CD8 a CD4 T buněčné populace v lidských ledvinách

edmund.chen@wecistanche.com

Abstraktní:Pozadí: Na hraničních místech a ve vnitřních orgánech přispívají tkáňové paměťové T buňky (TRM) k imunitní bariéře proti patogenům, jako jsou viry, bakterie, houby a rakovina. Informace o přítomnosti a funkci těchto buněk v lidské ledvině jsou však omezené. Abychom lépe porozuměli imunologické obraně tohoto orgánu zprostředkovanou T buňkami, zaměřili jsme se na stanovení fenotypových a funkčních aspektů CD8 a CD4 T buněk přítomných ve zdravých a aloštěpech.ledvina tkáň. Metody: Pomocí vícekanálové cytometrie jsme hodnotili fenotyp a funkci T buněk ve vzorcích zdravé ledvinové tkáně (n=5) aledvinatkáň aloštěpu (n=7) a porovnali tyto aspekty s T buňkami v periferní krvi od zdravých kontrol (n=13). Výsledek:ledvinyvzorky tkáně obsahovaly podstatná množství CD8 a CD4 T buněk. Na rozdíl od cirkulujících buněk,ledvinaT buňky často exprimovaly CD69 a CD103 a častěji aktivně cyklovaly. Navíc skoro všechnyledvinaT buňky exprimovaly CXCR3 a často exprimovaly CXCR6 ve srovnání s T buňkami v oběhu. výrazně,ledvinaT buňky produkovaly větší množství IFN než cirkulující buňky a byly často polyfunkční. Závěr: Funkční T buňky s charakteristickými rysy TRM sídlí u člověkaledvinapapírové kapesníky. Tyto buňky častěji aktivně cyklují a často exprimují CXCR3 a CXCR6.

klíčová slova:lymfocyty rezidentní v tkáni; T-buňky; CD8; CD4; CD69; CD103; ledviny; aloštěp

CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL

1. ÚvodRezidentní paměťové T buňky (TRM) přetrvávají v tkáních, aby poskytovaly dlouhodobou lokalizovanou obranu proti patogenům. Na rozdíl od recirkulujících T lymfocytů nelze populace TRM detekovat v periferní krvi a významně se liší od populací recirkulujících T lymfocytů s ohledem na jejich fenotyp, funkci a metabolismus [1]. Ve skutečnosti to není překvapivé vzhledem ke skutečnosti, že různé orgánové systémy, jako jsou plíce, jsou vystaveny vyššímu zatížení různými patogeny, než je tomu v případě oběhu, který je obecně izolován od vnějšího světa [2].Tkáňová retence TkM přetrvává roky a je zprostředkována mechanismy, které zahrnují osu sfingosin-1-fosfátový receptor1 (S1PR1)-sfingosin1-fosfát (SP1). S1PR1 je receptor exprimovaný T buňkami, který zprostředkovává egresi ze sekundárních lymfoidních orgánů po navázání na bioaktivní signální molekulu SP1, která je důležitým mediátorem transportu T buněk. Tato osa může být přerušena CD69, membránově vázaným lektinem typu c, který antagonizuje expresi S1PR1, a tak zprostředkovává retenci. Kromě toho je u myší exprese S1PR1 indukována transkripčním faktorem Krüppel-like Factor 2 (KLF2), o kterém bylo zjištěno, že je downregulován v TRM, a tím také inhibuje výstup lymfocytů [3]. Na druhé straně se ukázalo, že downregulace KLF2 je zprostředkována homologem transkripčního faktoru Blimpl v T buňkách (Hobit), který je exprimován TpM-specifickým způsobem v myších T buňkách [4]. Kromě toho některé TRM také exprimují CD103 (integrin E), přičemž TRM lze identifikovat pomocí exprese CD69 a CD103 [1].

