Kapitola 2: Sloučeniny zaměřené na OSBPL7 Zvyšují ABCA1- závislý odtok cholesterolu Zachování funkce ledvin u dvou modelů onemocnění ledvin

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Diskuse

Tato studie popisuje identifikaci třídy sloučenin pomocí fenotypového objevu léčiv (PDD), které zvyšují regulaci ABCA1-závislého odtoku cholesterolu. Cílová dekonvoluce odhalila OSBPL7 jako molekulární cíl. Na zvířecích modelech onemocnění ledvin tyto sloučeniny snižovaly akumulaci lipidů v ledvinách, zabraňovaly ztrátě podocytů, normalizovaly proteinurii a snižovaly pokles funkce ledvin.

Současné terapie pro chronickénemoc ledvinjsou omezeny na ACEi, ARB a nověji na inhibitory sodno-glukózového kotransportéru typu 2 (SLGT2i). Navzdory účinnosti těchto látek při oddálení progrese chronického onemocnění ledvin, především u pacientů s proteinurickým onemocněním ledvin, zůstává neuspokojená lékařská potřeba u CKD obrovská3,3940. V randomizované studii 4300 pacientů bylo neočekávaně zjištěno, že SGLT2i je účinný bez ohledu na přítomnosti diabetu4, což naznačuje, že jsou zapojeny i jiné mechanismy renoprotekce než snižující hladinu glukózy. Nedávná studie ve skutečnosti prokázala, že SGLT2i může zvýšit plazmatické HDL a může snížit akumulaci srdečního tuku42. Tento nedávný výskyt SGLT2i podtrhuje výhodu zaměření na více mechanismů řízení CKD pro vývoj účinnějších terapií.

My a další jsme popsali akumulaci glomerulárního cholesterolu vonemocnění ledvinjak metabolického, tak nemetabolického původu. Akumulace glomerulárních lipidů ve spojení se sníženým odtokem cholesterolu zprostředkovaným ABCAl se vyskytuje u DKD7-11, FSGS12-14 a AS13. Tyto údaje naznačují, že obnovení funkce ABCAl může být účinné při léčbě těchto typů onemocnění ledvin. Nedávno jsme prokázali, že renální deplece cholesterolu pomocí cyklodextrinu nebo genetická nadměrná exprese ABCAl chrání předrenální dysfunkcev modelech DKD9, FSGS13,14 a ASl3. Prokázali jsme také, že podocytově specifický deficit ABCAl zhoršuje renální fenotyp u DKD7. Studie s agonisty LXR, jako je T1317, také poskytly silnou podporu pro klíčovou roli ABC Al, která zůstala atraktivním terapeutickým cílem i přes omezení těchto látek.

Hledali jsme látky podle fenotypového objevu léčiv a optimalizace kandidátské malomolekulární drogerie. Identifikovali jsme řadu 5-arylnikotinamidů, z nichž několik zástupců zvýšilo hladiny proteinu ABCAl a odtok cholesterolu z buněk nabitých cholesterolem. Absence efluxní aktivity ve fibroblastech od pacienta s Tangerovou chorobou a nepřítomnost zvýšení ABCAl mRNA odhalila nový mechanismus účinku.

Cílové dekonvoluční úsilí identifikovalo OSBPL7 jako vysoce zajímavý cíl. Molekulární sonda (³H-Cpd K) účinně vázala OSBPL7 v živých buňkách a mohla by účinně konkurovat neznačeným sloučeninám. Ještě důležitější je, že jsme prokázali korelativní vztah "aktivita-aktivita" pro větší soubor sloučenin mezi jejich schopností zvýšit eflux ABCAl cholesterolu a jejich schopností soutěžit o vazbu sondy na OSBPL7. Mutační analýza kombinovaná s molekulárním modelováním a dokovacími studiemi ukazuje přímou interakci sloučenin s předpokládanou kapsou vázající sterol OSBPL7. A konečně studie siRNA potvrdily zapojení OSBPL7 do funkce ABC Al.

Kliknutím zjistíte, kde cistanche koupit a k čemu se cistanche používá  

Identifikovali jsme také CBIR jako potenciální cíl. Několik zpráv naznačuje roli endokanabinoidní signalizace v regulaci buněčného cholesterolu. Ukázalo se, že rimonabant mírně upreguluje scavenger receptor B1 (SR-B1) a ABCGl, ale ne ABC Al, což je v souladu s našimi údaji45. Bylo prokázáno, že syntetický kanabinoid WIN55,212-2 snižuje expresi ABC Al a zároveň zvyšuje scavenger receptor CD36 v oxLDL-naplněných makrofázích RAW264.746. Společně tato data nepodporují silnou roli CBIR v regulaci ABCA1. V našich studiích byly rimonabant a další agonisté/antagonisté CBIR včetně AM251, WIN55-212-2 a arachidonový chloroethylamin (ACEA) neaktivní při indukci ABCA1 eflux cholesterolu (obr. 3a, 4a).

