Kapitola 2: Krϋppelův faktor 15 potlačuje proliferaci glomerulárních mezangiálních buněk ledvin prostřednictvím posílení konjugace P53 SUMO1

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

3 VÝSLEDKY

3.1|Screening KLF15-vazebných genů prostřednictvím ChIP-Seq v primárních renálních glomerulárních MC

Abychom identifikovali geny přímého vazebného partnera KLF15, provedli jsme analýzu ChlP-Seq a nakonec jsme provedli screening 2478 genů. GO analýza těchto genů pomocí nástroje na webových stránkách www.uniprot.org (obrázek 1A, B) odhalila termíny molekulární funkce spojené s geny 1941, termíny buněčné složky související s geny 1662 a termíny biologických procesů související s geny 1766. Protože naším cílem bylo zjistit, jak KLF15 ovlivňuje MC, zaměřili jsme se na geny související s buněčným procesem. Mezi 1315 geny souvisejícími s buněčnými procesy bylo zjištěno, že 74 genů se účastní procesů buněčného cyklu; konkrétně se tyto geny účastnily mitotického buněčného cyklu, fázového přechodu buněčného cyklu a dalších procesů (obrázek 1C, D). Dále jsme analyzovali geny zapojené do růstu a zjistili jsme, že souvisejí s vývojovým růstem, buněčným růstem a dalšími typy růstu (obrázek 1E).

3.2|Screening odlišně regulovaných genů u KLF15-nadměrně exprimujících renální glomerulární MC pomocí SILAC a LC/MS

Analýza SILAC a LC/MS HRMC nadměrně exprimujících KLF15 ve srovnání s rodičovskými buňkami vedla k identifikaci 1357 proteinů. Použili jsme DAVID a IPA k získání domén GO a obohacených drah kvantifikovaných proteinů identifikovaných pomocí SILAC. Zajímavé je, že mnoho termínů souvisejících s biologickou funkcí proteinů patřilo mezi 30 nejvýznamnějších výrazně obohacených termínů GO, včetně regulace buněčného metabolického procesu aminokyselin, proteazomového komplexu, vazby na protein a termínů transkripce a translace, z nichž všechny úzce souvisejí s ubikvitinace (obrázek 2A). Obrázek 2B ukazuje prvních 30 významně obohacených termínů dráhy. Několik termínů biologických procesů, včetně termínů proteazom a neurodegenerativní onemocnění, také souviselo s ubikvitinací.

Kliknutím se dozvíte ocistanchena prodej s podrobnostmi

3,3|Bioinformatická analýza vazebných genů KLF15-, které jsou potenciálně spojeny s renální glomerulární proliferací MC

Prozkoumat geny vazby KLF15-, které jsou potenciálně spojenyledvinový glomerulárníProliferaci MC jsme provedli bioinformatickou analýzu dat ChIP-Seq a dat SILAC-LC/MS. Bylo testováno 52 genů (tabulka 2 a obrázek 2C) a pět z těchto genů, včetně SUMO1, faktoru inhibice migrace makrofágů (MIF), eukaryotického iniciačního faktoru (EIF), inzulinu podobného růstového faktoru (IGF) a retikulokalbinu (RCN ), úzce souviselybuněčná proliferace. Protože analýzy GO a drah odlišně exprimovaných proteinů naznačovaly, že testované geny souvisely hlavně s procesem ubikvitinace, dospěli jsme k závěru, že SUMO1, člen rodiny proteinů podobných ubikvitinu (UBL), se účastní posttranslační modifikace podobně jako ubikvitinace jako cílový gen KLF15.

Rostoucí množství důkazů ukazuje, že HG je jedním z hlavních faktorů indukujících rozvoj diabetické nefropatie a podporuje proliferaci MC a zvýšenou syntézu matrice in vitro.25 Předchozí studie ukázala, že PDGF-BB je nezbytný pro proliferaci MC před vývojem glomerulosklerózy u experimentální glomerulonefritidy.26 Po potvrzení, že MC byly stimulovány HG nebo PDGF-BB in vitro, jsme detekovali změny v expresi KLF15 a SUMO1 na RNA i proteinu

a zjistili, že tyto molekuly měly podobné trendy (obrázek 2D-l). Nakonec jsme určili SUMO1 jako cílový gen KLF15.

