický="" výsledek="" a="" příčinu="" esrd.="" boxplot="" zobrazující="" ighv3-23="" výraz="" v="" časových="" bodech="" pro="" np="" vs.="" pr="" (čas="" 0:="" p-hodnota="0,04," čas="" 6:="" p-hodnota="0,003," čas="" 24:="" p="" -hodnota="0.02)" (d).="" pás="" uvnitř="" rámečku="" představuje="" střední="" hodnotu,="" rámeček="" definuje="" mezikvartilové="" rozmezí="" (iqr)="" a="" vousy="" definují="" první="" a="" třetí="" kvartil="" ±="" 1,5="" ×="" iqr.="" p-hodnoty="" se="" získají="" z="" úpravy="" lineárního="" regresního="" modelu,="" který="" bere="" v="" úvahu="" v="" geny="" jako="" závislou="" proměnnou="" a="" klinický="" výsledek="" jako="" nezávislou="" proměnnou.="" (n="12" vzorků).="" zdrojová="" data="" jsou="" poskytována="" jako="" zdrojový="" datový="">

také pozorováno 6 měsíců po transplantaci, v době, kdy se u pacientů ještě nerozvinula rejekce, což naznačuje, že se pravděpodobně účastní další aktivní procesy. Pozorování selektivní klonální expanze s dominantnějšími klony pouze u pacientů, u kterých se rozvine rejekce a/nebo progresivní chronickáledvinapoškození transplantátu, naznačuje biologicky relevantní, alloantigenem řízenou selekci, perzistenci a expanzi určitých klonů v průběhu času, což odpovídá za celkové snížení časové diverzity. I když můžeme předpokládat, že expanze těchto klonů je pravděpodobně spojena s aloimunitním poškozením štěpu, přímý důkaz, že expanze těchto klonů je aloimunní, vyžaduje další studie in vitro a na zvířatech.

Akutní rejekce zůstává nejsilnějším negativním faktorem pro dlouhodobé přežití štěpu navzdory rychlým zlepšením imunosupresivních terapií39,40. Tato studie také zjišťuje souvislost použití některých genů IGHV s rejekcí, ačkoli kauzální souvislost by měla být prozkoumána v budoucích studiích. IGHV3-23 je nejzajímavější gen v analýze gDNA, protože se výrazně častěji používá u pacientů, u kterých dojde k odmítnutí ve všech měřených časových bodech, a je nadměrně zastoupen v perzistentních klonech sdílených mezi jednotlivci a klonech obohacených mezi odmítnuté pacienty 24 měsíců po transplantaci. Tento gen je také validován 24 měsíců po transplantaci u izotypů IgD i IgM v analýze cDNA. IGHV3-23 je značně spojován se špatnou prognózou u chronické lymfocytární leukémie41 a bylo prokázáno, že velká většina sekvencí IGHV3-23 si zachovala schopnost zprostředkovat interakce superantigenu42. Superantigeny B-buněk jsou produkovány viry a bakteriemi, o nichž je známo, že se vážou na imunoglobuliny mimo konvenční místa vázající antigen43. Bylo ukázáno, že setkání B buněk se superantigenem indukuje proliferaci, aktivaci, migraci a deleci44. V transplantovanýchledvinaexistuje možnost kontinuální expozice virovým a bakteriálním antigenům souvisejícím buď s etiologií primárního vezikoureterického refluxu jako příčiny ESRD nebo sekundárního refluxu moči po reimplantaci transplantovaného močovodu, nebo refluxu po infekci močových cest, riziko vzniku která se zvyšuje s expozicí chronické imunosupresi po transplantaci. Výsledky analýz jsme mimo jiné klinické a demografické faktory upravili o příčinu selhání ledvin; dříve diskutované výsledky zůstávají významné, i když jsme si uvědomili, že NP nesprávně klasifikovaný pacient v analýze (obr. 6) měl refluxní chorobu. Cheng a kol. již dříve také zjistili, že klony v bioptické tkáni příjemců transplantátu ledviny infiltrované B buňkami měly mezi ostatními převahu genu IGHV3-2345. Grover et al.46 prokázali, že protilátky pro tento konkrétní gen nerozpoznávaly donorové HLA antigeny, ale byly specifické pro E. coli, a Modena et al.47 ukázali, že zátěž počtem bakterií v moči byla mnohem vyšší u pacientů s intersticiální fibrózu a tubulární atrofii než ti s dobře fungujícími štěpy. Rozšiřujeme tato zjištění, která prokazují, že použití genu IGHV3-23 je významně vyšší u pacientů s vícenásobnou rejekcí v periferní krvi a může vést k odmítnutí určitých běžných antigenů. V budoucnu by exprese IGHV3-23 mohla být potenciálně použita k monitorování imunitní odpovědi vůči transplantovanýmledvina.