I když se znalosti o fenotypu a funkci TRM pro různé lidské tkáně zvyšují, o těchto aspektech se ví jen máloledvina. Zde jsou T buňky vystaveny odlišnému souboru patogenů, jako jsou bakterie vzestupně z dolních močových cest a renotropní viry, jako je polyomavirus BK (BKPyV). Nedávno jsme skutečně popsali, jak lidské ledviny obsahují podskupinu T buněk exprimujících CD69 a/nebo CD103, mezi nimiž jsou CD8 T buňky specificky zacílené na proteiny BKPyV virion protein1 (VP1) a protein velkého T antigenu (LTAG) [5]. My a další jsme také prokázali přítomnost CD69/CD103-exprimujících invariantní T (MAIT) buňky spojené se sliznicíledvinatkáně [6,7].

Abychom lépe pochopili, jaký druh T buněk tvoří lokalizovanou imunitní odpověď v tomto orgánu, použili jsme vícekanálovou průtokovou cytometrii ke zkoumání fenotypu a funkceledvinaTRM, izolované od dárceledvinamateriál příjemců transplantace ledvin (RTR) a od zdravýchledvinatkáně sousedící s renálními jasnými buněčnými karcinomy, abychom viděli, jak se tyto populace porovnávají s populacemi T buněk v oběhu.Našli jsme toho člověkaledvinatkáň obsahuje podstatné množství CD4 a CD8 T buněk exprimujících pouze CD69, CD69 a CD103 nebo žádný z těchto markerů. Zjistili jsme, že buňky CD69-CD103- vledvinatkáň se podstatně liší od T buněk v oběhu a může představovat populaci TRM postrádající kanonické markery TRM. Dále jsme ukázali, že ledvinové T buňky častěji aktivně cyklují, jak lze soudit podle zvýšené exprese Ki-67 ve srovnání s krví. Také jsme zjistili, že CD8 a CD4 T buňky vledvinatkáň téměř vždy exprimuje CXCR3 a často exprimuje CXCR6. Tato zjištění implikují roli těchto chemokinových receptorů při přitahování a udržování populací paměťových T buněk rezidentních v ledvinách.

2. Materiály a metody

2.1. Pacienti a vzorkyVzorky byly získány z Biobank Renal Diseases v Amsterdamu, UMC, umístění AMC. V této Biobance se vzorky pacientů, jako je krev aledvinatkáně, jsou odebírány a skladovány ze zdravého životaledvinadárců a RTR, které jsou sledovány před a po transplantaci ledviny. Tato studie byla provedena podle zásad uvedených v Helsinské a Istanbulské deklaraci a všichni účastníci poskytli písemný informovaný souhlas před zápisem do Biobanky. Navíc zbytková tkáň od pacientů, kteří podstoupili nádorovou nefrektomii (tkáň ledvin vzdálená od nádoru), byla darována oddělením patologie a také uložena v Biobance. Tyto tkáně byly zpracovány anonymně podle Kodexu chování Federace holandských lékařských vědeckých společností (Human Tissue and Medical Research: Code of Conduct for Responsible Use, 2011 www.federa.org).

2.2. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC)Vzorky krve byly získány od cytomegalovirových (CMV) séronegativních zdravých kontrol (živledvinadárci před operací, n= 13). Charakteristiky účastníků této studie jsou uvedeny v tabulce 1. PBMC byly izolovány z krve sodné soli heparinu standardní centrifugací v hustotním gradientu a následně kryokonzervovány až do dne analýzy.

