Charakterizováno poklesem fyziologických funkcí v jednotlivých orgánových systémech
Sep 15, 2022
Pro více informací nás prosím kontaktujte
SOUHRN
Černý čaj je nejrozšířenějším čajovým nápojem na světě a neustále se uvádí, že má účinky proti stárnutí. Zda se však theaflaviny, jeden typ charakteristických fytochemikálií v extraktech z černého čaje, podílejí na regulaci stárnutí a délky života konzumentů, zůstává velkou neznámou. V této studii jsme ukázali, že theaflaviny hrají prospěšnou roli při prevenci prosakování střev a dysbióze s nástupem věku, čímž oddalují stárnutí u Drosophila. Mechanisticky theaflaviny regulují kondenzační shromáždění Imd, aby negativně řídily nadměrnou aktivaci signálů Imd ve střevech ovocných mušek. Kromě toho theaflaviny brání kolitidě vyvolané DSS u myší, což naznačuje, že theaflaviny hrají roli při modulaci střevní integrity. Celkově naše studie odhaluje molekulární mechanismus, kterým theaflaviny regulují střevní homeostázu pravděpodobně prostřednictvím kontroly koalescence Imd.
ÚVOD
Stárnutí, charakterizované poklesem fyziologických funkcí v jednotlivých orgánových systémech a rostoucím rizikem onemocnění a smrti, zahrnuje hromadění poškození molekul, buněk a tkání (Alavez et al., 2011; Bartke et al., 2019; Engeet kol., 2017). Stěžejní je nepochybně identifikace funkčních materiálů nebo chemikálií zabraňujících biologickému poškození, aby se oddálil proces stárnutí a prodloužila životnost (Bar-ardo et al., 2017; Kapahi et al., 2017). Předchozí studie uvádějí, že černý čaj, nejrozšířenější čaj na světě, má významné aktivity, které oddalují stárnutí (Cameron et al., 2008; Fei et al., 2017; Kumar a Rizvi, 2017; Naumovski et al., 2019 Peng a kol., 2009; Xiao a kol., 2020). Doplněk stravy s výtažky z černého čaje účinně prodlužuje životnost experimentálních zvířat, jako jsou červi (Feet al., 2017), ovocné mušky (Peng et al., 2009; Site al., 2011), myši (Site al., 2011 Xiao et al., 2020) a krysy (Kumar a Rizvi, 2017).
Je dobře známo, že extrakty z černého čaje obsahují hlavně dva druhy fytochemikálií, a to katechiny a theaflaviny (TF) (Cameron et al., 2008; Kondo et al., 2019; Li et al., 2013), z nichž poslední jsou produkovány z katechinů endogenní polyfenoloxidázou a peroxidázou během oxidačního procesu při výrobě černého čaje (Li et al.,2013). Řada studií identifikovala úlohu katechinů proti stárnutí prostřednictvím zlepšení oxidačního stresu a zánětu souvisejícího s věkem a snížení poškození tkání (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Si et al. 2011; Waaner a kol., 2015). Funkční studie o podílu TF na stárnutí však výrazně zaostávají za studiemi na katechinech, protože je obtížné extrahovat dostatečné množství TF z listů černého čaje pro lékařské studie (Takemoto a Takemoto, 2018). Nedávno bylo vyvinuto několik biosyntetických metod pro masovou produkci TF (Takemoto a Takemoto, 2018), což umožňuje prozkoumat přesné biologické účinky TF a základní regulační mechanismy.
V poslední době rostoucí soubory dat zdůraznily klíčovou roli střev při stárnutí a modulaci délky života (Guo a kol., 2014; Jji a kol., 2019; Maynard a Weinkove, 2018; Rothenberg a Zhang, 2019; Salazar a kol. ,2018). Střevní epitel, který působí jako selektivní bariéra, umožňuje absorpci živin, iontů a vody a omezuje kontakt hostitele se škodlivými entitami, včetně mikroorganismů, dietních antigenů a toxinů z prostředí (Capo et al., 2019; Nicholson et al. , 2012; Ryu a kol., 2010). Jako tkáň s vysokým obratem u jedinců poskytuje střevní trakt nejlepší životní prostředí pro symbiotické mikroorganismy, včetně přirozených anaerobních podmínek, dostatek živin a vhodnou teplotu a pH.
Obrázek 1. Theaflaviny prodlužují životnost Drosophila a zvyšují schopnost šplhání
(A a B) Samice ovocných mušek byly kultivovány se standardními potravinami, které byly doplněny 1 mg/ml nebo 2,5 mg/ml theaflavinů (TF) nebo bez TF jako bazální. Mouchy byly každý druhý den přeneseny do čerstvých lahviček obsahujících nová média a mrtvé mouchy byly skórovány po celou dobu života v dospělosti, byly analyzovány a ukázány křivky přežití (A) a střední délka života (B) samic much.
(Cand D) Samice w18 byly krmeny standardním krmivem pro Drosophila (označované jako bazální) nebo krmivem doplněným o 1 mg/ml nebo 2,5 mg/ETF, v daném pořadí. Šest nezávislých skupin much v uvedeném věku (10 dní, 30 dní, 40 dní a 50 dní, v tomto pořadí) bylo podrobeno testu café (C) a fluoresceinového krmení (D). hodnotu, tvořící niky obsazené konkrétními bakteriálními druhy v těle (Bonfini et al., 2016; Buchon et al., 2013; Nicholson et al., 2012). Mezitím tyto symbiotické mikroorganismy a jejich metabolity také přímo nebo nepřímo ovlivňují zpracování živin; trávení a vstřebávání; energetická bilance; imunitní funkce; vývoj a zrání gastrointestinálního traktu; a mnoho dalších důležitých fyziologických aktivit (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Maynard a VVeinkove, 2018; Nicholson et al., 2012). Vzájemně výhodný vztah mezi dvěma symbionty může udržovat stabilitu a dynamickou rovnováhu střevního mikroekosystému (Bonfini et al., 2016; Brodeerick, 2016; Broderick et al., 2014; Guo et al., 2014; May-nard a Weinkové, 2018; Nicholson et al., 2012).