Rozšířením naší studie pomocí sekvenování cDNA bychom mohli replikovat většinu našich výsledků ve dvou z izotypů (IgM a IgD), které ukazují nižší diverzitu před transplantací v NP, což jsou dva nejvýznamnější v longitudinální analýze s větší expanzí a dominantní klony v síťové analýze a také replikaci genu IGHV3-23. První protilátky, které se produkují v humorální imunitní odpovědi, jsou vždy IgM a rychle postupují k produkci všech různých izotypů, IgD, IgA, IgG a IgE, ale zvláštní zájem vyžaduje izotyp IgD48. IgD je koexprimován s IgM a secernovaný IgD existuje a má funkci v krvi, slizničních sekretech a na povrchu vrozených imunitních efektorových buněk, jako jsou bazofily49. Bazofily jsou bílé krvinky, které bojují s viry, bakteriemi, parazity a houbami a podílejí se na onemocněních ledvin a odmítnutí transplantátu50. Tedy další důkaz, který dává do souvislosti reakce B-buněk s procesem odmítnutí viry a bakteriemi.

Budoucí studie jsou potřebné k prokázání, že tato aktivace je způsobena rozdíly v mikrobiomu příjemce s důsledky v diagnostice a terapii.

Tato studie nám umožnila identifikovat význam některých z těchto klonů BCR, identifikovat klony BCR klinického významu s rejekcí aloštěpu a ukázat, že existuje pravděpodobná relevance těchto klonů s heterologní imunitou, vzhledem k obohacení těchto klonů u pacientů s kolonizované močové cesty před transplantací a jejich biologický význam pro reakce patogenů. Lepší pochopení chování imunitního repertoáru vledvinatransplantace by nebyly možné bez aplikace BCRSeq v kombinaci s robustní implementací výpočetních a statistických kanálů. Přesto existuje několik omezení našeho přístupu, která by měla být uznána: Za prvé, velikost našeho vzorku je vysoce selektovaná a relativně malá v souboru dětských pacientů, a přestože jsme v naší analýze dosáhli statistické významnosti a byli validováni ve dvou různých zdrojích dat, k potvrzení našich výsledků bude zapotřebí další analýza. Za druhé, naše výsledky nejsou vyňaty z vlivu, který může mít biologický a technický odběr vzorků na naši analýzu. Měření diverzity závisí na několika otázkách: na skutečnosti, že ve vzorku je zastoupen pouze zlomek miliard buněk v repertoáru, rozdíly v hloubce sekvenování a možné experimentální chyby. Všechny tyto problémy jsme rozsáhle kontrolovali, zaprvé v laboratoři, zpracováním stejného množství krve pro každý vzorek ve stejné šarži a zadruhé, výpočtově a statisticky, použitím nástroje pro analýzu k odhadu celkového repertoáru a provedením downsamplingu pro kontrolu hloubky sekvenování. a experimentální chyby. Za třetí jsme provedli BCRSeq s použitím dvou různých zdrojů, gDNA a cDNA. Sekvenování gDNA usnadňuje odhad klonality dané sekvence Ig, protože počet čtení sekvence bude úměrný počtu molekul gDNA. Sekvenování cDNA poskytuje odhad relativní úrovně exprese různých Ig sekvencí v repertoáru. Ukázalo se, že u receptorů T-buněk není charakterizace klonotypu prováděná na cDNA tak dobrá jako u gDNA, což ukazuje, že relativní podíl jednotlivých klonů se značně lišil15 nebo že sledování klonů specifických pro HIV je úspěšné pouze s gDNA, ale ne mRNA51. Za čtvrté, vliv imunosuprese může být při tomto typu analýzy matoucím faktorem. V této studii všechny vzorky pocházejí z klinické studie, kde stejnou imunosupresivní zátěž dostávali všichni pacienti po transplantaci. Nicméně jsme kontrolovali dva typy na bázi steroidů a bez steroidů, abychom se ujistili, že to není problém, přičemž jsme nepozorovali žádné rozdíly ve výsledcích. Konečně, kohorta, kterou zde uvádíme, je kohorta dětských transplantací. Většina klinických aspektů transplantovaných je u dětí a dospělých podobná. Imunosuprese a použité režimy jsou podobné, kreatinin je hlavním sérovým biomarkerem, akutní rejekce je určena primárně pomocí biopsie s použitím Banffových kritérií a mechanismy rejekceledvinaštěpy jsou obecně podobné52, proto se většina výzkumů prováděných u dospělých nebo dětí může vztahovat na oba. Jiné aspekty, jako je nedodržování/nedodržování imunosuprese, imunologické aspekty, primární onemocnění ledvin vedoucí k selhání ledvin, často spojené s urologickými problémy, a imunizace, která jsou nutná před transplantací, se však mohou lišit. Pro zobecnění těchto zjištění bude nezbytná dospělá populace.