2.3. Ledvinová tkáňVzorky zdravé ledvinové tkáně (n {0}}) byly získány z ledvin, které byly chirurgicky odstraněny kvůli karcinomu ledviny (vzdálená nenádorová tkáň od kontralaterálního pólu ledviny) a transplantované ledvinové tkáně (n {{1 }}) byl získán z explantovaných renálních aloštěpů po selhání transplantace. Tyto vzorky se označují jako vzorky zdravé a transplantované ledviny. Řezy ledvinové kůry byly nasekány na kostky 1- mm pomocí McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, USA), přeneseny do 50ml zkumavek a promývány studeným PBS, dokud nezůstala žádná krev. viditelně přítomen a supernatant byl čirý. Bylo přidáno předehřáté (37 stupňů) trávicí médium, 40 ml na 10 g tkáně (DNAse typ IV (50 KU/ml) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Nizozemsko), kolagenáza typ IV (0,5 mg/ml) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), BSA (60 mg/ml) (Sigma Aldrich), 20 ul/ml fetálního telecího séra (FCS, VWR International BV, Amsterdam, Nizozemsko), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdam, Nizozemsko), penicilin-streptomycin (Biochrom GMBH, Berlín, Německo) v HBSS (Westburg BV, Leusden, Nizozemsko)) a inkubovány v třepačce po dobu 20 minut při 37 stupních. Teplá suspenze byla přenesena do C-trubice (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Německo) a podrobena programu M_spleen_04.01 na GentleMacs (Miltenyi). Trávicí médium bylo deaktivováno studeným PBS a výsledná buněčná suspenze prošla přes buněčné síto, aby se získala jednobuněčná suspenze, která byla podrobena standardní centrifugaci v hustotním gradientu podle protokolu výrobce (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Norsko ). Izolované mononukleární buňky (ledvinové MNC) bylykryokonzervovány do dne analýzy v IMDM doplněném 20 procenty FCS, 000036 v/v procent -merkaptoethanolu, 5 procenty DMSO, penicilinem a streptomycinem.

2.4. Průtoková cytometrieMěření byla provedena na průtokovém cytometru LSRFortessa (BD Biosciences). Pro každý vzorek bylo analyzováno 2×106 PBMC nebo 0,5×106 až 10×106 ledvinových MNC. Objem každé barvicí reakce byl relativní k počtu buněk a koncentrace protilátek zůstaly konstantní. Buňky byly inkubovány s povrchovými protilátkami (doplňková tabulka S1) po dobu 30 minut při 4 stupních ve tmě. Mrtvé buňky byly vyloučeny pomocí fixovatelného životaschopného barviva eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonální protilátky s intracelulárními cíli (doplňková tabulka SI) byly přidány po fixaci a permeabilizaci buněk pomocí FoxP3/Transcription Factor Stained Set (eBioscience Inc.). Byly dodrženy publikované metody pro průtokovou cytometrii a třídění buněk pro imunologické účely [8]. Strategie hradlování použitá pro fenotypovou analýzu lze nalézt na doplňkovém obrázku S1. Již dříve jsme ukázali, že žádný z analyzovaných markerů nebyl ovlivněn metodou štěpení použitou k izolaci MNC ledvin [7].

Omezení vzorků tkání vedlo k vyloučení vzorků ze závěsových panelů. Počty buněk CD3 plus analyzované na vzorek ve zdravých PBMC, zdravých ledvinových MNC a TX ledvinách lze nalézt na obrázku S3. Vzorky MNC byly analyzovány pouze tehdy, když obsahovaly více než 50 procent živých buněk v lymfocytu, jak bylo hodnoceno pomocí dvou viability, a podskupiny T buněk založené na CD69/CD103 byly dále charakterizovány, pouze pokud jejich celkový počet buněk přesáhl 50.

CISTANCHE ZLEPŠÍ SELHÁNÍ LEDVIN/RENÁL

2.5. Stimulační testPBMC a ledvinové MNC byly stimulovány, jak bylo popsáno dříve [7,9]. PBMC a ledvinové MNC byly rozmraženy v přítomnosti DNAázy I (200 KU/ml), promyty a ponechány přes noc regenerovat na neošetřených 96-jamkových destičkách s kulatým dnem (Corning) v kultivačním médiu (RPMI doplněné o 10 procent FCS a penicilin-streptomycin) v koncentraci 20 × 106/ml （100 μl/jamka）.