Savčí proteiny vázající oxysterol (OSBP) se původně podílely na biosyntéze cholesterolu a sfingomyelinu47-49. Několik studií spojilo specifické OSBP s regulací stability proteinu ABC Al a efluxem cholesterolu zprostředkovaným ABCAl50,51. Žádná data před touto zprávou nenaznačovala, že OSBPL7 je regulátorem ABCA1. Naše data naznačují, že OSBPL7 může poskytovat chaperonovou nebo substrátovou přenosovou funkci ovlivňující ABC Al. Předběžné koimunoprecipitační experimenty v transfekovaných buňkách neidentifikovaly přímou interakci mezi těmito dvěma proteiny. Metaanalýza celogenomových asociačních studií (GWAS) však identifikovala OSBPL7 mezi 60 genetickými lokusy ovlivňujícími hladiny cholesterolu v plazmě u lidí.

Náš dlouhodobý zájem o roli ABC Al při onemocnění ledvin nás vedl k vyhodnocení 5-arylnikotinimidů in vitro a in vivo modelů onemocnění ledvin. Zjistili jsme, že OSBPL7 je exprimován v ledvinách, včetně glomerulů a podocytů, a že Cpd A a Cpd G upregulují apo Al-zprostředkovaný cholesterolový eflux z cholesterolem naplněných podocytů. Cpd A a Cpd G podporují zvýšení ABCAl na plazmatické membráně bez ovlivnění exprese mRNA. Tento mechanismus kontrastuje s agonisty LXR, kteří upregulují mRNA ABCAl, což vede ke zvýšení ABC Al jak v plazmě, tak v intracelulárních membránách. Hodnotili jsme terapeutickou účinnost Cpd A a Cpd G in vivo na myším modelu FSGS (ADR-indukovaná nefropatie). U obou látek bylo zjištěno, že snižují obsah cholesterolu v ledvinách, což koreluje se sníženou proteinurií, úbytkem hmotnosti a renálními patologickými změnami. Cpd G byl vysoce účinný v prevenci ADR-indukované ztráty podocytů a glomerulárních strukturálních změn. Významné snížení ABCAL v ledvinách, doprovázené zvýšenímzánětlivéproteinů, bylo zabráněno Cpd G, což podporuje klíčovou roli pro ABCA1. Cpd G účinně snížil albuminurii, BUN a hladiny sérového kreatininu u myší AS. Ještě důležitější je, že Cpd G prodloužil životnost u starších zvířat Col4a3 s pokročilým selháním ledvin.

Tato data podporují terapeutický potenciál sloučenin zacílených na ABCAl a silně naznačují, že tento nový způsob působení nabídne další nebo doplňkovou účinnost k lékům zaměřujícím se na RAAS, SGLT2, NRF2 a syntézu nebo absorpci cholesterolu. Je pozoruhodné, že na rozdíl od účinku Cpd G blokáda RAAS neprodlužuje životnost u starších myší Col4a3, přestože je to nejúčinnější terapie pro časnou intervenci v tomto modelu53,54. Antiproteinurická aktivita Cpd G byla lepší než účinky ramiprilu, které jsme dříve uvedli v syngenním modelu AS38. Cpd G proto může lépe cílit na populaci pacientů s AS a proteinurií ve srovnání s bardoxolonem, agonistou NRF-2, u kterého bylo prokázáno, že zvyšuje GFR, ale neměl žádný vliv na proteinurii, nejsilnější prediktor 10- rok riziko ESRD v běžné populaci55,56. Bylo zjištěno, že statiny jsou protektivní u experimentálního AS57 a jsou doporučovány u všech pacientů s CKD ke snížení kardiovaskulárního rizika, ale ukázaly se jako neúčinné pro zpomalení progrese onemocnění ledvin 8. A konečně jsme nedávno uvedli potenciální přínos ezetimibu u AS snížením vstřebávání mastných kyselin a triglyceridů. Ezetimib však neovlivnil obsah cholesterolu v ledvinách a jeho účinnost na zlepšení GFR a snížení proteinurie byla nižší než účinky, které zde uvádíme pro Cpd G

