Charakteristický HPLC–MS profil granulí formule Cistanche Deserticola
Oct 13, 2025
Autoři: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Příslušnost: Shanghai Institute for Food and Drug Control; Klíčová laboratoř NMPA pro kontrolu kvality tradiční čínské medicíny, Šanghaj 201203, Čína
Abstraktní
Charakteristická metoda chromatografického profilování pro granule vzorce Cistanche deserticola byla založena na HPLC–MS. Za použití ověřených kousků odvaru Cistanche deserticola a echinacosidové referenční látky jako referencí bylo deset šarží vzorků extrahováno přímo 50% methanolem a analyzovány pomocí HPLC. Separace byla provedena na koloně Phenomenex Luna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) s gradientem acetonitril-0,1% kyselina mravenčí při 1,0 ml/min, 30 stupních a UV detekcí při 330 nm. Byl zkonstruován referenční charakteristický chromatogram s devíti společnými píky, mezi nimiž bylo pět píků identifikováno pomocí LC/Q‑TOF‑MS. Deset šarží vykazovalo podobnost větší nebo rovnou 0,981. Metriky přesnosti, stability a opakovatelnosti charakteristického profilu byly uspokojivé. Metoda je jednoduchá, efektivně identifikuje granule formule Cistanche deserticola a lze ji použít pro hodnocení kvality.
Klíčová slova: Cistanche deserticola; formule granule; charakteristický chromatogram; echinakosid; verbascosid (akteosid); HPLC; LC–Q-TOF-MS; cistanche výhody; nejlepší cistanche na prodej
Představení Cistanche
Cistanche (Rou Cong Rong)je proslulé tonikum tradiční čínské medicíny (TCM) s tonizujícími, esenci vyživujícími a projímavými účinky na ledviny. Poprvé byl zaznamenán v Shennong's Classic of Materia Medica a uveden jako léčivo nejvyšší třídy. Vydání lékopisu Čínské lidové republiky (část I) z roku 2020 definuje autentické zdroje jako sušené, šupinaté, masité stonky Cistanche deserticola YC Ma nebo Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, s metodami zpracování včetně surového produktu a produktu zpracovaného vínem. Mezi hlavní chemické složky patří fenylethanoidní glykosidy (PhG), iridoidy, lignany a cukry, které podporují farmakologické aktivity, jako je neuroprotekce, anti-aging, hepatoprotekce a projímadlo; vyhlídky na klinické použití jsou široké. Mezi nimi jsou PhG nejaktivnějšími složkami.
Granule receptury Cistanche deserticola jsou jednobylinné granule připravené ze zpracované C. deserticola pomocí moderních výrobních technik pro použití v klinických předpisech. V současné době neexistuje žádná národní norma pro jejich kontrolu kvality. Předchozí studie uváděly metody stanovení obsahu nebo fingerprinting pro granule vzorce C. tubulosa, ale žádná literatura o charakteristických chromatogramech specificky pro granule vzorce C. deserticola. V této studii bylo shromážděno deset šarží, aby se poprvé stanovil charakteristický profil HPLC pro granule vzorce C. deserticola s pěti píky identifikovanými pomocí LC–MS. Tento profil poskytuje účinný a vědecký základ pro přísnou kontrolu kvality granulí formule C. deserticola.
Experimentální cistanche
1.1 Nástroje a činidla
Agilent 1100 HPLC s UV–Vis detektorem a ChemStation (Agilent, USA)
Agilent 1290 Infinity HPLC a Agilent 6530 Q‑TOF MS se zdrojem ESI (Agilent, USA)
Elektronická váha Sartorius (Sartorius Scientific Instruments, Peking, Čína)
Ultrazvuková čistička Elmasonic P (Elma, Německo)
Referenční odvarové kousky Cistanche deserticola a referenční látky echinakosid a verbascosid (akteosid) byly zakoupeny od Národního institutu pro kontrolu potravin a léčiv (šarže č.. 121101‑201603, 111670‑201907, 111530‑201914). Cistanosid A, tubulosid A a isoverbaskosid byly získány od Shanghai Tauto Biotech (šarže č. . 21040621, 20061231, 21040824). Acetonitril (čistota pro HPLC) byl od společnosti Merck; další činidla byla analytické čistoty (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Deset šarží granulí formule C. deserticola (PFKL1–PFKL10), tři šarže kusů odvaru C. deserticola (YP1–YP3) a tři šarže standardních odvarů C. deserticola (BZTJ1–BZTJ3) dodala společnost Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.