Druhý den ráno byly ke stimulaci buněk přidány forbol 12-myristát 13-acetát (PMA, 10 ng/ml; Sigma Aldrich) a ionomycin (1 ug/ml; Sigma Aldrich). Jako negativní kontrola bylo přidáno samotné médium. Všechny inkubace byly provedeny v kultivačním médiu v přítomnosti CD28 (klon 15E8; 2 ug/ml), CD29 (klon TS 2/16; 1 ug/ml), brefeldinu A (10 ug/ml, Invitrogen) a GolgiStop ( BD Biosciences) v konečném objemu 200 ul po dobu 4 hodin při 37 stupních a 5 procentech CO2.

Následně byly buňky inkubovány po dobu 30 minut s povrchovými protilátkami (doplňková tabulka S2). Mrtvé buňky byly vyloučeny pomocí fixovatelného barviva pro životaschopnost eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonální protilátky pro intracelulární barvení (tabulka S1) byly přidány po fixaci a permeabilizaci buněk pomocí Cytofix/Cytoperm Reagent Set (BD Biosciences). Buňky byly dvakrát promyty a analyzovány na průtokovém cytometru LSRFortessa. Strategii hradlování použitou ve funkční analýze lze nalézt na doplňkovém obrázku S2. Pro stanovení polyfunkčnosti každé podskupiny T buněk byl vypočten průměrný počet funkcí každé populace pomocí následujícího vzorce: ((procento buněk produkujících 1 cytokin]*1) plus ([procento buněk produkujících 2 cytokiny]*2) plus ([procento buněk produkujících 3 cytokiny]*3) plus ([procento buněk produkujících 4 cytokiny]*4) plus ([procento buněk produkujících všech 5 cytokinů]*5))/100.

2.6. Analýza dat

Data byla analyzována pomocí FlowJo verze 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Všechny grafy a obrázky byly vytvořeny pomocí Graphpad Prism verze 8.00 pro Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Stejný program byl použit také pro statistické analýzy dat. Ke stanovení významnosti nepárových vzorků byl použit neparametrický Mann-Whitney-U test. K porovnání párových vzorků byl použit Wilcoxonův test se znaménkem. p-hodnoty<0.05 were="" considered="" statistically="">

3. Výsledky

3.1. Zřetelná exprese CD8 a/nebo CD4 a markerů tkáňové rezidence T lymfocyty ve zdravé tkáni ledvinNejprve jsme porovnali expresi CD4 a CD8 CD3-pozitivními T buňkami v periferní krvi s buňkami detekovanými ve zdravé tkáni ledvin. CD4-CD8 plus (CD8) T buňky byly významně častěji detekovány v ledvinové tkáni než v krvi ((medián) 25 procent vs. 38 procent) (obrázek la). Naproti tomu CD4*CD{{9} } (CD4)T buňky byly detekovány ve vyšších frekvencích v krvi než v ledvinové tkáni ((70 procent vs. 52 procent) obrázek la). Celkově byly CD4 T buňky pozorovány častěji ve zdravé ledvinové tkáni než CD8 T buňky (obrázek 1b).

Dále jsme zkoumali expresi tkáňových rezidenčních markerů, CD69 a CD103, v podskupinách T buněk definovaných CD8 a CD{4}}. Jak se očekávalo, CD69 a CD103 nebyly prakticky exprimovány buňkami v periferní krvi (obrázek 1c). Ve zdravé tkáni byly fenotypy CD69-CD103-, CD69 plus CD103-, CD69tCD103 plus a CD69-CD103 plus vyjádřeny 46 procenty, 45 procenty, 6,6 procenta a 1,8 procenta CD8T buněk, 61 procent, 38 procent, 0,44 procenta a 0,43 procenta CD4T buněk, v tomto pořadí (obrázek lc). Závěrem lze říci, že CD8, ale zejména CD4 T buňky byly detekovány ve značném počtu ve zdravé lidské ledvinové tkáni. Kromě toho exprese CD69 a CD103, markerů tkáňové rezidence, byla detekována primárně mezi T buňkami nalezenými ve zdravé tkáni a ne v krvi.