Stručně řečeno, tato zpráva popisuje identifikaci prvních malých molekul podobných lékům, které indukují odtok cholesterolu zprostředkovaný ABCAl, pomocí fenotypového objevu léčiva. Chemická biologie identifikovala OSBPL7 jako molekulární cíl a prokázala, že molekuly důvěrně interagují v rámci předpokládané domény vázající oxysterol. Pokud je nám známo, jedná se o jeden z mála příkladů sloučenin podobných lékům původně objevených fenotypovými přístupy, jejichž cíl byl následně úspěšně identifikován44. Sloučeniny G a A byly vysoce účinné pro zlepšení funkce ledvin u myších modelů odrážejících dvě různé etiologie progresivního onemocnění ledvin. Zdá se, že jsou bezpečné a dobře tolerované, což se odráží v jejich schopnosti snižovat hladiny AST u myší s ADR a ještě přesvědčivěji prodlužovat životnost myší Col4A3 KO. Tyto sloučeniny mohou nabídnout potenciální novou terapii onemocnění ledvin cílením buněčného metabolismu cholesterolu prostřednictvím nového způsobu působení. Tyto látky spolu se současnými léky zaměřenými na kontrolu krevního tlaku nebo glukózy mohou řešit významnou neuspokojenou potřebu u CKD.

Metody

Sloučeniny. Sloučeniny použité v této studii jsou shrnuty v doplňkové tabulce 5 a byly syntetizovány ve F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basilej, Švýcarsko, pokud není uvedeno jinak. Pro in vitro experimenty byly lyofilizované sloučeniny rekonstituovány v DMSO (Sigma) a alikvoty byly skladovány při -20 stupni. Pro experimenty in vivo byly lyofilizované sloučeniny resuspendovány ve vehikulech obsahujících 1,25 procenta hydroxypropylmethylcelulózy, 0,10 procenta sodné soli dokusátu, 0,18 procenta sodné soli propylparabenu a 0,02 procenta kyseliny citrónové monohydrát, při pH 6. Suspenze jemných částic byla vytvořena třemi krátkými pulzními sonikacemi provedenými na ledu.

Postupy syntetické chemie a analytická data. Viz soubor doplňkových údajů 1.

Chemická biologie/skrínink kandidátního cíle Stručně, plazmid exprimující požadovaný cílový kandidát fúzovaný se značkou FLAG byl transfekován do buněk HEK293. Po 24 hodinách byla na 3 hodiny přidána tritiovaná sloučenina K v koncentraci schopné vyvolat ABCA1-zprostředkovaný eflux cholesterolu（1.0μM）, poté byly živé buňky vystaveny UV záření (K{{ 7}} nm) k dotazování potenciálního zesíťování sloučeniny/cíle in situ. Byly připraveny buněčné lyzáty, exprimovaný protein byl poté selektivně imunoprecipitován pomocí anti-FLAG protilátky navázané na sefarózové kuličky, navázané proteiny byly separovány pomocí SDS-PAGE a byly připraveny dva identické bloty a sondovány pomocí western blotu a autoradiografie k detekci exprese proteinu a přítomnost nebo nepřítomnost zesíťování sloučeniny, v daném pořadí. Vývojový diagram tohoto screeningu je znázorněn na obr. 2. Obrázek 2d ilustruje schopnost Cpd A a Cpd G vytěsnit tritiované Cpd K z nadměrně exprimovaného a imunoprecipitovaného OSBPL7. Obrázek 3b ilustruje použití tohoto testu k detekci vazby tritiované Cpd K na nadměrně exprimované a imunoprecipitované varianty OSBPL7 obsahující bodové mutace v předpokládané kapse vázající oxysterol OSBPL7. Výhody této metody jsou i. použití plasmidové transfekce vede k vysoké expresi každého kandidáta, což snižuje pravděpodobnost vynechání autentického cíle pro ty, které mohou být exprimovány na nízkých endogenních hladinách, iii. k interakci chemické sondy s jejím cílem dochází v relevantním biologickém kontextu (živé buňky) ve farmakologicky aktivní koncentraci a iii. imunoprecipitace umožňuje, aby byl exprimovaný požadovaný protein purifikován od proteinů pozadí, což podstatně zlepšuje poměr signál/šum.