Navzdory těmto omezením naše data odhalují, že u jedinců, kteří odmítnou orgán, je pozorována vyšší diverzita před transplantací, což naznačuje predispozici k odmítnutí, což může mít budoucí důsledky v předpovídání rizika odmítnutí před přihojením, imunosupresivními volbami a klinickou péčí. praktiky. Po 24 měsících sledování je ve skupině s rejekcí pozorováno celkové snížení diverzity v průběhu času doprovázené přetrváváním a expanzí určitých klonů a vyšším využíváním několika genů IGHV, což může vést k rejekci konkrétních běžných antigenů. Zvláštní zájem je pozorován pro zvýšené používání genu IGHV3-23 mezi pacienty s rejekcí, protože byl dříve spojován sledvinatransplantace a mohla by být klíčovou složkou pro řízení procesu odmítnutí. Tato práce představuje longitudinální analýzu imunitního repertoáru B-buněk u transplantací orgánů a podporuje další studie k potvrzení těchto zjištění, protože mohou mít klinické důsledky při předpovídání, kontrole, monitorování a léčbě.ledvinaodmítnutí.

Metody

Studovat design. Studovali jsme 81 vzorků pro gDNA a 56 shodných vzorků pro cDNA podélně v časech 0, 6 a 24 měsíců od celkového počtu 27 dětských příjemců, kteří dostali primárníledvinatransplantace. Subjekty v této studii pocházejí z klinické studie (multicentrická studie SNSO1), kde byly subjekty randomizovány (1:1) do tradičního imunosupresivního režimu na bázi nízkých dávek steroidů (steroidy, standardní indukce daklizumabem do druhého měsíce po transplantaci, a udržovací imunosuprese takrolimem (Prograf, Astellas Pharma) a MMF (CellCept, Hoffman-La Roche) nebo imunosupresivním režimem bez steroidů (prodloužená indukce daklizumabu až do šestého měsíce po transplantaci, takrolimus a MMF). Zařazeni po schválení IRB a měli informovaný souhlas. V této studii dostávalo 14 pacientů režim vyhýbání se steroidům, zatímco 13 dostávalo imunosupresivní režim na bázi steroidů53 a žádný z těchto pacientů nedostal imunosupresi před transplantací, protože to bylo jedno vylučovací kritérium. Léčba rejekce sestával ze tří pulsů intravenózního kortikosteroidu (10 mg/kg) a základní intenzifikace imunosuprese.

Všechny vzorky použité ve studii měly přidruženou sériovou biopsii aloštěpu, která byla odečtena centrálním patologem za použití semikvantitativního histologického skóre. Klinická akutní rejekce byla definována jako akutní rejekce spojená s dysfunkcí štěpu na základě více než 10procentního zvýšení sérového kreatininu oproti výchozím hodnotám a potvrzená centrálním patologickým čtením biopsií podle aktualizované Banffovy klasifikace23,24. Chronické poškození aloštěpu bylo definováno pomocí skóre indexu chronického poškození aloštěpu (CADI). Pacienti byli klasifikováni do tří klinických výsledků definovaných CADI skóre a epizodami rejekce Non-progressors (NP) měli nízké neinkrementální CADI skóre ve třech sériových biopsiích během 2 let, bez akutní rejekce, progresivní bez rejekce (PNR) měli vyšší CADI skóre na jejich sériových biopsiích po dobu 2 let a přírůstkové napříč časovými body bez rejekce a progresoři s rejekcí (PR) měli inkrementální vysoké skóre CADI na svých sériových biopsiích během 2 let s epizodami rejekce. Tito pacienti byli velmi pečlivě vybráni z větší kohorty 120 pacientů, kteří odpovídali demografickým proměnným a u všech NP a PNR neměli žádný důkaz zánětu při biopsii nebo subklinickém poškození, měřeno nepřítomnými dárcovskými specifickými protilátkami. Žádný neměl HLA nebo haploidentický štěp, protože to bylo vylučovací kritérium pro zařazení54. Všechny vzorky byly odebrány z 12 různých amerických dětských transplantačních programů v letech 2004 až 2006 podle protokolů schválených IRB. Studie byla také schválena Programem ochrany lidského výzkumu (HRPP) Kalifornské univerzity v San Franciscu a Stanfordské univerzity, aby umožnila analýzu vzorků biobank. Všichni pacienti/opatrovníci poskytli informovaný souhlas s účastí na výzkumu v plném souladu s Helsinskou deklarací. Uvedené klinické a výzkumné aktivity jsou v souladu se Zásadami Istanbulské deklarace, jak je uvedeno v Istanbulské deklaraci o obchodování s orgány a transplantační turistice.

