Kapitola 1: Renální tubulární peroxizomy jsou nepostradatelné pro normální funkci ledvin

Pro více informací kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Peroxisomy jsou specializované buněčné organely zapojené do řady metabolických procesů. U lidí způsobují mutace vedoucí k úplné ztrátě peroxisomů multiorgánové selhání (poruchy Zellwegerova spektra, ZSD), včetněpoškození ledvin. Nicméně (pato)fyziologická role peroxisomů vledvinazůstává neznámý. Řešili jsme roli peroxisomů vfunkce ledvinu myší s podmíněnou ablací peroxisomální biogeneze v renálním tubulu (myši cKO). Funkční analýzy neodhalily žádný zjevný fenotyp ledvin u myší cKO. Avšak samci myší cKO z kojenců měli nižší tělesnou hmotnost a hmotnost ledvin a dospělí samci myší cKO vykazovali podstatné snížení hmotnosti ledvin a poměru hmotnost ledvin/tělesná hmotnost. Stereologická analýza ukázala zvýšení hustoty mitochondrií v buňkách proximálních tubulů cKO myší. Integrované transkriptomové a metabolomové analýzy odhalily hluboké přeprogramování několika metabolických drah, včetně metabolismu glutathionu a biosyntézy/biotransformace několika hlavních tříd lipidů. I když tato analýza naznačovala kompenzacioxidační stresVýzva s krmením s vysokým obsahem tuků neindukovala významné poškození ledvin u cKO myší. Prokázali jsme, že renální tubulární peroxizomy jsou pro normální funkci ledvin postradatelné. Naše data také naznačují, že renální postižení u pacientů se ZSD je extrarenálního původu.

Kliknutím sem se dozvíte o výhodách extraktu z cistanche tubulosa

Úvod

Peroxisomy jsou organely vázané na jednu membránu, které byly poprvé nalezeny v myších ledvinách Rhodinem v roce 1954(1). Současné odhady naznačují, že peroxisomy obsahují více než 50 enzymů zapojených do různých buněčných funkcí, včetně -oxidace mastných kyselin s velmi dlouhým řetězcem (VLCFA), mastných kyselin s dlouhým řetězcem (LCFA) a dikarboxylové kyseliny s dlouhým řetězcem; a- a -oxidace mastných kyselin s rozvětveným řetězcem; oxidace prostaglandinů a leukotrienů; metabolismus aminokyselin; biosyntéza éterových fosfolipidů (včetně plazmalogenů) a žlučových kyselin; redoxní homeostáza; detoxikace glyoxylátem; a feroptóza. Peroxisomy jsou všudypřítomné téměř ve všech savčích buňkách, s nejvyšším zastoupením v buňkách proximálních tubulů ledvin a hepatocytech. V těchto buňkách zaujímají peroxisomy asi 3 procenta buněčného objemu, ale jejich počet, velikost a tvar se během embryonálního a postembryonálního vývoje významně liší (2); jejich počet může v různých stresových podmínkách značně narůst (3). Ačkoli mnoho peroxizomálních enzymů bylo dobře charakterizováno, studie zabývající se jejich expresí a funkční rolí v ledvinách jsou vzácné. Navíc celkový funkční význam peroxisomů v ledvinách zůstává do značné míry neznámý.

Důkazy o úloze peroxisomů v renální (pato)fyziologii se objevily především ze studií lidské genetiky. Byly identifikovány dva typy mutací vedoucích k lidským peroxizomálním poruchám: (i)mutace v tzv. peroxinových (PEX) genech účastnících se biogeneze peroxisomů a (ii)mutace specifických peroxizomálních enzymů. První typ mutace vede k generalizované peroxizomální dysfunkci způsobující cerebrohepatorenální poruchy Zellwegerova spektra (ZSD)(4). Kojenci s těžkými formami ZSD obvykle umírají během prvního roku života na multiorgánové selhání. Přestože přítomnost kortikálních renálních cyst a/nebo renálních oxalátových kamenů u pacientů se ZSD byla v průběhu let dobře zdokumentována(5, 6), molekulární mechanismy vedoucí k těmto poruchám zůstávají zatím neznámé. Další možné renální abnormality u ZSD nebyly zkoumány, protože u onemocnění dominují neurologické komplikace. Vliv středních nebo mírnějších forem ZSD na renální funkce nebyl systémově hodnocen. Důkazy spojující nedostatek jednoho peroxizomálního enzymu s renální patofyziologií také zůstávají omezené.