Buněčná kultura. Buněčné linie byly zakoupeny od ATCC a subkultivovány po dobu ne delší než 15, s výjimkou lidských podocytů, které byly původně od Dr. Jochena Reisera. Podmíněně imortalizované lidské podocyty byly kultivovány za permisivních podmínek při 33 stupních v médiu RPMI (Corning) obsahujícím 10 procento FBS (GIBCO), 1 procento penicilinu/streptomycinu,0.01 mg/ml rekombinantního lidského inzulínu, 0,0055 mg/ml lidského transferinu (v podstatě bez železa) a 0,005 ug/ml seleničitanu sodného (ITS, Corning). Pro indukci diferenciace byly podocyty kultivovány při 37 stupních po dobu 14 dnů v médiu RPMI obsahujícím 10 procent FBS (GIBCO) a 1 procento penicilin/streptomycin. Diferencované podocyty byly ponechány hladovět v RPMI-0.2 procent FBS po dobu 18 hodin a poté ošetřeny 1 uM, 5 uM a 10 uM sloučenin čerstvě připravených v DMSO po dobu 18 hodin při 37 stupních, jak je uvedeno.

Odtok cholesterolu v makrofázích a fibroblastech. Schopnost sloučenin indukovat odtok cholesterolu zprostředkovaný ABCAl byla stanovena v replikovaných kulturách buněk THP1 nebo fibroblastů v 96-jamkových mikrotitračních destičkách. Buňky byly naneseny v hustotě 150 000 buněk/jamku. Monocyty THP1 byly diferencovány na makrofágy přidáním PMA (100 nM) po dobu 72 hodin v médiu RPMI obsahujícím 10 procent fetálního hovězího séra a 3 ul 2-merkaptoethanolu. Buňky byly jednou promyty RPMI-1640 a poté naplněny 50 ug/ml acetylovaného LDL a 10μCi/ml 【'H】-cholesterolu v RPMI-1640 médiu obsahujícím 2 procenta FCS po dobu 48 hodin při 37 stupních . Po nanesení byly buňky jednou promyty RPMI-1640 a inkubovány s testovanými sloučeninami po dobu dalších 24 hodin v médiu RPMI-1640 obsahujícím 1 mg/ml hovězího sérového albuminu bez mastných kyselin (BSA). Buňky byly poté jednou promyty a odtok cholesterolu byl vyvolán přidáním 10 ug/ml lidského apoAI nebo 30 ug/ml HDL2, HDL3 nebo LDL v RPMI-1640 obsahujícím 1 mg/ml BSA pro další 6h. Radioaktivita v supernatantech kultury byla stanovena scintilačním počítáním. Odtok cholesterolu byl vyjádřen jako relativní hodnota oproti kontrolám inkubovaným v nepřítomnosti akceptorů cholesterolu. Křivky dávka-odpověď byly vypočteny pomocí XLfit3 (ID Business Solutions Ltd. UK).

Odtok cholesterolu v podocytech. Lidské podocyty diferencované po dobu 13 dnů byly značeny po dobu 24 hodin při 37 stupních v médiu RPMI obsahujícím 2 procenta FBS a [PH]-cholesterol (1 uCi/ml, American Radiolabeled Chemicals). Buňky byly poté třikrát promyty PBS a inkubovány s RPMI doplněným o 0,2 procenta beztukového BSA (Sigma) se sloučeninami nebo bez nich po dobu 18-h při 37 stupních. Sloučeniny byly použity v následujících koncentracích - Cpd C (1 μM), Cpd A (1 μM, 5 uM) a Cpd G (l uM, 5 uM, 1 0 μM）). Po 18-hodinové inkubaci byl do média přidán lidský apoAI（Calbiochem） (konečná koncentrace 20 ug/ml) a buňky byly inkubovány dalších 18 hodin při 37 stupních. Alikvoty média odebrané před (T =0h) a po (T=18h) přidání apoAI byly centrifugovány při 12,00×g po dobu 5 minut a radioaktivita v supernatantu byl počítán kapalinovou scintilací. Buňky byly poté promyty PBS, lyžovány 0,1% SDS, 0,1M NaOH a radioaktivita v lyzátech byla kvantifikována kapalinovou scintilací. Odtok cholesterolu zprostředkovaný apo Al, vyjádřený v procentech, byl vypočten jako množství značky uvolněné do média po přidání apo Al (rozdíl v radioaktivitě v médiu před a po přidání ApoA1) děleno množstvím celkové značky v každé jamce. (radioaktivita uvolněná do média plus radioaktivita v lyžovaných buňkách).