3.2. Různé expresní vzorce společných markerů označujících podskupinu podle T buněk ve zdraví / podle ledvinové tkáně

CD45RA, tyrosin fosfatáza, CCR7, chemokinový receptor, o kterém je známo, že zprostředkovává přenos T buněk do sekundárních lymfoidních orgánů, a CD28 a CD27, oba kostimulační receptory silně zapojené do aktivace T buněk, jsou všechny markery tradičně používané k identifikaci funkčních podskupin T buněk J1{ {53}},1l. Chtěli jsme zjistit, do jaké míry se liší distribuce těchto podskupin v krvi od distribuce v ledvinové tkáni. Jak se očekávalo, největší podskupiny CD8 T lymfocytů detekované v oběhu (tj. ty, které se týkají většího nebo rovného 5 procentům celkové populace) byly ty s CD45RA plus CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (naivní T buňky nebo TN, ( medián) 13 procent), CD45RA-CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (T-buňky centrální paměti nebo TcM, 6 procent), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27 plus (TEv1,30 procent), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27-(Tau2,10 procent), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 procent) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 procent) a CD45RA plus CCR7-CD28-CD27-(TEMRA ,10 procent) fenotyp. Ve zdravé tkáni nebyly detekovány téměř žádné (0,6 procenta) CD8 T buňky s fenotypem TN a pouze několik (0,8 procenta) vykazovalo fenotyp Tax. Naproti tomu CD8 T buňky detekované ve zdravé tkáni ledvin se skládaly ze značného množství TEv1-(22 procent),TEM2-(12 procent), Tpx3-(18 procent),TEx{ {65}} (23 procent) a TEyRA (11 procent) populace T buněk (obrázek ld a obrázek S4). Při pohledu na CD4 T buňky v krvi byly největší populace ty, které exprimovaly Ty-(35 procent), TcM-(25 procent), TEMl-(16 procent), TFM2-(9 procent) a populace s jinak nespecifikovaným fenotypem CD45RAtCCR7-CD28 plus CD27* (0,4 procenta) (obrázek 1d a obrázek S4). Ve zdravé tkáni ledvin málo CD4 T buněk exprimovalo TN- (3 procenta) nebo TcM -(3 procenta) fenotypu. Místo toho byl ve zdravé tkáni detekován značný počet buněk s fenotypem TEM1-(22 procent), TEM2-(40 procent) nebo TEM4(14 procent) (obrázek ld a obrázek S4) . Závěrem lze říci, že distribuce CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}definovaných podskupin CD8 a CD4 T buněk se mezi krví a zdravou ledvinovou tkání podstatně liší.

3.3. CD8 a CD4 T buňky ve zdravé lidské ledvinové tkáni častěji obsahují aktivně se cyklující buňkyDále jsme zkoumali, zda existují rozdíly v expresi markerů typických pro cytotoxický efektor-paměťový profil mezi populací CD8 a CD4 T buněk v krvi a tkáni ledvin. Nejprve jsme se podívali na expresi transkripčních faktorů T-boxu T-bet a eomeso-dermin (Eomes). Tyto transkripční regulátory se přímo podílejí na generování efektorových buněk akutní fáze, indukování exprese molekul, jako je interferon-y a granzym B, a na vytváření sekundárních paměťových odpovědí. Jak se očekávalo, exprese T-bet byla častá mezi cirkulačními CD8 T buňkami (54 procent), zatímco cirkulační CD4 T buňky zřídka exprimovaly tento transkripční faktor (13 procent). Je zajímavé, že u CD4 T buněk byla exprese T-bet významně vyšší mezi T buňkami detekovanými ve zdravé tkáni ledvin než v oběhu (53 procent vs 13 procent). Určitá exprese byla také často detekována mezi oběhovými CD8 T buňkami (59 procent), zatímco mezi oběhovými CD4 T buňkami byla opět vzácná (15 procent). Exprese Eomes však byla častější mezi CD4 T buňkami v tkáni ledvin (32 procent) než v krvi (obrázek 2a,b).