cistanche může proti stárnutí
Řada studií ukázala, že vrozená imunitní odpověď je kritická pro udržení homeostázy střevní mikrobioty a je zachována od bezobratlých po obratlovce (Guillouet al., 2016; Guo et al., 2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay- Kumar a kol., 2010). U Drosophila se na vrozených imunitních odpovědích podílejí dvě hlavní signální dráhy, jmenovitě dráha Toll a imunitní nedostatečnost (Imd) (Lu et al., 2020; Myllymakiet al., 2014; Valanne et al., 2011). Je pozoruhodné, že dráha Drosophila Toll sdílí podobnosti se savčím receptorem interleukinu-1 (IL-1R) a dráhami Toll-like receptoru (TLR) závislými na MyD{11}}, zatímco dráha Imd je podobná na dráhu receptoru pro tumor nekrotizující faktor (TNFR) a dráhu TRIF-dependentního TLR u savců (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011). Tyto dvě dráhy řídí expresi antimikrobiálních peptidů (AMP) prostřednictvím aktivace transkripčních faktorů NF-KB (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011).bioflavonoidySignální dráha Imd je normálně aktivována gramnegativní bakteriální infekcí a vede k expresi další sady AMP, jako je Attacin, Cecropin a Diptericin (Kleino a Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Exprese těchto AMP vyžaduje receptor peptidoglykanového rozpoznávacího proteinu (PGRP)-LC v dráze Imd a na signálu závislé štěpení a jadernou translokaci Relish, transkripčního faktoru rodiny NF-kB (Kleino a Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Nedávná studie ukázala, že tvorba amyloidu je nutná pro aktivaci dráhy Drosophila Imd po rozpoznání bakteriálních peptidoglykanů (Kleino et al., 2017). Nicméně, zda se tento kondenzát Imd podílí na jiných biologických procesech, jako je udržování střevní homeostázy a regulace stárnutí, zůstává velkou neznámou.
V této studii jsme použili ovocné mušky a myši jako zvířecí modely ke zkoumání rolí TF při kontrole střevní integrity a stárnutí. Ukázali jsme, že TF oddalují nadměrnou proliferaci střevních kmenových buněk s nástupem věku, chrání před dysbiózou střevního mikrobiomu a zabraňují aktivaci signální dráhy Imd, čímž prodlužují délku života u Drosophila. Další mechanistické studie ukázaly, že TF negativně přispívají k signalizaci Imd spíše blokováním kondenzace Imd než jeho ubikvitinací. Navíc jsme zjistili, že TF jsou vysoce účinné při prevenci kolitidy vyvolané DSS u myší. Celkově naše zjištění odhalují potenciální roli TF při modulaci chování Imd, což by mohlo být klíčovým faktorem v jejich pozitivních příspěvcích k střevní homeostáze a prodloužení životnosti.
VÝSLEDEK
Dietní suplementace theaflavinů prodlužuje životnost Drosophila
Abychom prozkoumali, zda theaflaviny (TF) ovlivňují stárnutí a délku života u Drosophila, vychovali jsme samice much w'118 pomocí standardních krmiv pro odchov, které byly doplněny 1 mg/ml nebo 2,5 mg/ml TF, a provedli jsme testy životnosti, jak bylo popsáno dříve (Ji et al. .,2019). Mouchy krmené stravou doplněnou stejným objemem rozpouštědla TF (H2O) byly považovány za kontroly. Jak je znázorněno na obrázku 1A, dietní přídavek relativně nízké koncentrace TF (1 mg/ml) mírně prodloužil životnost vrtulí a vysoká koncentrace TF (2,5 mg/ml) měla významně pozitivní vliv na prodloužení životnosti. Pozoruhodné je, že dlouhodobý příjem vysokých koncentrací TF (2,5 mg/ml) vedl k přibližně 8dennímu zvýšení průměrné délky života samic much (obrázek 1B), což naznačuje prospěšnou roli TFsinu při regulaci dlouhověkosti u Drosophila. Podobné výsledky byly získány, když jsme testovali potenciální účinky dalších TF na délku života samců much w'*'''8 (obrázky S1A a S1B).
Obrázek 2. Theaflaviny zabraňují věkové dysfunkci střev a dysbióze mikroflóry u Drosophila
(A a B) Ztráta střevní integrity byla testována pomocí Smurftest ve věku 10 dnů, 30 dnů, 40 dnů a 50 dnů dospělých samic w18. Příklady non-Smurf a Smurf byly ukázány v (A). Procenta Šmoula v různých uvedených skupinách byla analyzována a ukázána v (B).
(C) Bakteriální množství uložené pomocí qPCR genu 16S rRNA v ženských souborech w18 z různých uvedených skupin bylo analyzováno a ukázáno.
(DF) Bylo provedeno sekvenování komenzálního bakteriálního genu 16S rRNA. Byly analyzovány a prezentovány podíly bakteriálních taxonů (D), tepelná mapa hlavních mikrobiálních taxonů (F) a relativní četnost gamaproteobakterií (F).
Obrázek 2. Pokračování
(G a H) Střeva byla vypreparována z uvedených samic much krmených 2,5 mg/ml TF nebo bez TF jako kontrola ve věku 10 a 40 dnů. Snímky sklíček středního střeva byly zachyceny fluorescenční mikroskopií pro signály GFP (G). Statistická analýza ukazující procenta GFP-pozitivních buněk je uvedena v (H).