Izolace gDNA a RNA. Vzorky krve (4,5 ml) byly odebrány do 5ml zkumavky s červeným horním koncem a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 30 minut, dokud se nevytvořila sraženina. Vzorek byl poté odstřeďován při 2000 x g po dobu 5 minut pomocí výkyvného rotoru. Horní vrstva séra byla poté přenesena do jiné kryozkumavky a sraženina byla skladována ve stejné zkumavce při -80 stupních až do použití. Genomová DNA z celokrevních sraženin byla extrahována pomocí Clotspin Baskets a Gentra PuregeneBlood Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Pro extrakci RNA zledvinabiopsie jehlou (Qiagen, Valencia, CA) a skladováno při -80 stupních; celková RNA byla extrahována pomocí hlavní směsi 790 ul TRIzolu a 10 ul glykogenu. Vzorky tkání byly homogenizovány, inkubovány při 15 až 25 stupních po dobu 5 minut a bylo přidáno 160 ul chloroformu pro oddělení fází. Směs byla znovu inkubována při 25 stupních po dobu 2 minut, následovala centrifugace při 4 stupních a použita pro extrakci RNA pomocí RNeasy Micro Kit (Qiagen Catalogue no.4004). Množství a integrita RNA byly stanoveny pomocí spektrofotometru Thermo Scientific NanoDrop ND{11}} UV–Vis a bioanalyzátoru Agilent.

Sekvenování B-buněk. Byly připraveny templátové PCR reakce genomové DNA

z 100 ng alikvotů gDNA k vytvoření šesti nezávislých knihoven s čárovým kódem na vzorek. Byly použity multiplexované primery pro oblasti základní struktury IgH J nebo FR1 nebo FR2 podle návrhu BIOMED-255. Desetinukleotidové "sekvence čárového kódu" v primerech byly použity k označení identity vzorku a identity replikované knihovny pro každou PCR reakci. PCR byla provedena s AmpliTaq Gold (Roche) polymerázou s následujícím programem: 94 stupňů po dobu 5 minut; 35 cyklů (94 stupňů po dobu 30 s, 60 stupňů po 45 s, 72 stupňů po 90 s); a konečné prodloužení při 72 stupních po dobu 10 min. Byla provedena druhá PCR reakce, aby se zajistilo, že knihovny nebyly amplifikovány do saturace před gelovou purifikací a sekvenováním. Celkem 0,4 ul každého prvního PCR produktu templátovalo druhou PCR reakci s použitím externích primerů specifických pro 454 linkerových sekvencí; amplifikace byla provedena s programem: 94 stupňů po dobu 15 minut, 12 cyklů (94 stupňů po dobu 30 s, 60 stupňů po dobu 45 s, 72 stupňů po dobu 90 s) a konečné prodloužení při 72 stupních po dobu 10 minut. Chybovost AmpliTaq Gold by měla mít minimální vliv na identifikaci klonálně příbuzných sekvencí nebo odhad míry somatických mutací v sekvencích, jak je diskutováno někde jinde56. cDNA byla syntetizována z celkem 300 ng RNA s primární aktivací náhodnými hexamery. Templáty byly amplifikovány pomocí PCR s použitím Biomed IGHV primerů v rámci 1 (FR1) a izotypově specifických primerů umístěných v prvním exonu konstantních oblastí. Tyto primery18,57 také kódovaly přibližně polovinu Illumina linkerových sekvencí potřebných pro generování klastrů a sekvenování na přístroji MiSeq. Identita vzorku byla kódována osminukleotidovými multiplexními identifikačními čárovými kódy v každém primeru. Pro rozpoznání klastru Illumina byly čtyři randomizované nukleotidy kódovány v primerech bezprostředně po sekvenci linkeru Illumina v primerech konstantní oblasti. Každý izotyp protilátky pro každý vzorek byl amplifikován v samostatné PCR reakci, aby se zabránilo tvorbě zkřížených izotypových chimérických produktů PCR. PCR byla provedena pomocí AmpliTaq Gold (Roche) podle pokynů výrobce a použil se program 94 stupňů po dobu 7 minut, 35 cyklů (94 stupňů po dobu 30 s, 58 stupňů po dobu 45 s, 72 stupňů po dobu 120 s) a konečný prodloužení při 72 stupních po dobu 10 min. Druhý krok PCR byl použit k přidání zbývající části Illumina linkerů k amplikonům a byl proveden pomocí soupravy Qiagen Multiplex PCR kit (Qiagen) podle pokynů výrobce s použitím 0,4 mikrolitrů prvního produktu PCR jako templátu v Reakce 30 mikrolitrů. Program PCR pro druhý krok PCR byl 94 stupňů po dobu 15 minut, 12 cyklů (94 stupňů po dobu 30 s, 60 stupňů po 45 s, 72 stupňů po 90 s) a konečné prodloužení při 72 stupních po dobu 10 minut. Produkty každé PCR reakce byly spojeny v odhadovaných ekvimolárních množstvích, podrobeny elektroforéze na agarózových gelech a gel extrahován pomocí souprav QIAquick (Qiagen). Vysoce výkonné sekvenování knihoven templátovaných genomové DNA bylo provedeno na platformě 454 (Roche) s použitím chemie titanu. Sekvenování knihovny cDNA bylo provedeno na přístroji Illumina MiSeq za použití 600-cyklových sekvenačních souprav. Úplný seznam primerů používaných s MiSeq (M154 a M155) a 454 Titanium (T7) je uveden v doplňkových údajích 1.