Mutace v peroxisomálním alaninu v játrech: glyoxylátaminotransferáza kódovaná genem AGXT vede k primární hyperoxalurii typu I, onemocnění charakterizovanému ukládáním krystalů šťavelanu vápenatého v ledvinách (přehled v odkazu 7). Nedávno byla identifikována autozomálně dominantní mutace vedoucí k renálnímu Fanconiho syndromu neboli generalizované dysfunkci proximálního tubulu v peroxisomálním enzymu enoyl-CoA hydratase a 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase (EHHADH)(8) . Tato mutace způsobuje nesprávné cílení EHHADH na mitochondrie a poškození mitochondriální funkce. Genetické studie provedené na kongenních kmenech potkanů ​​ukázaly, že peroxizomální enzym hydroxykyseliny oxidáza 2 (HAO2) může hrát roli při kontrole krevního tlaku (9,10). Nicméně, zda je tento fenotyp způsoben změněnou funkcí HAO2 v ledvinách nebo jiných tkáních, zůstává neznámé. Obecně stále chybí údaje ze zvířecích modelů s ledvinově specifickými defekty peroxizomové biogeneze nebo ledvinovou specifickou inaktivací jednoho peroxizomálního enzymu. Zde jsme se zabývali úlohou peroxisomů ve funkci ledvin u samců a samic myší s podmíněnou ablací peroxizomální biogeneze v renálním tubulu.

Výsledek

Generování a základní charakterizace mláďat samců a samic myší s podmíněnou ablací peroxizomální biogeneze v renálním tubulu. Biogeneze peroxisomů v renálním tubulu byla narušena podmíněnou inaktivací Pex5 kódujícího cytosolický peroxizomový targeting signál 1 (PTS1) receptor, který je nezbytný pro import proteinů obsahujících motiv PTS1 do peroxisomů(11,12). Podmíněné delece Pex5 v renálním tubulu bylo dosaženo pomocí doxycyklinem indukovatelného (DOX-indukovatelného) systému (myši PexSanlo/Pax8-rtTA/LC1, ref. 13). Protože funkční význam peroxisomů může být závislý na věku(14), základní charakterizace deficitu Pex5 v ledvinách byla provedena u kojenců i dospělých myší. V experimentech s mláďaty myší bylo dosaženo excize floxované alely Pex5 podáváním DOX (2 mg/ml v pitné vodě) březím samicím v E14 a udržováno až do P7. Malé děti byly usmrceny v P28. Jako kontroly byly použity myši s genotypem Pex5oilo. Jak ukazuje doplňkový obrázek 1A (doplňkový materiál dostupný online s tímto článkem; https://doi.org/10.1172/jci.insight.155836DS1), léčba DOX vedla k téměř úplné excizi floxované alely Pex5 v Pexswn/Pax{{ 29}}GTA/LC1 samci a samice novorozenců myší. Analýza renálních řezů neodhalila žádné zjevné histologické abnormality nebo ledvinové kameny u malých myší bez Pex.5 v renálním tubulu (nezobrazeno). Albuminurie nebyla přítomna ve vzorcích spotové moči Pex5-bez mláďat myší oboupohlaví(Doplňkový obrázek 1B). Tělesná hmotnost (BW) a hmotnost ledvin (KW), ale ne poměr KW/BW, byly nižší u samců myší bez Pex{1}} ve srovnání s kontrolami ze stejného vrhu (doplňkový obrázek 1C).