(I) Střeva z uvedených samic much byla shromážděna a podrobena imunobarvicím testům využívajícím protilátky proti fosforylovanému histonu 3(pH3). Byly analyzovány a ukázány statistické výsledky kvantifikující pH3-pozitivní buňky na střevo. V B, C, H a jsou data analyzována dvoustranným Studentovým testem a jsou zobrazena jako průměr ± SEM.NS, nevýznamné,*p<><0.001. see="" also="" figure="">
Je známo, že ETF mají hořkou chuť a hořkým potravinám se spotřebitelé, včetně ovocných mušek a savců, obvykle vyhýbají (Yamazaki et al., 2014; Yang et al., 2018). Poté jsme se snažili objasnit, zda TF mohou ovlivnit příjem potravy Drosophila, protože předchozí studie prokázaly, že dietní omezení vede k prodloužené délce života jak u obratlovců, tak u bezobratlých (Hudry et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Moger-Reischer et al. ., 2020). Abychom toho dosáhli, nejprve jsme provedli café test, široce používaný přístup k přímému a přesnému měření rychlosti podávání pomocí kapilárního podavače obsahujícího kapalné médium, jak bylo popsáno dříve (Ja et al., 2007). Jak je znázorněno na obrázcích 1C a S1C, dietní suplementace TF (1 mg/ml a 2,5 mg/ml, v tomto pořadí) téměř nezměnila spotřebu potravy testovaných much. Abychom to dále potvrdili, použili jsme Fluorescein jako indikátor potravy (Rera et al., 2012; Wang et al., 2005) a provedli test přirozeného krmení (Danilov et al., 2015). Jak je znázorněno na obrázcích 1D a S1D, nepodařilo se nám pozorovat žádné korelace mezi suplementací TF a úrovněmi příjmu potravy. Celkově naše výsledky naznačují, že prospěšná role TF při prodlužování délky života nemusí být způsobena dietním omezením u Drosophila.
Další TF jsou nutné pro ovlivnění energetické homeostázy Drosophila
Bylo navrženo, že polyfenoly z černého čaje mají pozitivní účinek na prevenci obezity tím, že inhibují trávení, absorpci a příjem lipidů a sacharidů, čímž snižují příjem kalorií (Cameron et al., 2008). Poté jsme se snažili objasnit, zda prodloužení životnosti LDrosophila regulované TF je způsobeno změnami v absorpci živin a ukládání energie. Za tímto účelem jsme nejprve zkoumali hladiny triacylglyceridů (TAG), jednoho z nejčastěji detekovaných lipidových metabolitů (Tennessen et al., 2014), u samic much po celý jejich život, jak bylo popsáno dříve (Fan et al., 2017).koupit cistancheJak je znázorněno na obrázku 1E, léčba TF téměř neovlivnila celkové množství TAG v různých věkových bodech. Když jsme dále detekovali obsah glykogenu a kvantifikovali cirkulující sacharidy (glukózu a trehalózu) pomocí soupravy Hexokinase (Li et al., 2018; Ten-nessen et al., 2014), výsledky ukázaly, že nebyly žádné zjevné změny mezi vzorky s nebo bez léčby TF (obrázky 1F-1H). Je třeba poznamenat, že konzistentní výsledky byly získány, když jsme zkoumali metabolické fenotypy využívající samčí w118 jako zvířecí modely (obrázky S1E-S1H). Souhrnně tato data naznačují, že dietní suplementace TF je pro regulaci sacharidové a energetické homeostázy po celou dobu života Drosophila nezbytná.
Dále jsme zkoumali kinetiku přirozeného stárnutí Drosophila v rámci dietní intervence TF provedením rychlých iterativních negativních testů geotaxe (RING), jak bylo popsáno dříve (Dilliane et al., 2017; Staats et al., 2018). Jak je znázorněno na obrázcích 1l, 1J, S1l a S1J, indexy stoupání ve věku (40 dní) w1118 (ženy i muži) ve skupinách suplementace TF se výrazně zlepšily (téměř 12procentní nárůst u žen a téměř 18procentní zvýšení u mužů ) ve srovnání s kontrolními skupinami, což naznačuje, že TF potenciálně zlepšují šplhání a lokomotorické aktivity Drosophila.