Sekvenační čtení byla zpracována následovně: čtení párových konců byla sloučena pomocí FLASH58, kde byly sekvence demultiplexovány a ořezány o čárové kódy a sekvence primerů IGHV. Oblasti V, D a J a spoje V–D (N1), D–J (N2) byly identifikovány pomocí programu zarovnání IgBLAST59. Sekvence byly filtrovány, aby se odstranily non-IGH artefakty, sekvence s inzercí nebo delecí V genu, chimérické sekvence a nefunkční sekvence. Na úrovni vzorku jsme vyloučili ty s<100 clones="" (defined="" by="" same="" v="" and="" j="" segments,="" same="" cdr3="" length,="" and="" 90%="" nucleotide="" identity)="" as="" a="" control="" for="" bad="" quality="" samples.="" after="" quality="" control,="" for="" gdna,="" we="" had="" complete="" longitudinal="" data="" for="" 69="" samples="" at="" times="" 0,="" 6,="" and="" 24="" with="" a="" total="" number="" of="" 327,703="" reads="" (mean="" 4045="" per="" sample).="" for="" cdna,="" we="" had="" complete="" data="" for="" 55="" matched="" samples,="" although="" no="" time="" 0="" samples="" were="" further="" available.="" in="" this="" case,="" we="" had="" isotype-="" specific="" information="" (1,773,330="" reads="" for="" igd="" (31,667="" per="" sample),="" 1,708,227="" reads="" for="" igm="" (30,504="" per="" sample),="" 973,444="" reads="" for="" iga="" (17,383="" per="" sample),="" 139,7345="" reads="" for="" igg="" (24,953="" per="" sample),="" and="" 29,000="" reads="" for="" ige="" (5,178="" per="">

Analýza diverzity. Diverzita se měří druhovou bohatostí s ohledem na počet klonů na vzorek. Toto měření nebere v úvahu frekvenci každého druhu, takže jsme také použili Shannonovu entropii (H) k měření diverzity poskytující

informace o velikostním rozložení druhů v populaci. H je definováno jako:

kde N je počet jedinečných klonů a pi je frekvence klonu i. H se pohybuje od 0 (vzorek pouze s jedním klonem) do Hmax ¼ log2N (vzorek s rovnoměrnou distribucí klonů).

Poté jsme použili obecný lineární model, abychom našli souvislost mezi bohatostí a entropií s klinickým výsledkem v různých časových bodech. Tento model jsme upravili podle všech dostupných klinických proměnných uvedených v tabulce 1, abychom si byli jisti, že jakákoliv charakteristika pacienta byla matoucím faktorem.

K modelování longitudinální složky dat jsme použili model lineárního smíšeného účinku s ohledem na model podmíněného růstu, jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 10. K aplikaci tohoto modelu jsme použili balíček lme4 v R s ohledem na interakci mezi klinickým výsledkem a časem do najít spojení s bohatstvím a rozmanitostí, přičemž čas je náhodný efekt.

Abychom se vypořádali se skutečností, že míry diverzity mohou být ovlivněny problémem chybějících druhů (v repertoáru je zastoupen pouze zlomek miliard buněk) a sekvenačními a experimentálními chybami, provedli jsme kromě úplné analýzy dat dvě strategie. Nejprve jsme použili nástroj Recon (rekonstrukce odhadovaných klonů z pozorovaných čísel)29 k řešení problému chybějících druhů. Recon je modifikovaná metoda maximální věrohodnosti, která poskytuje celkovou rozmanitost repertoáru z měření na vzorku. Recon poskytuje přesné a robustní odhady souboru měření diverzity, včetně bohatosti a entropie, což umožňuje robustní srovnání diverzity mezi jednotlivci. Za druhé jsme provedli strategii downsamplingu s náhodnou podmnožinou čtení pro každý vzorek, která se rovnala nejmenší velikosti sekvenování, následovanou přepočtem klonů B-buněk, abychom upravili hloubku sekvenování a vypořádali se s možnými experimentálními chybami. Pro gDNA existují vzorky s velmi nízkým čtením (< 1000),="" a="" abychom="" se="" vyhnuli="" ztrátě="" mnoha="" sekvencí="" a="" reálnosti="" dat,="" vyloučili="" jsme="" celkem="" devět="" vzorků,="" které=""><1000 reads.="" in="" the="" case="" of="" cdna,="" this="" was="" not="" necessary.="" we="" generated="" ten="" random="" subsamples="" to="" account="" for="" possible="" stochastic="" effects="" and="" performed="" the="" diversity="" analysis="" at="" each="" time="" point="" and="" the="" longitudinal="" data="" analysis="" on="" the="" mean="" value="" of="" ten="" independently="" downsampled="" diversity="">

Síťová analýza. Algoritmus generování sítě je velmi podobný tomu, který byl definován dříve31. Ve stručnosti, každý vrchol představuje sekvenci B-buněk, kde velikost je definována všemi identickými sekvencemi. Hrany se vypočítají pomocí klonové definice (stejné V a J segmenty, stejná délka CDR3 a 90 procent nukleotidové identity mezi CDR3) a shluky představují každý klon v repertoáru. Analýza byla provedena pomocí balíčku grafů v jazyce R s použitím možnosti rozvržení_s_grafoptem pro vygenerování grafu.