Generování a základní charakterizace dospělých samců a samic myší s podmíněnou ablací peroxizomální biogeneze v renálním tubulu. Delece Pex5 v renálním tubulu dospělých myší byla vyvolána 2-týdenním ošetřením DOX 8-týdenních myších samců a samic Pex5xio/Pax8-ntTA/LC1, dále jen jako myši cKOm a cKOf, v tomto pořadí (viz Metody). Paralelně byla stejná léčba DOX poskytnuta jejich kontrolám ze stejného vrhu (myši Pex5a/lx, dále označované jako Ctrlm a Ctrlf myši, v tomto pořadí). Všechny experimenty na dospělých myších byly provedeny 4 týdny po ukončení léčby DOX. Jak je znázorněno na obrázku 1A, exprese mRNA Pex5 byla významně snížena v ledvinách myší cKOm i cKOf. U myší cKOf však byla také detekovatelná určitá reziduální mRNA Pex5 plné délky, což naznačuje neúplnou excizi floxované alely. Podobně protein PEX5 prakticky chyběl v ledvinách myší cKOm, ale stále byl detekovatelný u myší cKOf, i když na podstatně nižší úrovni. Tento rozdíl byl viditelný, když byly extrakty ledvin z myší cKOm a cKOf naneseny na stejný gel SDS-PAGE a společně imunoblotovány (obrázek 1B). Myši Kim i cKOf byly životaschopné, nevykazovaly žádné zjevné abnormality a měly normální BW ve srovnání s kontrolními myšmi (doplňková tabulka 1). Poměry KW a KW/BW byly podstatně nižší u myší cKOm ve srovnání s myšmi Ctrl, ale ne u myší cKOf ve srovnání s myšmi Ctrlf (obrázky 1, C a D, v tomto pořadí). Analýza 24-hodinových vzorků moči a plazmy neodhalila účinek genotypu u myší obou pohlaví, s výjimkou nižších hladin draslíku v plazmě u myší cKOm ve srovnání s myšmi Ctrl (doplňková tabulka 1). Albuminurie chyběla v moči myší cKOm i cKOf (doplňkový obrázek 2A). V ledvinách cKOm myší nebyly pozorovány žádné hrubé morfologické změny, depozita oxalátu vápenatého nebo akumulace lipidů (doplňkový obrázek 2, BD).

Hodnocení buněk proximálního tubulu u dospělých myší cKO elektronovou mikroskopií. Hodnocení kůry ledvin elektronovou mikroskopií odhalilo vysoký počet peroxisomů v buňkách proximálních tubulů myší Ctrlm a Ctrlf (obrázek 2, A a B, v tomto pořadí). Peroxisomy prakticky chyběly v proximálních tubulech myší cKOm a cKOf (obrázek 2, respektive Cand D). Stereologické nástroje byly použity pro kvantitativní analýzu buněk

organely a buněčné rozměry v proximálních tubulech myší Ctrlm a cKOm. Objemová hustota peroxisomů (počet/μm² cytoplazmy) i procento cytoplazmy obsazené peroxisomy v buňkách proximálních tubulů byly u cKOm myší dramaticky sníženy (obrázek 3, A a B), naopak, mitochondriální objemová hustota, stejně jako procento cytoplazmy obsazené mitochondriemi v buňkách proximálních tubulů, bylo zvýšeno u cKOm myší ve srovnání s Ctrl myšmi (obrázek 3, C a D, v tomto pořadí). Také objemová hustota a procento cytoplazmy obsazené lysozomy v buňkách proximálních tubulů se u myší Kim a Ctrlm nelišily (obrázek 3, E a F). Jak je znázorněno na obrázku 3G, buňky proximálního tubulu z myší cKOm měly tendenci zmenšovat šířku buněk (P= 0.083).