Theaflaviny zabraňují prosakování střev a dysbióze mikroflóry
Předchozí studie ukázaly, že pohybové aktivity a délka života vrtulí velmi souvisí se zdravotním stavem hostitele, jako je pohlaví, strava, věk a genotyp (Caruso et al., 2013; Heintz a Mair, 2014). Nedávno několik linií důkazů prokázalo, že zachování homeostázy intestinální Imd signalizace zlepšuje integritu střeva prevencí nadměrné proliferace ISC a prekurzorových buněk a oddálením věkem nastupující střevní epiteliální dysfunkce, což zase pozitivně přispívá ke zdraví organismu (Clark et al. , 2015; Guo a kol., 2014). U Drosophila je zkrácená délka života úzce spojena s dysfunkcí střevní epiteliální bariéry a vývoj integrity této bariéry během stárnutí má za následek prodloužení životnosti (Clark et al., 2015; Guoet al., 2014; Jet al., 2019). Snažili jsme se tedy určit, zda TF mění integritu střeva provedením testu Smurf, což je metoda, která byla popsána dříve (Clark et al., 2015; Rera et al., 2011). Jak je znázorněno na obrázku 2A, testované ovocné mušky, u kterých byla modrá barviva omezena na trávicí trakt, byly označovány jako nešmoulové (levý panel na obrázku 2A). Pokud byla pozorována modrá barviva
Obrázek 3. Pokračování
(EG) Střeva byla izolována ze souborů samice w1118 krmených 2,5 mg/ml TF nebo bez TF jako bazální ve věku 10 dnů, 30 dnů, 40 dnů a 50 dnů, v daném pořadí. Celková RNA byla extrahována a podrobena analýze aRT-PCR. Hladiny exprese mRNA diptericinu (F), attacinu (F) a cekropinu A1(G) byly analyzovány a ukázány. V EG jsou data analyzována dvoustranným Studentovým t-testem a ukázána jako průměr ± SEM.NS, nevýznamné, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">
prosakující ze střev do břicha, hostitelé byli počítáni jako Šmoula (pravý panel na obrázku 2A). V souladu s předchozími zjištěními (Clark et al.,2015) se podíly Šmoula během stárnutí postupně zvyšovaly (obrázek 2B). Zajímavé je, že podíl dospělých šmoulí ve skupinách krmených TF ve srovnání s věkově odpovídajícími kontrolami u obou samic výrazně poklesl (z 8,2 procenta na 3,7 procenta, z 19,4 procenta na 15,6 procenta a z 35,4 procenta na 27,1 procenta u skupin ve věku 30 dnů, 40 dnů, respektive 50 dnů, obrázek 2B) a dospělí muži (z 2,7 procenta na 0,9 procenta, z 6,9 procenta na 0,9 procenta a z 8,3 procenta na 2,7 procenta ve věku 30 let dnů, 40 dnů a 50 dnů, v tomto pořadí, obrázek S2A), což naznačuje, že TF mohou zabránit dysfunkci střevní bariéry u starých ovocných mušek. Je třeba poznamenat, že jsme pozorovali větší pokles procenta Šmoula u mužů (snížení o téměř 65,8 procenta, 86,9 procenta a 67,4 procenta ve věku 30 dnů, 40 dnů a 50 dnů, v tomto pořadí) než ve věku -shodné samice (snížené o téměř 54,1 procenta, 19,5 procenta a 23,3 procenta ve věku 30 dnů, 40 dnů a 50 dnů, v tomto pořadí), což naznačuje, že TF mohou hrát lepší roli při snižování prosakování střev u samců much.
Předchozí studie naznačovaly, že dysfunkce střevní bariéry s nástupem věku často koreluje s dysbiózou střevní mikroflóry (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014). Zkoumali jsme tedy střevní komenzální bakteriální složení po suplementaci TF. Nejprve jsme použili univerzální primery a provedli jsme kvantitativní PCR experimenty pro kvantifikaci hladin bakteriálního genu 16S rRNA. Jak je znázorněno na obrázku 2C, ve starých řezech celková bakteriální populace z intervenčních skupin TF vykázala výrazné snížení (téměř 45 procent -55 procent) ve srovnání s kontrolami, což naznačuje, že suplementace TF pravděpodobně zabraňuje expanzi mikrobioty během stárnutí . Poté jsme provedli metagenomiku, abychom podrobně prozkoumali změny ve střevní mikrobiální komunitě způsobené doplňováním stravy TF. Jak je znázorněno na obrázcích 2D-2F, podíl gamaproteobakterií, u nichž bylo zjištěno, že jejich expanze úzce souvisí se selháním střevní bariéry (Clark et al., 2015), byl zjevně snížen suplementací TF ve starých střevech ( téměř 7procentní snížení), což znamená, že TF pozitivně přispívají k homeostáze střevní mikroflóry během stárnutí u Drosophila.
Theaflaviny zlepšují střevní proliferativní homeostázu u Drosophila
We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), ve kterém byly střevní kmenové buňky (ISC) a progenitorové buňky označeny GFP. Jak je znázorněno na obrázcích 2G a 2H, počet GFP-pozitivních buněk v intervenčních skupinách TF ve věku 40 dnů (bylo počítáno 20 střev) byl mnohem nižší (téměř 29,7 procenta) než u kontrol odpovídajícího věku (téměř 47,6 procent a Bylo spočítáno 19 střev), což naznačuje, že TF mohou inhibovat nadměrnou proliferaci ISC s věkem. Dále jsme provedli experimenty s imunobarvením s použitím protilátek proti fosfo-histonu 3 (pH3), specifickému markeru pro mitotické buňky ve střevních tkáních. Pozorovali jsme méně pH3-pozitivních buněk ve střevech u starých dospělých s doplňkem TF (průměrný počet byl 20,6) než u buněk z kontrol (průměrný počet byl 39,5, obrázek 2). Celkově vzato, naše výsledky naznačují, že dietní suplementace TF zlepšuje střevní proliferativní homeostázu a zabraňuje dysplazii mikroflóry s nástupem věku, čímž oddaluje stárnutí u Drosophila.
Theaflaviny negativně modulují střevní Imd signály
Abychom prozkoumali základní molekulární mechanismy, kterými TF pozitivně přispívají k homeostáze střeva Drosophila, provedli jsme analýzu RNA-seq s využitím střevních vzorků odpovídajících věku od dospělých žen w1118 léčených s TF nebo bez nich. Analýzy fragmentů na kilobázi na milion (FPKM) naznačovaly, že celkové vzorce genové exprese byly mezi dvěma experimentálními skupinami podobné (obrázek 3A). Další analýza diferenciální exprese však identifikovala celkem 229 odlišně exprimovaných genů, z nichž 99 bylo upregulováno a 126 bylo regulováno směrem dolů (obrázek 3B). Je zajímavé, že analýza genové ontologie těchto genů odhalila, že dráha imunitní reakce byla vysoce změněna dietním doplňkem TF (obrázek 3C).