1.2 Příprava roztoků
1.2.1 Referenční řešení
Referenční roztok bylin: Navažte 1 g ověřených kousků odvaru C. deserticola do zazátkované kuželové baňky, přidejte 25 ml 50% methanolu, sonikujte (250 W, 35 kHz) po dobu 30 minut, ochlaďte, promíchejte a odstřeďte. Použijte supernatant jako referenční bylinný roztok.
Roztok referenční látky: Připravte echinakosid v koncentraci 0,2 mg/ml v 50% methanolu.
1.2.2 Zkušební roztok
Rozemlete vzorek; přesně navažte asi 1 g do 100ml jantarové odměrné baňky. Přidejte 50 ml 50% methanolu, zazátkujte, protřepejte, zvažte, namočte po dobu 30 minut a sonikujte po dobu 40 minut (250 W, 35 kHz). Nechte vychladnout, znovu zvažte a doplňte ztrátu hmotnosti 50% methanolem. Promíchejte, nechte stát, filtrujte a shromážděte následný filtrát pro analýzu.
1.3 Instrumentální podmínky
Chromatografické podmínky: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 um); mobilní fáze A: acetonitril; mobilní fáze B: 0,1% kyselina mravenčí ve vodě; gradientová eluce: 0–5 min, 12 % A; 5–15 min, 12 %→20 % A; 15–30 min, 20 %→30 % A. Průtok 1,0 ml/min; detekční vlnová délka 330 nm; teplota kolony 30 stupňů; vstřikovací objem 10 μL. Teoretické desky, vypočtené pro vrchol echinakosidu, by měly být větší nebo rovné 5000.
Poznámka: Původní text uvádí „15–30 min, 20 %→30 % A“ dvakrát; toto je interpretováno jako jeden krok.
Podmínky hmotnostní spektrometrie: ESI v pozitivním iontovém módu; rozsah skenování m/z 50–1200. Nastavení zdroje: nebulizér (N2) 35 psi; sušící plyn (N2) 15 l/min při 200 stupních; plášťový plyn (N2) 12 l/min při 350 stupních; kapilára 3,5 kV; fragmentátor 125 V; MS/MS srážkové energie (CID) při 10, 20 a 40 eV.
Výsledky a diskuse
2.1 Předúprava vzorku a vlnová délka detekce
Byla porovnána extrakční rozpouštědla (methanol, 75 % methanol, 50 % methanol, 25 % methanol), extrakční režimy (ultrasonikace, reflux) a časy (10, 20, 40, 60 min). Optimální předúprava byla 50% methanol s 40minutovou ultrasonizací. Protože PhGs v C. deserticola vykazují maximální UV absorpci při 330 nm, byla pro detekci zvolena 330 nm.
2.2 Výběr chromatografických podmínek
2.2.1 Sloupce
Zorbax SB‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100‑5‑C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) a Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) poskytly odpovídající separaci a splnily vhodnost systému; relativní retenční časy (RRT) charakteristických píku byly v rozmezí ±10 % specifikovaných hodnot. Laboratoře si mohou vybrat mezi nimi.
2.2.2 Mobilní fáze
Methanol – 0,1% kyselina mravenčí poskytla špatnou separaci pro většinu píku kromě echinakosidu; proto byl přijat acetonitril – 0,1% kyselina mravenčí a optimalizován na gradient v části 1.3, což poskytuje optimální rozlišení, čísla destiček a stabilní základní linii. Protože se po 30 minutách neeluovaly žádné další píky, byla zahájena re-ekvilibrace na původním složení.