Integrované transkriptomické a metabolomické analýzy naznačují hluboké přeprogramování metabolických, antioxidačních a lipidových syntézních drah v ledvinách cKO myší. Pro identifikaci molekulárních změn v ledvinách cKO myší (GSE179202) bylo provedeno integrované sekvenování hlubokého transkriptomu a analýza metabolomu. Srovnání transkriptomů odhalilo 1350 transkriptů odlišně exprimovaných v ledvinách myší Ctrlm a cKOm (obrázek 4A a doplňková tabulka 2, FDR< 5%)and="" 121="" transcripts="" differentially="" expressed="" in="" kidneys="" of="" ctrlf="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 4b="" and="" supplemental="" table="" 3,="">< 5%).="" 61="" differentially="" expressed="" transcripts="" were="" present="" in="" both="" sexes(figure="" 4c="" and="" supplemental="" figure="" 3).="" enrichment="" analysis="" of="" 100="" genes="" encoding="" proteins="" related="" to="" peroxisomal="" function(kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" [kegg]="" pathway="" hsa04146)performed="" on="" transcriptomes="" of="" ctrlm="" and="" ckom="" mice="" revealed="" 52="" transcripts="" either="" up-or="" downregulated="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 4d="" and="" supplemental="" figure="" 4).="" gene="" set="" enrichment="" analysis(gsea)="" performed="" on="" the="" kegg="" pathway="" database="" (release="" on="" december="" 11,="" 2020)showed="" downregulation="" of="" pathways="" related="" to="" the="" metabolism="" of="" pyruvate,="" glyoxylate="" and="" dicarboxylate,="" amino="" acids="" (arginine,="" proline,="" cysteine,="" methionine,="" tryptophan,="" alanine,="" and="" histidine),="" or="" glutathione(figure="" 4e="" and="" supplemental="" figure="" 5)="" and="" upregulation="" of="" pathways="" related="" to="" fatty="" acid="" synthesis="" and="" degradation,="" ppar="" signaling,="" and="" abc="" transporters="" (figure="" 4f="" and="" supplemental="" figure="" 6).="" no="" enrichment="" was="" found="" in="" pathways="" linked="" to="" inflammation="" or="" fibrosis.="" targeted="" analysis="" of="" several="" groups="" of="" functionally="" related="" genes="" that="" are="" not="" represented="" in="" kegg="" pathways="" revealed="" substantial="" changes="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" the="" peroxisomal="" metabolism="" of="" fatty="" acids="" (acsl1/3/4/6,="" acsvl1,="" acot3/4,="" acnat1,="" acox3,="" abcd3,="" ehhadh,="" and="" acaa1b),="" plasmalogen="" biosynthesis="" (far1="" and="" agps),="" bile="" acid="" synthesis(amacr="" and="" hsd17b4),="" and="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)="" detoxification(cat="" and="" sod1)="" (supplemental="" figure="" 3).="" alterations="" were="" also="" noted="" in="" the="" expression="" of="" a="" large="" number="" of="" genes="" critical="" for="" membrane="" transport="" processes="" in="" the="" proximal="" tubule,="" thick="" ascending="" limb="" (tal),="" and="" distal="" nephron(supplemental="" figure="" 7="" and="" supplemental="" table="" 4).="" for="" instance,="" in="" the="" proximal="" tubule,="" we="" found="" a="" reduction="" in="" the="" expression="" of="" an="" aquaporin-1="" water="" channel(agp1);="" megalin="" (lrp2);="" phosphate="" transporter="" napi-2a="" (slc34al);="" urate="" transporters="" uratl="" (slc22a12),="" npt1/4="" (sic17al/3),="" and="" oat1="" (slc22a6);="" and="" numerous="" other="" organic="" anion="" and="" amino="" acid="" transporters.="" in="" the="" tal="" and="" distal="" nephron,="" there="" was="" a="" substantial="" increase="" in="" the="" expression="" of="" genes="" encoding="" proteins="" involved="" in="" sodium="" reabsorption:="" nkcc2="" (slc12a1),="" clc-kb="" (clcnkb),="" βenac="" (scnn1b)=""><0.05), and="" ncc="" (slc12a3)(fdr="">