U Drosophila bylo prokázáno, že vrozené imunitní signální dráhy hrají dominantní roli při regulaci střevní homeostázy a dlouhověkosti s nástupem věku (Clark et al, 2015; Guo et al, 2014). Poté jsme se zaměřili na zkoumání vzorců exprese antimikrobiálních peptidů (AMP) downstream od vrozených imunitních signálů. Jak je znázorněno
Obrázek 4. Pokračování
(D) Purifikované proteiny Imd byly inkubovány s různými koncentracemi TF (50 uM, 100 uM, respektive 200 uM) při teplotě místnosti po dobu 5 minut. Vzorky byly poté podrobeny fluorescenční emisní spektrální analýze za použití uvedených vlnových délek (excitace při 430 nm, emise od 450 nm do 550 nm s šířkou štěrbiny 5 nm). Vzorek bez TF byl použit jako základní kontrola.
（E and F）Lysates of guts from NP11>Mouchy Myc-Imd byly připraveny a inkubovány s TF (100 μM) při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Pro analýzu agregátů proteinu Imd byly provedeny testy SDD-AGE (horní panel v E) a SDS-PAGE (spodní panel v E). Jako kontrola plnění byl použit tubulin.cistanchPro kvantifikaci kondenzátů Imd v různých vzorcích byla provedena denzitometrická analýza a výsledky byly uvedeny v (F). (G) Reprezentativní chromatogram vzorku TF.
(H a I) Purifikované proteiny Flag-Imd byly inkubovány s TF, TF1, TF2a, TF2b nebo TF3 (100 μM pro každý vzorek) nebo se stejným objemem pufru (kontrola) při pokojové teplotě po dobu 30 minut, jak je uvedeno. Vzorky byly poté podrobeny testům SDD-AGE (horní panel v H) a SDS-PAGE (dolní panel v H), aby se určily agregační vzorce Imd. Byla provedena denzitometrická analýza pro kvantifikaci kondenzátů Imd v různých vzorcích a ukázána v (). V C, F a I jsou data analyzována dvoustranným Studentovým testem a ukázána jako průměr ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">
na obrázku 3D jsou geny AMP řízené cestou imunitní nedostatečnosti (Imd), včetně diptericinu A (DptA), diptericinu B (DptB), attacinu A (AttA), cekropinu A1 (CecA1), cekropinu A2 (CecA2) a cecropin C (Cece), byly významně sníženy (o 39,4 procenta, 72,3 procenta, 10,5 procenta, 86,5 procenta, 99,8 procenta a 36,1 procenta, v tomto pořadí) ve skupinách léčených TF ve srovnání s kontrolními skupinami. Abychom dále potvrdili výsledky získané z analýzy RNA-seq, provedli jsme kvantitativní reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakci (gRT-PCR), abychom kvantifikovali relativní hladiny exprese genů AMP souvisejících s Imd ve vzorcích střeva Drosophila získaných ve čtyřech různých věkových bodech. včetně 10 dnů, 30 dnů, 40 dnů a 50 dnů. Jak je znázorněno na obrázcích 3E-3G, hladiny exprese mRNA určitých genů, včetně diptericinu, attacinu a cekropinu A1, byly významně sníženy (téměř o 35,9 procenta -66,6 procenta) u TF léčených zestárlé vnitřnosti. Souhrnně naše data odhalila, že TF potenciálně antagonizovaly aktivaci Imd signální dráhy ve střevních buňkách Drosophila během stárnutí.
Theaflaviny jsou nepostradatelné pro transkripční regulaci Imd dráhy nebo ubikvitinaci Imd
Snažili jsme se prozkoumat asociaci mezi TF a Imd a provedli jsme test povrchové plasmonové rezonance (SPR), jak bylo popsáno dříve (Lan et al., 2020). Jak je znázorněno na obrázku 4A. TF vykazovaly střední vazebnou afinitu s purifikovaným proteinem Imd při odhadované konstantě Kp 8,078 uM. Pak máme tendenci určit, jak TF řídí střevní Imd signální dráhu. Na základě výsledků analýzy transkriptomu z dat RNA-seq jsme zjistili, že úrovně exprese klíčových regulačních faktorů v signální dráze Imd, jako jsou PGRP-LC, Imd a Relish, byly léčbou TF téměř nezměněny (obrázek S3A ). Dále jsme shromáždili vzorky střev od much, které byly podrobeny dietnímu doplňku s nebo bez TF v různém věku, a provedli jsme experimenty qRT-PCR, abychom specificky detekovali expresní vzorce těchto genů. Jak je znázorněno na obrázku S3B, hladiny mRNA určitých genů, včetně effete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, bendless, relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny a diap2, byly mezi kontrolními skupinami podobné. a TFs intervenční skupiny, což naznačuje, že TF se nepodílejí na regulaci Imd signálů na transkripční úrovni.
Dále jsme zkoumali profily ubikvitinace Imd, protože předchozí studie naznačovaly, že ubiguitinace Imd je nezbytná pro následnou signální transdukci v dráze Imd (Myllymaki et al., 2014; Zhou et al., 2005). Nejprve jsme provedli in vitro test posunu E1 a zjistili jsme, že léčba TF nemá žádný zjevný vliv na enzymatické reakce E1 a ubikvitinu za vzniku konjugovaného E1/Ub (obrázek S4A). Kromě toho jsme transfekovali buňky Drosophila S2 plasmidy exprimujícími Flag-značený Imd spolu s HA-značeným Ub a poté jsme buňky ošetřili s nebo bez TF. Další testy ubikvitinace naznačovaly, že suplementace TF sotva ovlivnila hladiny ubikvitinovaného Imd v kultivovaných buňkách (obrázky S4B a S4C). K určení vztahů mezi TF a ubikvitinací Imd in vivo jsme použili transgenní mouchu P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd};P{Tub-Gal80*} (označovanou jako NP1* s > Myc-Imd), ve kterém byl protein Imd značený Myc vysoce exprimován ve střevních buňkách (obrázek S4D). Naše experimenty s ubikvitinací ukázaly, že dietní suplementace TF byla pro modulaci ubikvitinace Imd ve střevních tkáních nezbytná (obrázky S4D a S4E). Celkově naše výsledky ukázaly, že TF negativně řídí signály Drosophila Imd tím, že neovlivňují ubikvitinační vzorec Imd.