3.4|KLF15 upreguluje expresi genu SUMO-1 vazbou na oblast promotoru CACCCA-SUMO-1 o velikosti 16 bp a motiv bohatý na C plus A

Použili jsme sadu MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) k charakterizaci KLF15-vazbových motivů 52 screenovaných genů z dat KLF15 ChlP-Seq a identifikovali jsme KLF vazebný motiv (Obrázek 3A). Kromě toho jsme dále analyzovali více než tisíc bází upstream od promotoru SUMO1 a zjistili jsme, že KLF15 dokáže rozpoznat a vázat se na 16bp sekvenci (nukleotidy -205~-199) včetně - CACCCA-(obrázek 3B).ChIP-PCR potvrdila, že KLF15 je navázán na promotor SUMO1 a výsledky ukázaly významně vyšší expresi SUMO1 ve skupině s protilátkou anti-KLF15 než v kontrolní skupině na pozadí (obrázek 3C).

Dále jsme provedli duální luciferázový reportérový test, abychom potvrdili vztah cílení mezi SUMO1 a KLF15. Skupina promotoru SUMO1 divokého typu vykazovala vyšší aktivitu luciferázy než vektor pGL3 a skupiny mutantů v HRMC a aktivita byla významně zvýšena nadměrnou expresí KLF15. Zvýšení aktivity luciferázy bylo zvráceno transfekcí plazmidem exprimujícím oblast mutantního promotoru (obrázek 3D). Celkově vzato tato data naznačují, že SUMO1 je přímým transkripčním cílem KLF15.

3.5|Screening P53 jako substrátu SUMOylace SUMO1

Modifikace SUMO jsou široce exprimované posttranslační modifikace v eukaryotech. Reverzibilní konjugace těchto modifikací na substrátové proteiny je také známá jako SUMOylace, která hraje důležitou roli v regulaci funkcí cílových proteinů a dále se účastní různých biologických procesů, jako je nukleocytoplazmatický transport, regulace transkripce, apoptóza, stabilizace proteinu, stresové reakce a progrese buněčného cyklu.27 Abychom prozkoumali downstream signální molekuly přímo konjugované SUMO1, provedli jsme síťovou analýzu SUMO1 pomocí databáze IPA a data ukázala, že SUMO1 může přímo konjugovat mimo jiné s P53, APP, JUN a AKT. proteiny (obrázek 4A-C). Původně jsme vybrali P53 jako downstream molekulu SUMO1, protože je to dobře známý protein, který úzce souvisí s buněčnou proliferací.28.29 Dále jsme použili software SUMOsp k predikci možných SUMOylačních sekvencí P53invariousspecies a zjistili jsme, že P53 má SUMOylační sekvenci（ Obrázek 4D). Abychom určili, zda je P53 skutečně modifikován SUMOylací, přechodně jsme transfekovali HRMC plasmidem s nadměrnou expresí SUMO1 nebo siRNA SUMO1. Výsledky IP i Western blot odhalily trendy ve změnách exprese SUMO1-P53 a P53, které byly v souladu se změnami. v SUMO1 (obrázek 4E-J). Tato data ukazují, že P53 je SUMOylační substrát SUMO1.