Dále jsme zkoumali expresi granzymu B, serinové proteázy, o které je známo, že zprostředkovává apoptózu po injekci do cytoplazmy cytotoxickými T buňkami. V souladu s předchozími zprávami byla exprese T-bet a granzymu B detekována ve značném počtu v cirkulujících CD8 T buňkách (28 procent). Jeho exprese však byla mezi cirkulujícími CD4 T buňkami vzácná (1 procento), pro CD8 T buňky byla exprese granzymu B podobná v ledvinové tkáni a cirkulujících populacích (28 procent ys. 23 procent) (obrázek 2c). Je zajímavé, že vyšší frekvence exprese T-bet a Eomes detekované v ledvinových CD4 T buňkách neodpovídaly vyšší frekvenci exprese granzymu B v tomto kompartmentu (5 procent). Poté jsme se podívali na expresi KLRGl, koinhibičního receptoru, o kterém je známo, že je převážně exprimován cytotoxickými efektorovými buňkami akutní fáze a efektorovými paměťovými buňkami. KLRG1 byl často exprimován cirkulujícími CD8 T buňkami (54 procent), ale ne CD4 T buňkami ( 10 procent). Nebyly nalezeny žádné rozdíly mezi anatomickými kompartmenty v expresi KLRG1l pro CD8 nebo CD4 T buňky. Nakonec jsme zkoumali expresi Ki-67, markeru označujícího aktivně cyklující buňky. V souladu s předchozími pozorováními byla exprese Ki-67 mezi cirkulujícími CD8 a CD4 T buňkami vzácná (1 procenta, respektive 2 procenta). Je zajímavé, že mezi CD8 T buňkami, ale zejména mezi CD4 T buňkami, byla exprese Ki-67 významně častěji detekována v T buňkách v ledvinové tkáni (3 procenta, respektive 11 procent) (obrázek 2e). Závěrem lze říci, že CD4 T buňky byly detekovány ve zdravé lidské ledvinové tkáni, ale ne CD8 T buňky v tomto kompartmentu, častěji exprimované T-bet a Homes. To se však nepromítlo do častější exprese granzymu B ledvinovými CD4 T buňkami. Navíc, ačkoli celkový počet cyklujících buněk byl nízký, ledvinová tkáň obsahovala významně aktivněji cyklující CD8 a CD4 T buňky než cirkulace.

3.4. CD8 a CD4 T buňky ve zdravé ledvinové tkáni jsou téměř všechny CXCR3-pozicePoté jsme hledali rozdíly v expresi dalších markerů, typických v cirkulujících populacích ne bezprostředně cytotoxických paměťových buněk, jak bylo ukázáno dříve pro populace cirkulujících T buněk. Nejprve jsme sledovali expresi IL-7R, exprimovanou primárně na naivních a časně diferencovaných paměťových buňkách v oběhu, kde se podílí na udržení homeostatické proliferace [10,12,13]. V periferní krvi byl IL{5}}Ra často exprimován CD8 T buňkami (84 procent) a CD4 T buňkami (98 procent). CD8 a CD4 T buňky ve zdravé ledvinové tkáni exprimovaly tento marker významně méně často než cirkulující T buňky (71 procent, respektive 76 procent) (obrázek 2f).

Dále jsme zkoumali expresi různých dalších chemokinových receptorů Zajímavé je, že CXCR3, chemokinový receptor zapojený do přenosu T-buněk do zanícených tkání[14-17], byl exprimován mimořádně velkým počtem CD8 a CD4 T-buněk v ledvinové tkáni (99 procent a 91 procent, v daném pořadí), a významně méně často cirkulujícími T buňkami (58 procent a 26 procent, v tomto pořadí) (obrázek 2g). Nakonec jsme určili expresi CXCR6, o které je známo, že se podílí na vytváření populací TRM [18-22]. Zatímco CXCR6 byl exprimován pouze malou populací cirkulujících CD8 T buněk (16 procent), a prakticky ne cirkulujícími CD4 T buňkami. významně větší podíl CD8 a CD4 T-buněk v ledvinové tkáni exprimoval tuto molekulu (40 procent, respektive 40 procent) (obrázek 2h). Závěrem lze říci, že markery typicky spojené s ne bezprostředně diferencovaným stavem v oběhu, pravděpodobně-7Ra, CCR7, CD28 a CD27, byly významně méně často exprimovány ledvinovými CD8 a T buňkami ve srovnání s těmi v krvi. naproti tomu ledvinové T buňky častěji exprimovaly CXCR6 a téměř vždy exprimovaly CXCR3.