Theaflaviny brání hromadění kondenzátu Imd
Nedávná studie naznačila, že agregace Imd je nezbytná pro aktivaci downstream genů v dráze Imd (Kleino et al., 2017). Poté jsme se snažili prozkoumat, zda TF regulují proces
Obrázek 5. Pokračování
(F a G) Samice w18 (označované jako imd plus/plus), imd' heterozygotní a homozygotní mutanti (označované jako imd plus /- a imd-/-, v tomto pořadí) byly chovány jako standardní krmiva pro Drosophila (označovaná jako Basal) nebo dietní suplementace s 2,5 mg/ml (označované jako TF) a poté byly podrobeny testu životnosti. Křivka přežití (F) a střední délky života (G) byly analyzovány a ukázány.
V a F byl pro statistickou analýzu použit test Log Rank. V BE a byl pro statistickou analýzu použit dvoustranný Studentův t-test a data jsou sh jako průměr ± SEM. NS, nevýznamné, *str<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">
Imd tvorba agregátu. Nejprve jsme purifikovali Myc-značené Imd proteiny z kultivovaných S2 buněk a inkubovali proteiny s různými koncentracemi TF (obrázek 4B). Je zajímavé, že jsme zjistili, že TF výrazně zabraňují agregaci Imd (snížené o 81,7 procenta -89,7 procenta, obrázky 4B a 4C), jak naznačují naše testy elektroforézy na semidenaturačním detergentu na agarózovém gelu (SDD-AGE). Pro potvrzení tohoto zjištění jsme dále provedli vazebné testy thioflavinu-T a získali konzistentní výsledky (obrázek 4D). Nakonec jsme vychovali transgenní mouchy NP1ts > Myc-Imd, které byly podrobeny doplňku stravy s TF nebo bez TF, a odebírali jsme vzorky střev od starých dospělých. Experimenty SDD-AGE naznačovaly, že agregace Imd byla výrazně downregulována TF ve střevních buňkách (snížena o 16,7 procent -22 procent, obrázky 4E a 4F).
Abychom určili, jak TF přispívají k řízení sestavování kondenzátu Imd, podrobili jsme TF analýze HPLC a zjistili jsme, že obsahují hlavně čtyři druhy monomerů (obrázek 4G), konkrétně theaflavin (TF1), theaflavin 3-O-galát ( TF2a), theaflavin 3'-O-galát (TF2b) a theaflavin 3,3'-di-O-galát (TF3), které byly v souladu s předchozími zprávami (Li et al., 2013; Takemoto a Takemoto, 2018) . Poté jsme inkubovali každou z těchto chemikálií s purifikovaným Imdproteinem a provedli SDD-AGE experimenty. Jak je znázorněno na obrázcích 4H a 4l, ošetření všech těchto TFmonomerů vedlo k výraznému snížení (o 59,5 procenta, 60,9 procenta, 58,4 procenta, 58,2 procenta a 55,8 procenta pro TF, TF1, TF2a, TF2b a TF3, v tomto pořadí) v agregované úrovně Imd. Souhrnně naše výsledky naznačovaly, že TF negativně regulují signální dráhu Drosophila Imd pravděpodobně řízením chování kondenzátů Imd.
Theaflaviny prodlužují životnost Drosophila způsobem závislým na Imd
To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>plus )mouchy. protože Relish je klíčovým transkripčním faktorem zodpovědným za exprese genu AMP po směru Imd (Myllymaki et al., 2014). Jak je znázorněno na Fiqures S5C a S5D. dietní přídavek TF výrazně prodloužil životnost kontrolních mušek a tomuto prodloužení životnosti bylo u Relish RNAi much významně zabráněno. Souhrnně naše data ukázala, že dietní suplementace TF pozitivně přispívá k délce života Drosophila pravděpodobně v závislosti na intestinálních Imd signálech.
Abychom zjistili, zda k prodloužení životnosti pomocí TFstill dochází v axenickém pozadí, provedli jsme testy životnosti s použitím samic w1118 v axenických podmínkách. Jak je znázorněno na obrázcích S5E a S5F, přidání různých koncentrací TF (1 mg/ml a 2,5 mg/ml) téměř neovlivnilo poměr úmrtnosti a průměrné délky života u dospělých w18. Protože axenické podmínky chovu mohou do značné míry zabránit hojné mikrobiotě, a tím omezit signály Imd v řezech (Clarke al., 2015), naše data naznačují, že TF prodlužují životnost Drosophila prostřednictvím modulace vrozených imunitních signálů regulovaných střevní mikrobiotou.
Obrázek 6. Theaflaviny zmírňují DSS-indukovanou kolitidu u CD-1 myší
(A) Léčba TF neovlivnila spotřebu vody u různých skupin CD-1 myší.
(BD) Podání různých koncentrací TF sondou (1 mg/ml, 2,5 mg/ml a 5 mg/ml) zlepšilo zkrácení tlustého střeva a zvětšení sleziny způsobené DSS u CD-1 myší. Byly ukázány reprezentativní snímky (B) a statistické analýzy tlustého střeva (C) a sleziny (D). (E) Podávání různých koncentrací TF (1 mg/ml, 2,5 mg/ml a 5 mg/ml, v tomto pořadí) zabránilo prosakování střev vyvolanému DSS u CD-1 myší. (F a G) Z uvedených skupin myší byla odebrána tlustá střeva. Celková RNA byla extrahována a podrobena testům qRT-PCR k detekci hladin exprese mRNA TNFa(F) a IL-6 (G).