<0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" alt="Figure 4. Transcriptional reprogramming in the kidneys of cKO mice. (A and B) Volcano plot representing the relative transcriptional expression of all renal transcripts in cKOm versus Ctrlm (A) or cKOf versus Ctrlf (B). Transcripts depicted in blue are significantly downregulated while transcripts depicted in red are significantly upregulated. (C) Venn diagrams showing the number of transcripts significantly downregulated or upregulated in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. A significant transcript regulation is considered when the adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.05. (d)="" enrichment="" analysis="" of="" a="" homemade="" gene="" set="" (based="" on="" the="" kegg="" pathway="" mmu04146)="" targeting="" 100="" transcripts="" related="" to="" peroxisomal="" functions,="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" scatter="" plot="" of="" the="" top="" 25="" most="" downregulated="" (e)="" or="" upregulated="" (f)="" metabolic="" pathways="" in="" ckom="" versus="" ctrlm="" mice,="" based="" on="" an="" untargeted="" gsea="" using="" a="" database="" of="" 543="" kegg="" metabolic="" pathways.="" pathways="" are="" sorted="" by="" their="" absolute="" normalized="" enrichment="" score.="" a="" significant="" pathway="" regulation="" can="" be="" considered="" when="" adjusted="" p="" value="" referred="" to="" as="" "q="" value"="" is=""><0.2" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Z celkového počtu 852 detekovaných metabolitů 207 vykazovalo rozdílnou abundanci v ledvinách myší Ctrlm a cKOm a 118 vykazovalo rozdílnou abundanci v ledvinách myší Ctrlf a cKOf (doplňková tabulka 5, FDR<5%). seventy-nine="" metabolites="" demonstrating="" differential="" abundance="" were="" common="" in="" both="" comparisons(figure="" 5a="" and="" supplemental="" table="" 6).among="" metabolites="" showing="" the="" most="" significant="" differences="" were="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins(decreased="" abundance)and="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids="" (increased="" abundance)="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5b="" and="" supplemental="" figure="" 8,="" respectively).="" global="" analysis="" of="" metabolome="" confirmed="" that="" plasmalogens="" and="" sphingomyelins="" constituted="" a="" majority="" of="" metabolites="" showing="" a="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" both="" ckom="" and="" ckof="" mice="" (figure="" 5c).lcfa="" dicarboxylates,="" very="" long-chain="" fatty="" acyl-carnitines,="" phosphatidylcholines,="" and="" phosphatidylethanolamines="" were="" present="" among="" metabolites="" with="" increased="" abundance,="" in="" addition="" to="" glutathione-related="" metabolites="" and="" dicarboxylic="" acids(figure="">

<0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" alt="Figure 5. Remodeling of the renal metabolome in cKO mice. (A) Venn diagrams representing the number of detected renal metabolites showing a significantly decreased or increased abundance in cKOm (in blue) or cKOf (in pink) mice versus Ctrl mice of the same sex. (B) Volcano plot representing the relative abundance of all detected metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm. Metabolites depicted with blue dots are significantly less abundant, and transcripts depicted with red dots are significantly more abundant in kidneys of cKOm mice as compared with Ctrlm mice. The names of some representative metabolites are depicted using colors shared for related metabolites. (C and D) Heatmaps of metabolites showing a significantly decreased (C) or increased (D) abundance in cKO mice of both sexes as compared with Ctrl mice. A significant difference of abundance is considered when adjusted P value from a 2-way ANOVA referred to as " fdr"="" is=""><0.05. metabolites="" are="" identified="" by="" their="" biochemical="" name="" and="" sorted="" by="" related="" metabolisms="" and="" subclasses="" of="" metabolites.="" for="" each="" metabolite,="" the="" individual="" expression="" of="" 6="" ctrl="" and="" 6="" cko="" mice="" normalized="" between="" 0="" and="" 1="" and="" the="" log2="" -transformed="" mean="" fold="" change="" of="" expression="" (log2fc)="" in="" cko="" versus="" ctrl="" mice="" are="" given,="" for="" both="" sexes.="" for="" calculation="" of="" the="" mean="" fc="" of="" expression,="" missing="" values="" (depicted="" in="" gray)="" have="" been="" replaced="" by="" the="" minimum="" value="" of="" both="" genotypes="" from="" the="" same="" sex."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Analýza společné dráhy (MetaboAnalyst 5.0) transkriptů a metabolitů vykazujících zvýšenou nebo sníženou hojnost v ledvinách cKOm myší ve srovnání s Ctrl myšmi identifikovala 22 downregulovaných a 7 upregulovaných drah (obrázek 6, A a B, v tomto pořadí; FDR<0.1; supplemental="" table="" 7).="" nitrogen="" metabolism,="" pyruvate="" metabolism,="" glycolysis,="" and="" gluconeogenesis="" were="" identified="" among="" the="" downregulated="" pathways="" while="" fatty="" acid="" degradation="" was="" identified="" among="" the="" upregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b,="" respectively).="" glutathione="" metabolism="" and="" retinol="" metabolism="" were="" present="" among="" both="" up-and="" downregulated="" pathways="" (figure="" 6,="" a="" and="" b).="" detailed="" analysis="" of="" transcripts="" and="" metabolites="" related="" to="" glutathione="" metabolism="" identified="" 16="" transcripts="" and="" 3="" metabolites="" with="" decreased="" abundance="" in="" kidneys="" of="" ckom="" mice="" (figure="" 6,="" c="" and="" d,="" respectively),="" along="" with="" 6="" transcripts="" and="" 8="" metabolites="" exhibiting="" increased="" abundance(figure="" 6,="" e="" and="" f,="" respectively).="" the="" oxidized="" form="" of="" glutathione(gssg)was="" present="" in="" ckom="" but="" not="" in="" ctrlm="" mice,="" thereby="" suggesting="" oxidative="" stress="" in="" ckom="" mice(figure="">