3.6 |KLF15 inhibuje proliferaci MC podporou exprese SUMO1 a SUMOylace P53

Abychom stanovili regulaci P53 SUMOylace a proliferace MC pomocí KLF15 a SUMO1, intervenovali jsme expresí KLF15 nebo SUMO1 v HRMC a ošetřili jsme HRMC pomocí PDGF-BB. Mezi HRMC ošetřenými PDGF-BB buňky transfekované plazmidem s overexpresí KLF15 vykazovaly vyšší expresi SUMO1-P53, P53, KLF15 a SUMO1 než buňky transfekované kontrolním plazmidem KLF15. Stejné změny v SUMO1-P53, P53 a SUMO1 byly nalezeny v buňkách transfekovaných plasmidem s nadměrnou expresí SUMO1, zatímco exprese KLF15 byla v těchto buňkách nezměněna (obrázek 5A-F). PDGF-BB je jedním z dosud popsaných nejúčinnějších růstových faktorů MC a byla pozorována proliferativní odpověď HRMC na PDGF-BB. Jak je znázorněno na obrázku 5G, H, procento EdU-pozitivních buněk bylo významně zvýšeno podáváním rekombinantního PDGF-BB. Výsledky barvení EdU ukázaly, že nadměrná exprese KLF15 i SUMO1 inhibovala PDGF-BB-indukovanou buněčnou proliferaci (obrázek 5G, H).

Abychom získali další pohled na role KLF15 a SUMO1 v proliferujících HRMC, transfekovali jsme buňky pouze SUMO1 siRNA nebo je kotransfekovali s SUMO1 siRNA a plazmidem s nadměrnou expresí KLF15. Down-regulace SUMO1 neovlivnila expresi KLF15, ale hladiny exprese SUMO1-P53 a P53 byly zjevně sníženy po transfekci SUMO1 siRNA (obrázek 6A-C). Kromě toho, když byla inhibována exprese SUMO1, hladiny exprese SUMO1-P53 a P53 byly také potlačeny dokonce i v buňkách nadměrně exprimujících KLF15 (obrázek 6D-F). Poté byla vyhodnocena proliferace MC pomocí testu barvení EdU. SUMO1 RNAi zvýšila proliferativní účinek PDGF-BBon HRMC a skupina kotransfekovaná plazmidem s nadměrnou expresí KLF15 a siRNA SUMO1 měla více EdU-pozitivních buněk než skupina kotransfekovaná plazmidem s nadměrnou expresí a kontrolní hybridní sekvencí siRNA (obrázek 6G, H) . Proto jsme dospěli k závěru, že KLF15 potlačuje proliferaci MC zvýšením SUMOylace P53.

3.7|Globální exprese SUMO1 a P53 v glomerulárních MC negativně koreluje s proliferací MC u potkaní Thy-1 nefritidy

Anti-Thy1 nefritida je klasický model samoomezující mesangiální proliferativní glomerulonefritidy s proliferativní fází a fází zotavení. K vytvoření tohoto modelu jsme vstříkli protilátku Thy1 do potkanů ​​Wistar. Jak dusík v séru, tak kreatinin nemají žádnou významnou změnu mezi kontrolními krysami a modelovými krysami (obrázek S1). Výrazná mezangiální proliferace a akumulace ECM byly pozorovány během proliferativní fáze (5. a 7. den) u modelových krys a počet MC se snížil během fáze zotavení v den 10 (obrázek 7A). Také jsme detekovali změny exprese v markeru buněčné proliferace PCNA pomocí IHC (obrázek 7A, B). Hladiny PCNA byly zvýšeny v den 5, vrcholily v den 7 a snížily se v den 10 (obrázek 7F). Analýza Western blot ukázala, že proteinová exprese P53, SUMO1 a KLF15 v izolovaných glomerulech byla nižší v modelových skupinách než v kontrolní skupině (obrázek 7C, D), což je v souladu s imunohistochemickými výsledky (obrázek 7E, F). Tyto výsledky naznačují, že abnormální proliferace MC u potkaního modelu anti-Thy1 souvisí s nízkou hladinou exprese KLF15 a SUMO1. Předpokládá se, že interference s expresí těchto molekul zmírní patologický fenotyp u potkanů.