(HL) Střeva z různých skupin myší byla shromážděna podélně a podrobena zkouškám barvení HE. Vzorky byly zkoumány mikroskopicky a byly získány a ukázány reprezentativní snímky uvedených vzorků （HL）. Měřítko, 40 μm. (MQ') SEM snímky ukazující mikrotrichomy tlustého střeva z různých uvedených vzorků. Měřítko, 50 um (MQ) a 4 um (M'-Q').
V CG jsou data analyzována dvoustranným Studentovým testem a ukázána jako průměr ± SEM.NS, nevýznamné, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">
Theaflaviny zmírňují kolitidu vyvolanou DSS u CD-1 myší
K dalšímu zkoumání potenciální role TF při udržování střevní homeostázy u savců byly CD-1 myši použity k indukci kolitidy pomocí dextransulfátu sodného (DSS). Myším byly intragastricky podávány různé koncentrace TF (1 g/l, 2,5 g/l nebo 5 a/l) nebo voda jako kontrola po dobu čtyř týdnů, poté následovala léčba 2% DSS v pitné vodě po dobu 7 dnů. Abychom zjistili, zda TF ovlivňují množství pití DSS napříč různými skupinami myší, monitorovali jsme pití myší každý den. Jak je ukázáno ve Fiqure6A, léčba TF je nezbytná pro ovlivnění konzumace nápojů u myší s kolitidou vyvolanou DSS, myši léčené DSS vykazovaly syndrom kolitidy s průjmem a / nebo hematochezií, kterým bylo zabráněno léčbou TF v závislosti na dávce (obrázky S6A-S6E).cistanche AustrálieKromě toho intervence s TF zachránila zkrácení délky tlustého střeva způsobené DSS a zlepšila zvětšení sleziny (obrázky 6B-6D).
Poté jsme použili dextran-4000-FITC (FITC-DX) ke zkoumání funkce střevní bariéry těchto myší. Jak je znázorněno na obrázku 6E, myši ze skupin léčených DSS vykazovaly vysokou koncentraci FITC-DX ve vzorcích krve, což ukazuje na prosakování střev u těchto zvířat. Nicméně intervence s TF významně zabránila transportu FITC-DX z trávicích orgánů do oběhový systém (sníženo o 56,1 procenta -77,5 procenta, obrázek 6E). Je pozoruhodné, že podávání TF nezměnilo střevní permeabilitu myší za normálních podmínek (obrázek S6F). Protože zánět hraje klíčovou roli ve vývoji kolitidy u myšího modelu, provedli jsme dále experimenty qRT-PCR, které ukazují, že léčba TF významně snížila expresi IL-6 a TNF ve střevech myší léčených DSS (obrázky 6F a 6G).
Pro další analýzu patologických změn v tlustém střevě jsme provedli testy barvení hematoxylinem-eosinem (HE). Jak je znázorněno na obrázcích 6H-6L a S6G-S6J, závažné poškození epitelu vyvolané DSS bylo výrazně zlepšeno léčbou TF v závislosti na dávce. Zobrazování těchto střevních vzorků skenovacím elektronovým mikroskopem dále poskytlo konzistentní výsledky (obrázky 6M-6Q' a S6K-S6N'). Celkově naše zjištění ukázala, že TF hrají prospěšnou roli při ochraně funkce střevní bariéry u hmyzu i savců.
DISKUSE
V této studii jsme zkoumali fyziologické funkce TF při modulaci střevní homeostázy a dlouhověkosti a základní molekulární mechanismy. Prokázali jsme, že suplementace TF pozitivně přispívá k prevenci věkem nastupující dysbiózy střevní mikrobioty a oddálení dysfunkce střevního epitelu, čímž prodlužuje životnost Drosophila. Naše in vitro a in vivo mechanistické studie odhalily, že TF pravděpodobně hrají negativní roli při kontrole signální dráhy Imd blokováním koalescence Imd. Navíc jsme zjistili, že kolitida vyvolaná DSS může být účinně zmírněna suplementací TF u CD-1 myší. Naše výsledky podporují názor, že TF výhodně přispívají ke střevní homeostáze u bezobratlých i obratlovců.
Doplňky stravy s theaflaviny prodlužují Drosophila životnost
Konzumace čaje je celosvětově populární a je na druhém místě po spotřebě vody (Rothenberg a Zhang, 2019). Četné studie se zaměřily na fyziologické funkce často prostřednictvím experimentálních i klinických přístupů (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Rothenberg a Zhang. 2019; Spindleret al., 2013; Takemoto a Takemoto, 2018; Unno a kol., 2020; Zhou a kol., 2020. Bylo rozsáhle prokázáno, že čaj prospívá zdraví snížením hladiny lipidů a prostřednictvím účinků proti obezitě a hlavními funkčními sloučeninami v čaji jsou katechiny, zejména epigallocatechin gallát (EGCG) (Abbas a Wink, 2009; Modernelli et al., 2015; Niu et al., 2013; Wagner et al., 2015; Xiong et al., 2018). Předchozí studie také ukázaly, že zelený čaj a černý čaj může prodloužit zdraví a životnost ovocných mušek (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), červů (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) a krys (Imran et al., 2015 .,2018; Niu et al.2013) a hlavním regulačním mechanismem je účinná prevence oxidačního stresu pomocí EGCG prostřednictvím modulace ROSsignálů.cistanche výhody,Nicméně, zda TF, jako charakteristické "zlaté" sloučeniny v černém čaji, hrají roli při regulaci stárnutí a délky života, zůstává velkou neznámou. Tato studie poskytuje přesvědčivé důkazy naznačující, že intervence TF je nezbytná pro ovlivnění příjmu potravy a dlouhodobý příjem TF prostřednictvím stravy významně prodlužuje životnost samců i samic ovocných mušek. Tato zjištění poskytují pokyny pro další studie o funkcích TF v dlouhověkosti savců.