studie siRNA. Soubory siRNA specifické pro lidský OSBPL7, lidský CBIR a necílovou siRNA negativní kontrolu jsou shrnuty v doplňkové tabulce 6. THPI monocyty byly nasazeny v hustotě 80,000 buněk/jamka v {{4} }jamkové destičky a diferencované pomocí PMA, jak je popsáno výše. Po 72 hodinách bylo médium nahrazeno 50 ul čerstvého média na jamku. Buňky byly poté transfekovány pomocí činidla Viromer Blue (Origene) podle pokynů výrobce. Stručně, 10 ul siRNA （5 μM） bylo smícháno s 90 ul Viromer Blue（zředěné 1 procento v/v v dodaném pufru）. Po 15 minutách inkubace byly komplexy siRNA-transfekční činidlo zředěny v poměru 1:6,5 v čerstvém médiu a přidány do objemu 50 ul na jamku. Po 24 hodinách byly buňky poté naplněny cholesterolem inkubací s acetylovaným LDL (25 ug/ml) v médiu RPMI, 1 procenta FBS, 100 nM PMA, 2 uCi H-cholesterolu po dobu 24 hodin. Sada jamek obsahujících transfekované buňky byla ponechána stranou pro ověření účinnosti transfekce pomocí RT-PCR. Makrofágy naplněné cholesterolem byly poté inkubovány v přítomnosti Cpd G 5 uM nebo vehikula (0,1 procenta DMSO) v médiu RPMI, kterým byla fenolová červeň, 0,2 procenta BSA) dalších 24 hodin. Poté byl měřen odtok cholesterolu, jak je popsáno výše.

RT-PCR. RNA byla izolována pomocí sady RNEasy Plus Mini (Qiagen). Reverzní transkripce byla provedena pomocí qScript cDNA SuperMix (Quantabio) podle pokynů výrobce. Kvantitativní PCR v reálném čase byla provedena pomocí TaqMan Fast Universal PCR Master Mix a Taqman genových expresních testů (doplňková tabulka 7).

Western blot. Lyzáty nebo buněčné frakce byly inkubovány v Laemmliho pufru při 55 stupních po dobu 10 minut za redukčních podmínek. Celkem 30 ug proteinu z buněčných lyzátů nebo jedna třetina objemu shromážděného v přípravcích buněčných frakcí byla separována pomocí SDS-PAGE v 4-20 procentních gradientových gelech (Biorad) a proteiny byly poté přeneseny na PVDF membrány. Po blokování 5% TBS-mlékem byly membrány sondovány primárními protilátkami přes noc při 4 stupních. Byly použity následující primární protilátky: myší anti-ABCA1(Abcam; 1:1000), králičí anti-GAPDH protilátka (Milli-pore;1:10,000),myší anti-aktin( CP01,Millipore 10,000),anti-MEK, anti-ERp72, anti-V5 a anti-Na plus /K plus ATPáza (Cell Signaling; vše 1:100) a králičí anti-OSBPL7 (Sigma ; 1:1000). Po promytí byly membrány inkubovány s anti-králičími nebo anti-myšími IgG-HRP protilátkami (Promega, 1:10,00). Signály byly detekovány po inkubaci se substrátem Westernbright ECL HRP (Advansta) a luminiscenční signály byly zachyceny pracovní stanicí Azure C600 Gel Imaging (Azure Biosystems Inc, USA) nebo rentgenovými filmy.

Frakcionace buněk. Diferencované podocyty byly ošetřeny sloučeninami Cpd C （1 μM）, Cpd A（5 μM） nebo Cpd G（10 μM） po dobu 18 hodin, promyty a poté sklizeny v ledově chladném PBS. Buňky byly centrifugovány při 1000×g po dobu 5 minut, supernatant byl opatrně odstraněn a peleta resuspendována v hypotonickém pufru (15 mM KCl, 1,5 mM MgClz, 10 mM HEPES a 1 mM DTT) doplněném proteázou koktejl inhibitorů (Roche). Buňky byly rozrušeny skleněným omezovačem a byla přidána sacharóza pro dosažení konečné koncentrace 227 mM. Buněčné lyzáty byly centrifugovány při 1000xg po dobu 30 minut při 4 stupních. Supernatant byl poté přenesen do nové zkumavky a centrifugován při 10 000 x g po dobu 15 minut při 4 stupních. Peleta obsahující mikrosomální frakci byla shromážděna a supernatant byl přenesen do nové zkumavky a centrifugován při 100 000 x g po dobu 1 hodiny při 4 stupních. Peletovaná frakce plazmatické membrány byla shromážděna a supernatant obsahující cytosolovou frakci bez organel byl zakoncentrován na filtračních kolonách Vivaspin 500. Western blot byl proveden s použitím protilátek pro ABCAl a specifických markerů pro každou membránovou frakci, jak je popsáno výše. Nat/K plus ATPáza byla použita k identifikaci frakce plazmatické membrány, ERp72 jako marker pro frakci obohacenou mikrosomy a MEK jako kontrola pro nemembranózní cytosolovou frakci.