<0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" alt="Figure 6. Joint analysis of transcriptional and metabolic changes in cKOm mice. (A and B) Scatter plot of significantly downregulated (A) or upregulated (B) metabolic pathways, based on a joint pathway analysis of both regulated transcripts and modulated metabolites in kidneys of cKOm versus Ctrlm mice. Pathways are sorted by their absolute impact, and a significant pathway regulation is considered when adjusted P value referred to as " fdr"="" is=""><0.1. the="" size="" of="" each="" dot="" depends="" on="" the="" percentage="" of="" all="" transcripts="" and="" metabolites="" ("compounds")="" of="" the="" pathway="" that="" are="" significantly="" affected="" in="" ckom="" mice.="" (c="" and="" d)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (c)="" and="" metabolites="" (d)="" significantly="" less="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" (e="" and="" f)="" relative="" expression="" of="" glutathione-related="" transcripts="" (e)="" and="" metabolites="" (f)="" significantly="" more="" abundant="" (fdr="" <="" 0.05)="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrlm="" mice.="" individual="" values="" from="" 6="" ckom="" and="" 6="" ctrlm="" mice="" are="" depicted="" after="" transformation="" from="" raw="" individual="" data:="" values="" of="" metabolite="" abundance="" have="" been="" divided="" by="" the="" median="" value="" of="" both="" genotypes,="" while="" values="" of="" transcript="" expression="" from="" both="" genotypes="" have="" been="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" box="" and="" whiskers="" represent="" the="" mean="" and="" the="" sem,="" respectively.="" nd,="" not="" detected."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Výzva s vysokým obsahem tuků nevede u ckKOmice k dalšímu oxidativnímu stresu. Změny v drahách souvisejících s glutathionem, deplece plazmogenů a snížená exprese katalázy naznačovaly oxidační stres a/nebo přeskupení různých antioxidačních obranných systémů v ledvinách myší cKOm. Abychom otestovali tyto hypotézy, vyzvali jsme myši cKOm dietou s vysokým obsahem tuku (HFD) po dobu 4 týdnů. Tato provokace nevedla k albuminurii, ale ke zvýšení objemu moči a vylučování vápníku a urátu močí. Nebyl pozorován žádný rozdíl v testovaných parametrech plazmy, včetně kalcémie a urikémie (doplňková tabulka 8). V ledvinách myší Ctrlm a cKOm infikovaných HFD nebyly detekovány žádné hrubé morfologické změny nebo akumulace lipidů (obrázek 7A). Celková a neenzymatická antioxidační kapacita hodnocená testem Trolox (obrázek 7B), stejně jako tkáňové hladiny malondialdehydu, markeru peroxidace polynenasycených mastných kyselin (obrázek 7C), se mezi ošetřeními a genotypy nelišily. Množství produktu peroxidace lipidů 4-hydroxynonenal (4-HNE) bylo zvýšeno u Ctrlm myší léčených HFD ve srovnání s Ctrl myšími na kontrolní dietě, ale žádný rozdíl nebyl pozorován u cKOm myší léčených 2 diety (obrázek 7D).