Pro kvantifikaci sítě jsme vypočítali Gini index pro velikost vrcholu a velikost clusteru. Gini Index je míra nerovnoměrnosti široce používaná k měření distribuce bohatství. Měří nerovnost mezi hodnotami rozdělení frekvencí. Použili jsme funkci Gini z jednoho balíčku v R k výpočtu Giniho koeficientu pro velikost vrcholu a distribuci velikosti shluků. Giniho koeficient nula vyjadřuje dokonalou rovnost a Giniho koeficient 1 vyjadřuje maximální nerovnost.

Klonální analýza. Abychom mohli studovat specifické klony spojené s klinickými výsledky, vytvořili jsme matrici se všemi klony, které jsou přítomny ve více než jednom vzorku (celkový počet=118,223) u všech vzorků v každém časovém bodě. Poté jsme studovali souvislost s klinickým výsledkem každého konkrétního klonu, přičemž jsme definovali jednu proměnnou na klon jako přítomnou/žádnou. Nakonec jsme použili Fisherův exaktní test, abychom zohlednili významnost v tabulkách 2 × 3 pro každý klon v každém časovém bodě. Studovali jsme také perzistentní klony definované těmi klony, které jsou u každého jedince ve více než jednom časovém bodě. Poté, abychom zohlednili rozdíly podle klinického výsledku, jsme použili lineární model definující jako závislou proměnnou počet klonů (pro měření rozdílů v perzistenci) a počet počtů každého klonu (pro měření klonální expanze) a klinický výsledek jako nezávislý prediktor.

Analýza využití genu IGHV. Ke studiu genů IGHV jsme hodnotili využití genu IGHV na vzorek jako počet použití každého genu normalizovaný počtem klonů, abychom se vyhnuli nadměrnému zastoupení určitých genů IGHV. Pro statistickou analýzu jsme odfiltrovali ty geny s velmi nízkou expresí (použití IGHV/klony < {{0}}.05)="" v="" alespoň="" 10="" procentech="" vzorků.="" celkem="" jsme="" analyzovali="" 27="" genů="" ighv="" odpovídajících="" 63="" vzorkům.="" poté="" jsme="" použili="" lineární="" model,="" abychom="" našli="" ty="" geny,="" které="" byly="" spojeny="" s="" klinickým="" výsledkem="" v="" každém="" časovém="" bodě,="" a="" korigovali="" jsme="" tyto="" výsledky="" vícenásobným="" testováním="" pomocí="" benjaminiho="" a="" hochberga="" fdr="">< 0,05.="" tento="" model="" jsme="" upravili="" podle="" všech="" dostupných="" klinických="" proměnných="" uvedených="" v="" tabulce="" 1,="" abychom="" si="" byli="" jisti,="" že="" jakákoliv="" charakteristika="" pacienta="" byla="" matoucím="">

Shrnutí hlášení. Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici v Souhrnu zpráv o výzkumu přírody propojeném s tímto článkem.

Reference

1.Cai,J.& Terasaki,PI Posttransplantační monitorování protilátek a HLA 1.(identifikace epitopu protilátky. Curr.Opin.Immunol. 20,602-606(2008).

2. Sigdel, TKet al. Non-HLA protilátky proti imunogenním epitopům předpovídají vývoj chronického poškození renálního aloštěpu. Dopoledne. Soc. Nephrol.23, 750-763 (2012).

3. Li, L. a kol. Kompartmentální lokalizace a klinický význam protilátek MICA po transplantaci ledviny. Transplantation 89,312-319(2010).

4. Lamb, KE, Lodhi, S. & Meier-Kriesche, H.-U. Dlouhodobé přežití renálního aloštěpu ve Spojených státech amerických: kritické přehodnocení. Am.J. Transplantace. 11, 450-462(2011).

5. Vědecký registr příjemců transplantací. Dostupné na: https://rtr. transplant.hrsa.gov/annual_reports/2012/Default.aspx.(Přístup:24. května 2018)Pineda, S. et al. Nové nehistokompatibilní varianty s neshodným antigenem

6. Zlepšit schopnost předvídat riziko rejekce zprostředkované protilátkami u transplantací ledvin. Přední. Immunol. 8,1687 (2017).