ABC AT ko-imunoprecipitace. Konstrukt ABCA{{0}}vlajky laskavě poskytl Dr.Michael Fitzgerald, Harvard University. Konstrukt OSBPL7-V5 (pcDNA3.1-V5-ORP7) byl zakoupen od společnosti Addgene. Savčí expresní vektory PCMV6-AN-GFP a pCMV6-AC-3DDK, od Origene, byly použity jako negativní kontroly. Buňky HEK293 byly přechodně kotransfekovány buď jednou z následujících kombinací plazmidů: (1)ABCA1-Flag plus OSBPL7-V5;(2)ABCA1-Flag plus PCMV{{19 }}AN-GFP; nebo(3) OSBPL7-V5＋pCMV6-AC-3DDK pomocí transfekčního činidla Fugene 6 (Promega) podle pokynů výrobce. 48 hodin po transfekci byly buňky lyžovány 1 ml imunoprecipitačního pufru (1 procento Triton X-100, 50 mM Tris-Cl pH 7,0, 150 mM NaCl) doplněným koktejlem inhibitorů proteázy (Roche). Lyzáty byly vyčištěny centrifugací a stejná množství celkových proteinů z každého supernatantu byla inkubována přes noc při 4 stupních s 30 ul anti-Flag M2 afinitního gelu (Sigma Aldrich). Kuličky byly peletovány centrifugací a 5krát promyty 1 ml imunoprecipitačního pufru. Imunoprecipitované proteiny byly eluovány inkubací kuliček s 50 ul 2x vzorkového pufru po dobu 15 minut při 56 stupních. Přítomnost ABC AI a OSBPL7-V5 v lyzátech a eluátech byla ověřena pomocí Western blotu, jak je popsáno výše.

Studie na zvířatech. Zvířata byla chována v 12h/12h cyklech světlo/tma a při kontrolované teplotě (18-23 stupňů) a vlhkosti (40-60 procent) v zařízení pro zvířata prosté patogenů Divize veterinárních zdrojů na univerzitě. z Miami, Miller School of Medicine. Myším byla poskytnuta standardní 18% proteinová potrava pro hlodavce a voda ad libitum. Protokol studie byl schválen Výborem pro péči o zvířata a použití (IACUC) University of Miami, který je akreditován Asociací pro hodnocení a akreditaci Laboratory Animal Care International (AAALAC). Všechny postupy byly provedeny v souladu se všemi federálními a státními etickými předpisy, včetně předpisů Animal Welfare Act (AWA), na které dohlíží Ministerstvo zemědělství Spojených států amerických (USDA) a Politiky veřejného zdraví pro humánní péči a používání laboratorních zvířat (PHS). Politika) spravovaná Národním institutem zdraví (NIH), Úřadem pro dobré životní podmínky laboratorních zvířat (OLAW). Samice myší Balb/c byly zakoupeny od Jackson Laboratories pro studie nefropatie vyvolané Adriamycinem. Ve věku 8 týdnů myši dostaly jednu dávku Adriamycinu (Sigma-Aldrich, 12 mg/kg) nebo vehikula (0,9 procenta NaCl) pomocí injekce do ocasní žíly. Myši byly náhodně rozděleny do šesti experimentálních skupin a počínaje 24 hodinami po injekci ADR byly léčeny buď vehikulem nebo různými dávkami sloučenin denně orální sondou po dobu 28 dnů. Byly použity následující dávky: Cpd C (agonista LXR) 10 mg/kg; Cpd A 30 mg/kg; Cpd G 100 mg/kg. Všechna zvířata byla usmrcena 28 dní po injekci ADR. Col4a3 KO myši (Col4a3tmiDec kmen 129X1/SvJ) byly zakoupeny od Jackson Labs. Myši byly náhodně rozděleny do 2 skupin. Počínaje ve věku 4 týdnů byla myším orální sondou jednou denně podávána dávka buď vehikula nebo Cpd G (100 mg/kg) po dobu 4 týdnů, poté byla utracena ve věku 8 týdnů. Druhá studie byla provedena na myších Col4a3 KO s léčbou zahájenou ve věku 6 týdnů. Tato studie byla provedena za účelem posouzení, zda léčba Cpd G u myší s prokázaným selháním ledvin může oddálit konečné stádium onemocnění ledvin, a proto prodloužit přežití. Pro léčbu ramiprilem začaly myši Col4a3 KO dostávat ramipril ve věku 4 týdnů. Ramipril byl přidán do pitné vody v koncentraci, která by vedla k dávce 10 mg/kg/den 8.