2.3 Přesnost, opakovatelnost a stabilita
S použitím šarže PFKL1 byl testovací roztok připravený podle oddílu 1.2.2 injikován šestkrát za podmínek podle oddílu 1.3. RSD RRT a relativní plochy píku pro devět charakteristických píku byly všechny<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.
2.4 Stanovení charakteristického chromatogramu a technických parametrů
2.4.1 Referenční charakteristický chromatogram
Deset šarží granulí vzorce C. deserticola konzistentně vykazovalo devět charakteristických píků, které odpovídaly retenčním časem devíti píkům v roztoku referenční byliny (obrázky 1–2). Pět píku bylo standardně přiřazeno jako echinakosid, cistanosid A, tubulosid A, verbascosid (akteosid) a isoverbaskosid. Pík echinakosidu přispěl velkým a stabilním podílem celkové plochy píku a byl vybrán jako referenční látka. Chromatografické chování u deseti šarží bylo v podstatě konzistentní.
A.Blanksolution;B.Echinacoside;C.Testsolution;D.Cistanchedeserticola;E.Referenční charakteristický chromatogram.
Seznam specifikací Cistanche Tubulosa
2.4.2 Identifikace vrcholu
Testovací roztoky (oddíl 1.2.2) byly analyzovány pomocí LC–MS v pozitivním i negativním režimu ESI; pozitivní režim poskytl bohatší informace o špičce a byl použit (obrázek 3). Celkem bylo identifikováno devět sloučenin; pět bylo potvrzeno přesnou hmotností, retenčním časem a MS/MS fragmenty za použití standardů (tabulka 1). Vzhledem k tomu, že PhG jsou hlavními účinnými látkami v C. deserticola a že granule receptury jsou připravovány vodnou extrakcí, LC/Q‑TOF‑MS potvrdila PhGs jako hlavní složky. V souladu s tím bylo katalogizováno devět charakteristických píků a pět píků s relativně silnými odezvami bylo anotováno v referenčním chromatogramu.
Obr. 2 HPLC referenční charakteristický chromatogram 3(S):echinakosid;4:cistanosidA;5:tubulosidA; 6: Akteosid; 7: Isoakteosid.
Obr. 3 Extrakční aktuální chromatogram testovacího roztoku 3(S):echinakosid;4:cistanosidA;5:tubulosidA;6:akteosid;7:isoakteosid.
2.4.3 Stanovené relativní retenční časy
Na základě deseti šarží byly průměrné hodnoty RRT (vzhledem k vrcholu S, tj. echinakosidu): 0,77 (vrchol 1), 0,86 (vrchol 2), 1,00 (vrchol 3, S), 1,17 (vrchol 4), 1,27 (vrchol 5), 1,32 1,67 (vrchol 8) a 1,81 (vrchol 9). RRT každého píku by mělo spadat do ±10 % své specifikované hodnoty.
Tabulka 1. Parametry hmotnostní spektrometrie píku chromatografie související sCistanche deserticolaFormule granule
| Vrchol | Jméno | Molekulární vzorec | m/z | Doba uchování (min) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Neznámý | C₅₁H₃₆O₁₁ | 824.2258 | 6.123 |
| 2 | Neznámý | C₃₆H₃₀O₈ | 590.1941 | 6.876 |
| 3 | Echinakosid | C₃₅H₄₆O₂₀ | 809.2467 | 13.646 |
| 4 | Cistanosid A | C₃₆H₄₈O₂₀ | 823.2642 | 16.285 |
| 5 | Tubulosid A | C₃₇H₄₈O₂₁ | 851.2570 | 17.947 |
| 6 | Akteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1931 | 18.464 |
| 7 | Isoacteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1956 | 20.083 |
| 8 | Neznámý | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2044 | 23.446 |
| 9 | Neznámý | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2041 | 25.883 |
2.5 Hodnocení podobnosti
Chromatogramy z deseti šarží byly importovány do "Systému hodnocení podobnosti pro chromatografický otisk prstu TCM (2012A)." Při použití vzorku S1 jako referenčního, metoda mediánu, 0,5minutové časové okno, vícebodová kalibrace a porovnávání dat vytvořily referenční otisk prstu (obrázek 4) s devíti společnými píky. Hodnoty podobnosti pro všech deset šarží byly větší nebo rovné 0,981 (0,981–0,999), což ukazuje na vysokou podobnost mezi šaržemi.