7. Valuiskikh, A. Baldwin, WM& Fairchild, RRL Nedávný pokrok a nové perspektivy ve studiu odpovědí T buněk na aloštěpy. Am.J. Transplant.10, 117-1125 (2010).

8. Zarkhin, V, Chalasani, G. & Sarwal, MM Jin a jang B buněk při odmítnutí a toleranci štěpu. Transplantace. Rev.24,67-78(2010).

9. Georgiou, G. et al. Příslib a výzva vysoce výkonného sekvenování repertoáru plus protilátek. Nat. Biotechnol.32,158-168(2014).

10. Schroeder, HW Podobnost a divergence ve vývoji a expresi myších a lidských protilátkových repertoárů. Dev. Comp. Immunol. 30,119-135(2006).

11. Yaari, G. & Kleinstein, SH Praktické pokyny pro analýzu sekvenování repertoáru B-buněčných receptorů. Genome Med. 7, 121 (2015).

12. Shugay, M. a kol. VDJtools: Sjednocení postanalýzy repertoárů receptorů T buněk. Výpočet PLOS. Biol. 11, e1004503 (2015).

13. Alachkar, H. et al. Kvantitativní charakterizace repertoáru T-buněk a biomarkerů při odmítnutí transplantátu ledviny. BMC Nephrol.17,181(2016). 14. Morris, H. et al. Sledování T-buněk reaktivních od dárce: Důkaz pro klonální deleci u tolerantních pacientů s transplantací ledvin. Sci. Přel. Med.7,272ral0 (2015).

15. Dziubianau, M. et al. Analýza repertoáru TCR pomocí sekvenování nové generace umožňuje komplexní diferenciální diagnostiku patologie související s T buňkami. Dopoledne. J.Transplant.13,2842-2854 (2013).

16. Palanichamy, A. et al. Imunoglobulinové B-buňky s přepínáním třídy tvoří aktivní imunitní osu mezi CNS a periferií u roztroušené sklerózy. Sci. Přel. Med.6, 248ra106-248ra106(2014).

17. Strauli, NB & Hernandez, RDS Statistická inference konvergentní odpovědi protilátkového repertoáru na vakcínu proti chřipce. Genome Med. 8,60 (2016).

18. Roskin, KM a kol. Sekvence IgH u běžné variabilní imunitní nedostatečnosti odhalují změněný vývoj a selekci B buněk. Sci. Přel. Med.7,302ra135 (2015).

19.Massart, A.,Ghisdal,L.,Abramowicz, M.& Abramowicz,D.Operační tolerance při transplantaci ledvin a související biomarkery. Clin. Exp. Immunol.189,138-157(2017).

20. Beausang, JFet al. Repertoáry B buněk u kandidátů na transplantaci ledvin senzibilizovaných HLA podstupujících desenzibilizační terapii.J. Přel. Med. 15, 9 (2017).

21. Ferdman, J. a kol. Expanze a somatická hypermutace klonů B-buněk v odmítnutých lidských ledvinových štěpech. Transplantace 98, 766-772 (2014).

22. Vollmers, C. a kol. Monitorování farmakologicky indukované imunosuprese pomocí sekvenování imunitního repertoáru k detekci akutní rejekce aloštěpu u pacientů po transplantaci srdce: Studie diagnostické přesnosti Proof-of-Concept. PLOS Med. 12,e1001890 (2015).

23. Solez, K. et al. Banff'05 Meeting Report: Diferenciální diagnostika chronického poškození alograftu a eliminace chronické nefropatie alograftu (CAN). Dopoledne. J. Transplant.7,518-526(2007). imunosuprese při transplantaci ledvin: je čas považovat ji za standardní terapii? Kidney Int.76,825-830(2009).

28. Legendre, C. a kol. Tříleté výsledky u pacientů po transplantaci ledviny randomizovaných k imunosupresi bez steroidů nebo vysazení steroidů s enterosolventním mykofenolátem sodným a cyklosporinem: studie nekonečna. J. Transplant.2014,1-8(2014).

29. Kaplinsky, J. & Arnaout, R. Robustní odhady celkové diverzity imunitního repertoáru z vysoce výkonných měření na vzorcích. Nat. Commun.7, 11881(2016).

30. Stern, JNHet al. B buňky osidlující mozek s roztroušenou sklerózou dozrávají v drenážních krčních lymfatických uzlinách. Sci. Přel. Med. 6,248ra107 (2014).

31. Bashford-Rogers, RJMet al. Síťové vlastnosti odvozené z hlubokého sekvenování repertoárů lidských B-buněčných receptorů vymezují populace B-buněk. Genome Res.23,1874-1884 (2013).

32. Sarwal, Met al. Molekulární heterogenita při akutní rejekci renálního aloštěpu

identifikované profilováním DNA microarray. N.Engl.J. Med.349,125-138(2003). 33.Zarkhin, V., Lovelace, PA, Li, L., Hsieh, S.-C. & Sarwal, MMfenotypové hodnocení podskupin b-buněk po rituximabu pro léčbu akutní rejekce renálního aloštěpu u dětských příjemců. Transplantation 91, 1010-1018 (201).