Fenotypová analýza myší. Týdenní vzorky moči byly odebírány. Močový albumin byl měřen testem ELISA (Bethy! laboratoře) a kreatinin kolorimetrickým testem (Stanbio). Albuminurie byla vyjádřena jako poměr albumin/kreatinin. Myši byly anestetizovány ketaminem (90 mg/kg)/xylazinem (10 mg/kg), krev byla odebírána do heparinizovaných zkumavek a zvířata byla poté perfundována levou komorou 0,9% roztokem NaCl. Kortexy ledvin byly pečlivě vyříznuty a rozděleny na vzorky, které byly buď bleskově zmraženy, vloženy do OCT nebo fixovány v 10% formalínu pro následná hodnocení.

Stanovení ukládání lipidů v řezech kůry ledvin. Vzorky kůry ledvin zalité do OCT byly nařezány kryosekcí na tloušťku 4 μm a obarveny olejem. Červený roztok O-isopropanolu (Electron Microscopy Science, PA) zředěný 6:4 ve vodě a poté kontrastně obarven Hematoxylinem Harris Hg Free (VWR, PA). Řezy byly poté vyhodnoceny pomocí světelného mikroskopu (Olympus BX 41, Tokio, Japonsko).

Stanovení obsahu cholesterolu a triglyceridů. Vzorky zmražené kůry ledvin byly homogenizovány ve 2 mM pufru fosforečnanu draselného, ​​pH 7, (1 {{1{12}}}} pul pufr/mg tkáně） pomocí skleněného dounceru na ledu. 10}0 ul Homogenát bylo důkladně promícháno s 1 ml směsi hexan:isopropanol (3:2;obj.) na objem tkáňového homogenátu. Vodná (pelety) a organická (supernet) fáze byly odděleny centrifugací při 12,000× g po dobu 5 min. Pelety (vodná fáze) byly vysušeny a rekonstituovány v 8M močovině, 0,1% SDS, 0,1M NaOH a celkové proteiny byly kvantifikovány metodou BCA (Thermofisher) Organická fáze byla vysušena působením dusíku. Lipidy byly poté rekonstituovány ve 100 ul isopropanolu∶NP-40 (9:1;obj.). Obsah triglyceridů byl stanoven pomocí kolorimetrické soupravy podle pokynů výrobce (Cayman Chemical USA). Celkový cholesterol a obsah CE byly stanoveny pomocí enzymatická fluorometrická metoda59. Pro měření celkového cholesterolu byly extrakty zředěny 1:100 v testovacím pufru (100 mM fosforečnan draselný e,50 mM NAC, 5 mM kyselina cholová, 0,1 procenta Triton X-10, pH 7,4) obsahující cholesteroloxidázu (1 U/ml), cholesterolesterázu (1 U/ml), křenovou peroxidázu (1 U/ml), a Amplex Red (75 μM). Reakce byly inkubovány při 37 stupních po dobu 30 minut v černé neprůhledné 96-jamkové destičce (Greiner) a fluorescence byla měřena na čtečce mikrodestiček (Spectramax i3X, Molecular Devices) při 530 nm excitaci a 580 emisi.

Pro stanovení CE bylo 150 ul výše popsaného testovacího pufru, doplněného katalázou z hovězích jater (45 U/ml) a cholesteroloxidázou (1 U/ml), přidáno do 25 ul vzorku a inkubováno přes noc při 37 stupních, aby došlo k vyčerpání volného cholesterol, který zanechává pouze estery cholesterolu. Poté bylo přidáno 75 ul činidla pro detekci esterů cholesterolu (1 U/ml cholesteroloxidázy, 4 U/ml cholesterolesterázy, 24 U/ml křenové peroxidázy, 300 μM Amplex Red）. Reakce byla inkubována při 37 stupních po dobu 30 minut a fluorescenční signál byl měřen jak je popsáno výše.Vnitřní standardy zahrnovaly vzorky obsahující 1 mM cholesterolu a 5 uM cholesterol oleátu, aby se ověřila úplnost enzymatického rozkladu volného cholesterolu, stejně jako citlivost a specifita testu.