4. DISKUZE

Theglomerulyjsou filtrační jednotkyledvina. Narušení glomerulární funkce může být způsobeno primární glomerulární patologií nebo může být sekundární k systémovým onemocněním. Mesangiální změny byly pozorovány po glomerulárním poškození včetně hyperproliferace MC následované nadměrnou produkcí ECM (mezangiální expanze) a produkcí chemoatraktantu pro zánětlivé buňky. Proto je modulace odpovědí MC, zejména abnormální proliferace, novým terapeutickým přístupem. KLF15 je protein, který hraje regulační roli jako transkripční faktor vazbou na specifické sekvence DNA. Mnoho studií uvádí, že KLF15 se podílí na regulaci buněčné proliferace. Například bylo zjištěno, že KLF15 se účastní inhibice signálních drah souvisejících s proliferací MC,15,30 ale jeho přímý cílový gen nebyl v literatuře popsán. Proto tato studie zahrnovala především společný screening úrovní transkripce a translace k identifikaci přímého cílového genu KLF15.

KLF15 reguluje různé geny u různých druhů a v různých tkáních a orgánech. V procesu regulace proliferace MC ovlivňuje KLF15 expresi více genů a účastní se více drah.131,32 K prozkoumání přímých cílových genů KLF15 jsme použili ChIP-Seg. Klein RH a jeho kolegové použili ChlP-seq technologie ke studiu regulace KLF7 na diferenciaci epiteliálních buněk rohovky.33 Ying M et al použili tuto techniku ​​ke studiu inhibičního účinku KLF9 na pluripotenci glioblastomu.34Ve srovnání s ChlP-čipem umožňuje ChIP-Seq skutečnou analýzu celého genomu s vyšším rozlišením, vyšší citlivostí detekce a nižšími nároky na velikost vzorku.35 K získání fragmentů DNA přímo vázaných KLF15 jsme použili ChP a po srovnání a analýze s GenBank jsme provedli screening 2478 možných cílových genů. Prostřednictvím analýz GO a drah jsme identifikovali mnoho cílových genů zapojených do buněčného cyklu a procesů proliferace.

Experimenty ChlP-Seq vyžadují PCR pro amplifikaci detekčního signálu a určitý stupeň zkreslení během procesu amplifikace je nevyhnutelný. Kromě toho ChIP-Seq získává pouze geny, které může KLF15 vázat, a neindikuje změny, ke kterým dochází v expresi těchto genů při změně exprese KLF15. Ke kompenzaci těchto nedostatků jsme použili SILAC-LC/MS proteomickou analýzu. Tato technika poskytuje informace o všech proteinech, jejichž exprese se mění po regulaci KLF15, včetně proteinů přímo regulovaných KLF15 a proteinů, které jsou regulovány nepřímo nebo posttranslačně modifikované. HRMC byly kultivovány pomocí SILAC a KLF15 byl nadměrně exprimován v buňkách prostřednictvím plasmidové transfekce. Proteiny byly shromážděny pro detekci LC/MS a bylo získáno 1357 odlišně exprimovaných proteinů. Analýzy GO a drah odhalily, že některé z odlišně exprimovaných proteinů se podílely na ubikvitinaci. Genová a proteinová data byla protnuta. Geny nesouvisející s účelem výzkumu a geny přímo neregulované KLF15 byly odstraněny; nakonec bylo testováno 52 genů. Mezi nimi bylo vybráno pět genů s nejzjevnějšími rozdíly v expresi, které nejvíce souvisely s proliferací. Na základě kombinovaných výsledků analýzy dráhy, analýzy exprese SUMO1 a KLF15 v proliferujících HRMC, ChlP-PCR a duální luciferázové reportérové ​​analýze byl protein SUMO1 vybrán jako cílový gen KLF15.