34. Clatworthy, MR& Targeting, B. Buňky a protilátky při transplantaci. Am. J. Transplant.11, 1359-1367 (2011).

35. Dijke,EIet al.Bcells in transplantation.J. Transplantace plic srdce. 35,704-710(2016).

36. Nankivell, BJ& Kuypers, DRD Diagnostika a prevence chronické ztráty aloštěpu ledviny. Lancet 378,1428-1437(2011).

37. Patin, E. et al. Přirozená variabilita parametrů vrozené imunitní buňky je přednostně řízena genetickými faktory. Nat.Immunol.19,302-314(2018). 38. Liston, A. & Goris, A. Původ rozmanitosti v lidské imunitě. Nat. Immunol. 19,209-210(2018).

39. Meier-Kriesche, H.-U, Schold, JD, Srinivas, TR& Kaplan, B. Nedostatek zlepšení přežití renálního aloštěpu navzdory výraznému poklesu míry akutní rejekce v poslední době. Am.J. Transplant.4,378-383 (2004).

40. Keith, DS, Vranic, G. & Nishio-Lucar, A. Funkce štěpu a střednědobé výsledky transplantací ledvin se v posledním desetiletí zlepšily: Analýza databáze transplantací ledvin ve Spojených státech. Transplantace. přímý 3,el66 (2017).

41. Bomben, R. a kol. Exprese mutovaných genů IGHV3-23 u chronické lymfocytární leukémie identifikuje podskupinu onemocnění se zvláštními klinickými a biologickými rysy. Clin. Cancer Res. 16,620-628(2010).

42. Levinson, AI, Kozlowski, L, Zheng, Y. & Wheatley, L. Superantigeny B-buněk: definice a potenciální dopad na imunitní odpověď.J. Clin.Immunol.15, 26S-36S(1995.

43. Silverman, GJ& Goodyear, model CSA Superantigen B-buněk a imunobiologie B lymfocytů. Clin.Immunol.102,117-134(2002).

44. Silverman, GJ& Goodyear, CS Confounding B-cell defense: lekce ze stafylokokového superantigenu. Nat. Rev. Immunol.6,465-475(2006). 45. Cheng, J. et al. Ektopické shluky B-buněk, které infiltrují transplantované lidské ledviny, jsou klonální. Proč. Natl Acad. Sci. 108,5560-5565 (2011).

46. ​​Grover, RKet al. Kostimulační imunogen LPS indukuje klony B-buněk, které infiltrují transplantované lidské ledviny. Proč. Natl Acad. Sci. USA 109, 6036-6041(2012).

47,Modena,BDet al. Změny v populacích močového mikrobiomu korelují u transplantací ledvin s intersticiální fibrózou a tubulární atrofií dokumentovanou v časných sledovacích biopsiích. Dopoledne. J. Transpl.17,712-723 (2017).

48. Chen, K. & Cerutti, A. Nové poznatky o záhadě imunoglobulinu D. Immunol. Rev. 237,160-179 (2010).

49. Chen, K. a kol. Imunoglobulin D zvyšuje imunitní dohled aktivací antimikrobiálních, prozánětlivých a B lymfocytárních stimulačních programů v bazofilech. Nat. Immunol. 10, 889-898(2009).

50. Mack, M. & Rosenkranz, AR Basofily a mastocyty při poškození ledvin. KidneyInt. 76, 1142-1147 (2009).

51. Nixon, DFet al. Molekulární sledování viru lidské imunodeficience

nef specifické cytotoxické T-buněčné klony vykazují perzistenci klonově specifické T-buněčné receptorové DNA, ale ne mRNA po časné kombinované antiretrovirové terapii.Immunol. Lett.66,219-228(1999).

52. Dharnidharka, VR, Fiorina,P.& Harmon, WEKidneyho transplantace u dětí.N.Engl. J. Med. 371,549-558(2014).

53. Sarwal, MMet al. Úplné vyhýbání se steroidům je účinné a bezpečné u dětí po transplantaci ledvin: Multicentrická randomizovaná studie s tříletým sledováním. Am.J.Transplant.12,2719-2729(2012).

24. Solez, K. et al. Banff 07 klasifikace patologie renálního aloštěpu: aktualizace a budoucí směry. Am.J.Transplant.8,753-760 (2008).

54. Li, L a kol. imunosuprese bez steroidů od roku 1999: 129 dětských transplantací ledvin s trvalým štěpem a přínosem pro pacienta. Am.J. Transpl. 9, 1362-1372(2009).

25. Chaudhuri, A. et al. Klinický dopad humorální imunity u dětské transplantace ledvin.J. Dopoledne. Soc.Nephrol.24,655-664 (2013).