Histologické hodnocení. Řezy kůry ledviny fixované ve formalínu zalité v parafínu o tloušťce 4 um byly obarveny kyselinou jodovou-Schiff (PAS). Sklíčka byla analyzována renálním patologem ve dvojitě zaslepeném provedení. Glomerulární skleróza (globální a segmentální), hypertrofie podocytů a hyperplazie podocytů byly vyjádřeny jako procento glomerulů zjištěných s těmito abnormalitami. Tubulární mikrocysty a intersticiální záněty byly hodnoceny na stupnici 0-4, kde 0=0 procent , 05=1-10 procent , 1=11-25 procent ,2:26-50 procent ,3:{{ 12}} procent a 4=více než 75 procent poškození. Mesangiální expanze byla hodnocena na základě semikvantitativní analýzy (škála 0-5) nebo procenta glomerulů vykazujících mezangiální expanzi ( procenta ).

Imunofluorescenční mikroskopie. Pro detekci exprese ABC Al byly 4 um parafinové řezy kůry ledvin zbaveny parafinu a rehydratovány. Antigeny byly získány varem po dobu 30 min v citrátovém pufru pH 6.0(Target Retrieval Solution, Citrate pH 6, Sigma, USA). Řezy byly permeabilizovány po dobu 30 minut pomocí 0,1 procenta Tritonu X-100 v TBS. Tkáňové řezy byly inkubovány s 10% kozím sérem (kat. č. G9023, Millipore Sigma) a 1% BSA (kat. č. SP-5050-500, Vector, USA) v TBS-T po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě, aby se zablokovaly jakékoli nespecifické vazba. Vzorky byly poté inkubovány přes noc při 4 stupních s potkaními anti-ABCAl (Novus, 1:200) a králičími anti-WI1 (Abcam, 1:200) protilátkami ve zvlhčené komoře. Po rozsáhlém promytí byly vzorky poté inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti se sekundárními protilátkami konjugovanými s fluorochromem (Invitrogen, 1:500). Před analýzou bylo k řezům přidáno montážní médium proti vyblednutí obsahující DAPI (Vectashield Plus).

Snímky byly pořízeny pomocí konfokálního mikroskopu FluoView FV1000 (Olympus) s čočkou olejového objektivu x63 v různých rovinách pomocí vzoru řady Z s velikostí kroku 0,18 um. Během analýzy byly jednotlivé roviny dekonvoluovány a složeny tak, aby vznikl maximální promítaný obraz pomocí softwaru pro prohlížení chřipky verze 4.3b (Olympus). Bylo zachyceno minimálně 5 snímků z 5 různých polí na vzorek. Kvantifikace střední intenzity glomerulární fluorescence (MFI) ABCAl byla provedena pomocí softwaru Fiji-ImageJ.

Pro detekci OSBPL7,4 um zmrazené řezy kůry ledvin zapuštěné do OCT byly fixovány PFA-sacharózou (2 procenta, 4 procenta) v PBS po dobu 2 0 min při teplotě místnosti a permeabilizovány pomocí 0,3 procenta Triton-PBS po dobu 15 minut a blokovány blokovacím pufrem (5 procent FBS v PBS) po dobu 1 hodiny. Tkáňové řezy byly poté inkubovány s králičí anti-OSBPL7 (Sigma, 1:50) a kozími anti-Synaptopodin (Santa Cruz, 1:800) protilátkami ve zvlhčené komoře přes noc při 4 stupních. Po rozsáhlém promytí byly vzorky inkubovány se sekundárními protilátkami konjugovanými s fluorochromem a pokryty montážním médiem, jak je popsáno výše. Snímky byly pořízeny pomocí fluorescenčního mikroskopu Leica DMI 6000B.

Statistická analýza. K provedení všech statistických analýz byl použit GraphPad Prism ver 6 nebo 7. Skupiny byly porovnány pomocí dvoustranného t-testu nebo jednocestné ANOVA následované Dunnettovým nebo Tukeyovým testem. F, Brown-Forsythe nebo Bartlettův test byl použit ke stanovení významných rozptylů mezi skupinami, pokud P<0.05, then="" groups="" were="" compared="" using="" two-tailed="" mann-whitney,="" or="" kruskal-wallis="" followed="" by="" dunn's="" tests.="" the="" correlation="" between="" albuminuria="" and="" accumulation="" of="" cholesterol="" ester="" in="" kidney="" cortexes="" was="" assessed="" using="" the="" spearman="" coefficient="" test.="" p=""><0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" only="" data="" from="" independent="" experiments="" were="">

Všechna zvířata byla náhodně rozdělena do léčebných skupin.