Kromě ubikvitinu jsou identifikovány zvyšující se počty proteinů UBL3637 včetně SUMO,38 neurálních prekurzorových buněk exprimovaných, vývojově downregulovaných 8(NEDD8)3940 a interferonem stimulovaného genu 15(ISG15),41. Tyto modifikující proteiny silně regulují řadu biologických procesů. Kovalentní adice SUMO k substrátům, nazývaná SUMOylace, je posttranslační modifikace zapojená do řady buněčných procesů, včetně jaderně-cytosolického transportu, regulace transkripce, apoptózy, kontroly stability proteinu, stresových reakcí a progrese buněčného cyklu.27SUMO je typicky připojený k akceptorovým lysinovým zbytkům proteinových substrátů nesoucích konsenzuální sekvenci a přispívá k regulaci interakcí protein-protein, jakož i k subcelulární kompartmentalizaci a stabilitě proteinu.2 sUMO1, jako člen rodiny SUMOS, může ovlivnit buněčnou proliferaci modifikací substrátu a stabilizaci regulačních proteinů buněčného cyklu.43 Proto jsme se v kombinaci se zprávou z literatury a komplexními výsledky screeningu a analýzy zaměřili na to, jak KLF15 reguluje účinek SUMO1 na proliferaci mesangiálních buněk.

Pro identifikaci substrátů SUMO1 jsme provedli síťovou analýzu SUMO1 pomocí databáze IPA a softwaru SUMOsp. V kombinaci s publikovaným výzkumem P53 naše počáteční data screeningu naznačovala, že P53 je následnou molekulou SUMO1 se SUMOylační sekvencí YKxD/E. Předchozí studie ukázaly, že P53 byl substrátem SUMOylace45 a zesílená konjugace P53 SUMO1 podporovala stabilitu a aktivitu P53 a indukovala senescenci.46 V naší studii vyvolala interference s expresí SUMO1 v HRMC stejné trendy změn v SUMO1-P53 a P53, což naznačuje, že P53 byl SUMOylační substrát SUMO1.

Nové důkazy ukázaly, že SUMOylace a de-SUMOylace hrají roli u řady nefropatických onemocnění, jako je renální dysgeneze, renální karcinom, glomerulární onemocnění, apoptóza podocytů a hypertonicita ledvinové dřeně, akutní poškození ledvin a nefrolitiáza.{1}} vztahu mezi KLF15, SUMO1, P53 SUMOylací a proliferací MC jsme provedli sérii transfekčních ošetření na buňkách, které prošly proliferací indukovanou PDGF-BB. Nadměrná exprese KLF15 up-regulovala expresi SUMO1, zatímco nadměrná exprese SUMO1 neovlivnila expresi KLF15. Nadměrná exprese KLF15 nebo SUMO1 zvýšila SUMOylaci P53 a antagonizovala buněčnou proliferaci indukovanou PDGF-BB. Když byla inhibována exprese SUMO1, byla také inhibována SUMOylace P53 a KLF15 ztratil svůj antagonistický účinek na buněčnou proliferaci. In vivo. proliferace MC se postupně zvyšovala se zhoršením mesangiální proliferativní nefritidy, zatímco exprese KLF15, SUMO1 a P53 významně poklesla. S ohledem na integrovaná pozorování v buňkách a tkáních jsme předběžně dospěli k závěru, že KLF15 reguluje SUMOylaci P53 prostřednictvím SUMO1, čímž inhibuje proliferaci MC.

5. ZÁVĚRY

Některé studie ukázaly, že KLF15 hraje důležitou roli při regulaci proliferace MC. V této práci jsme zkoumali mechanismy suprese proliferace MC zprostředkované tímto transkripčním faktorem. Identifikovali jsme SUMO1 jako primární cíl KLF15 v MC pomocí bioinformatických analýz zahrnujících ChIP-Seq a SILAC-LC/MS. Kromě toho jsme pomocí databáze IPA a softwaru SUMOsp určili, že P53 byl přímým substrátem SUMO1. Experimenty in vitro a in vivo potvrdily, že KLF15 by mohl podporovat expresi SUMO1 a SUMOylaci P53 pak inhibovat proliferaci MC (obrázek S2). Tyto výsledky přispívají k pochopení regulační role KLF15 v proliferaci MC a poskytují teoretický základ pro hledání nových způsobů léčby onemocnění ledvin souvisejících s proliferací MC.