Theaflaviny zlepšují dysbiózu mikroflóry s nástupem věku a podporují střevní homeostázu Progresivní nerovnováha proliferativní homeostázy a regenerační kapacity je charakteristickým znakem stárnutí a nemocí s věkem (Clark et al., 2015; Heintz a Mair, 2014; Maynard a Weinkove, 2018; a kol., 2012). Chronický zánět je spojen se ztrátou homeostázy a zvýšeným výskytem rakoviny u stárnoucích organismů (Bartke et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Xiao et al., 2020). To je zvláště významné u bariérových epitelů, jako je střevní epitel (Guo et al., 2014; Maynard a Weinkove, 2018). S modelem vývoje dysplazie související s věkem ve stárnoucím střevě jsme prokázali, že zlepšení interakcí mezi hostitelem a komenzálem ve stárnoucích bariérových epitelech by mohlo podpořit zdraví a délku života. Použili jsme řadu neinvazivních přístupů k testování střevní funkce a dynamiky mikrobioty během stárnutí. Za prvé, test Smurf ukázal pozitivní roli TF při regulaci dysfunkce epiteliální bariéry během stárnutí. Poté test imunobarvení pomocí několika transgenních much odhalil, že TF zpožďovaly nadměrnou proliferaci ISC a obrat diferencovaných buněk. Nakonec sekvenování mikrobiomu naznačovalo, že TF downregulují expanzi střevní komenzální mikroflóry s nástupem věku. Tyto výsledky silně naznačují, že TF hrají klíčovou roli při oddálení procesu stárnutí hostitele udržováním střevní homeostázy.
Theaflaviny zmírňují nadměrné imunitní reakce ve střevě negativní regulací Imd signalizace
Bylo navrženo, že je třeba udržovat křehkou rovnováhu mezi imunitní funkcí střev a mikrobiotou, aby byla zajištěna dlouhodobá homeostáza bariérového epitelu (Guo et al., 2014; Maynard a Weinkove, 2018). Předchozí studie také ukázaly, že chronický nadměrný zánět ve střevě je spojen s dysfunkcí bariérového epitelu související s věkem a je charakteristickým znakem stárnutí (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014; Ji et al., 2019) . Udržování zdravé komenzální populace zachováním vrozené imunitní homeostázy v takovém epitelu je tedy slibným přístupem k podpoře zdraví a dlouhověkosti (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Clark et al., 2015). Prozkoumat molekulární mechanismy pomocí které TF oddalují stárnutí, provedli jsme analýzu RNA-seq s použitím vypreparovaných střev s nebo bez ošetření TF. Naše data naznačují, že skupina genů vysoce exprimovaných ve střevech kontrolních ovocných mušek ve srovnání se skupinou zvířat ošetřených TF byla obohacena o geny klasifikované jako geny "imunitní reakce". Další bioinformatická analýza a testy get-PCR odhalily, že exprese genů AMP souvisejících s Imd byla dramaticky inhibována přidáním TF do stravy. Výsledky experimentů na myších CD-1 využívajících DSS k vyvolání abnormálních imunitních reakcí ve střevech dále potvrdily představu, že TF fungují jako ochránci proti střevním zánětům.
Theaflaviny potlačují signály stanovením amyloidního uspořádání Imd
Jak TF negativně regulují signální dráhu Imd? Na základě výsledků transkriptomové analýzy jsme zjistili, že TF jsou nepostradatelné pro transkripční regulaci klíčových faktorů v Imd signální dráze. Zajímavé je, že jsme pozorovali zjevnou vazebnou afinitu TF s purifikovaným proteinem Imd testem SPR, který naznačoval pravděpodobnost, že TF mohou hrát roli při kontrole chování proteinu Imd nebo jeho posttranslačního modifikačního procesu. Předchozí studie zdůraznily klíčovou roli ubikvitinace při přenosu signálu Imd (Kleino a Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014) a prevence ubikvitinace Imd vede k hlubokému vypnutí signalizace Imd (Myllymaki et al., 2014; Thevenon a kol., 2009). Naše in vitro a in vivobikvitinační testy však ukázaly, že TF téměř neovlivňují vzor ubikvitinace Imd. Nedávná studie ukázala, že pro aktivaci dráhy Drosophila Imd po rozpoznání bakteriálních peptidoglykanů je nutná tvorba amyloidu (Kleino et al., 2017). Je zajímavé, že naše testy SDD-AGE a ThTbinding naznačovaly, že koalescenci Imd brání TF. Prevence agregace Imd snížením nebo mutací Imd ve střevních buňkách zjevně zvrátila příznivé účinky TF na prodloužení životnosti. Abychom dále potvrdili naše zjištění, bylo by zajímavé prozkoumat, zda TF již nejsou funkční pro prodloužení životnosti u ovocných letců, když je konzervovaný kryptický motiv RHIM (cRHIM, aminokyseliny od 118 do 121h) Imd specificky vyřazen a zničen. na základě zjištění, že zločin v Imd je zásadní pro jeho agregaci a tvorbu amyloidu (Kleino et al., 2017). Naše studie však zdůrazňuje klíčovou roli TF při kontrole střevní homeostázy a procesu stárnutí, možná prostřednictvím modulace koalescence Imd. Budoucí studie by se měly zaměřit na zkoumání, které zbytky nebo oblasti Imd jsou vázány TF a jak tato vazba vede k prevenci kondenzace Imd. Naše zjištění v savčím systému navíc ukázala, že TF mohou účinně chránit tlusté střevo před zánětem způsobeným exogenní jedovatou chemickou látkou DSS, což naznačuje konzervovanou regulační roli TF při udržování střevní homeostázy. Stojí za to prozkoumat, zda TF hrají roli v řízení sestavování proteinů v savčích tkáních.
Tento článek je převzat z zhongwenxie@ahau.edu.cn