2.6 Převod množství a kvality z odvarových kousků na standardní odvarové a formulové granule
Porovnání píku ukázalo, že kousky odvaru C. deserticola, standardní odvar a granule formule sdílely devět charakteristických píku, včetně pěti přiřazených píku (echinakosid, cistanosid A, tubulosid A, verbascosid a isoverbaskosid) (obrázek 5). Charakteristické profily byly vysoce korelované a pravidla přenosu z kousků odvaru → standardní odvar → granule receptury byla jasná. Od kousků odvaru po standardní odvar se plocha píku 6 (verbascosid) výrazně zmenšila v souladu s tepelnou labilitou verbascosidu.
Obr. 4 Překrytí HPLC charakteristického chromatogramu Cistanche deserticola Formulagranules
2.7 Porovnání charakteristických chromatogramů mezi granulemi vzorce C. deserticola a C. tubulosa
C. deserticola i C. tubulosa obsahují echinakosid, cistanosid A, verbascosid, isoverbaskosid a tubulosid A. Tyto dva druhy se však významně liší obsahem echinakosidu a cistanosid A je v C. tubulosa přítomen pouze ve stopových množstvích. Proto echinakosid a cistanosid A mohou sloužit jako diskriminační markery pro odlišení botanického původu (C. deserticola vs. C. tubulosa).
Obr.5 Porovnání charakteristických chromatogramů odvarů cistanchedeserticoladepieces(A),standarddecoction(B)aformulegranules(C) 3(S):Echinacoside;4:CistanosideA;5:TubulosideA;6:Acteoside;7:Isoacteoside.
Závěr (upraveno podle požadavku: který druh má „lepší“ obsah)
V rámci stanoveného HPLC–MS charakteristického profilu proCistanche deserticolaformule a s ohledem na mezidruhové srovnání,C. deserticolavykazuje bohatší a vyváženější profil fenylethanoidových glykosidů: cistanosid A je snadno detekován v C. deserticola, ale je pouze stopovýC. tubulosa, zatímcoechinakosidvykazuje výrazné mezidruhové rozdíly. Proto se pro formulace zaměřené na vyšší agregované úrovně klíčových PhG a silnější celkové přínosy cistanche doporučuje Cistanche deserticola jako lepší druh z hlediska obsahu. Pokud produkt konkrétně cílímaximální echinakosid, vybrané šarže C. tubulosa budouzvážit v závislosti na dodávce a testování šarže. V praxi by měl být „nejlepší cistanche na prodej“ stanoven kvantitativním testováním echinakosidu, verbascosidu (akteosidu) a cistanosidu A specifickým pro šarži podle zde popsané validované metody.
Reference
[1] Tang SW. Utajovaná Materia Medica. Peking: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Komise pro čínský lékopis. Lékopis Čínské lidové republiky (svazek . 1). Peking: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, et al. Čínské tradiční a bylinné drogy, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG a kol. Moderní tradiční čínská medicína, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine and Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ a kol. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X a kol. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y a kol. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, a kol. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y a kol. Moderní čínská medicína, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY a kol. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2):295.
Poznámky
Názvy sloučenin: echinakosid; cistanosid A; tubulosid A; verbascosid (akteosid); isoverbaskosid.
Zjevné typografické úryvky odkazující na „muškátový oříšek“ ve zdroji byly v překladu na základě kontextu vykresleny jako „Cistanche“.