3.5. Rozdíly ve fenotypu mezi zdravou ledvinou a aloštěpovými T buňkami jsou minimálníDále jsme chtěli prozkoumat, zda tyto nálezy zůstaly stát ve tkáni z transplantovaných ledvinových aloštěpů, které byly získány pro různé klinické indikace (tabulka 1).Pokud jde o počty CD8 a CD4 T buněk ve zdravé a aloštěpové tkáni, nebyly pozorovány žádné rozdíly (obrázek 3a). Zaznamenali jsme však nevýznamný trend směrem k více CD4T buňkám a méně CD8T buňkám ve zdravé tkáni než ve tkáni aloštěpu (obrázek 3b). Když se navíc podíváte na expresi CD69/CD103 a podmnožiny definované CD45RA/CCR7/CD28/CD27-, žádné rozdíly v distribuci CD69/CD103- nebo CD45RA/CCR7/CD28/CD27- byly zaznamenány definované podskupiny bez ohledu na fenotyp CD8/CD4 (obrázek 3d a obrázek S5). Při zkoumání frekvencí exprese markerů typičtějších pro cytotoxické cirkulující T buňky jsme nenašli žádné rozdíly v expresi T-bet, KLRG1 nebo granzymu B mezi T buňkami zdravé ledviny nebo aloštěpu (obrázek 3a, gh). Zjistili jsme, že exprese Eomes byla pozorována méně často v CD4 T buňkách aloštěpové tkáně než v T buňkách zdravé tkáně (obrázek 3f). Nebyly pozorovány žádné rozdíly v expresi ostatních markerů. (Obrázek 3-l a obrázek S5b-d). Závěrem lze říci, že kromě nižší frekvence exprese Eomes mezi aloštěpy CD4 T buňkami se populace buněk mezi studovanými populacemi nelišily.

3.6. CD69-CD103-T buňky v ledvinové tkáni se liší od cirkulujících buněkVzhledem k podobnému fenotypovému složení CD8 a CD4 T buněk nalezených ve zdravé tkáni ledvin a ve tkáni ledvinového aloštěpu jsme shromáždili data z obou studijních skupin, abychom dále prozkoumali charakteristiky těchto buněk podle exprese CD69 a CD103. Protože buňky CD69-CD103 plus byly vždy detekovány ve velmi nízkých frekvencích (<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Nejprve jsme zkoumali rozdíly v těchto podskupinách podle koexprese CD69/CD10}3 v populacích T buněk ledvin (obrázek 4 a obrázek S6). Je zajímavé, že u CD8 i CD4 T buněk byly zaznamenány podstatné rozdíly v distribuci CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definovaných podskupin mezi CD69-CD103-,CD69 plus CD{10} {14}}a podmnožiny CD69*CD103*. U CD8 T buněk obsahovaly CD69-CD103-buňky značnou populaci buněk TeyRA (21 procent), která byla mnohem menší mezi podskupinami CD69 plus CD103- a CD69 plus CD103 (5,8 procenta a 2,2 procenta). Místo toho tyto poslední populace obsahovaly mnohem větší subpopulace TEy3 (13 procent, 30 procent a 32 procent) a TEy4 (8 procent, 19 procent a 33 procent, v tomto pořadí). U CD4 T buněk bylo mezi podskupinami CD69-CD103-, CD69*CD103- a CD69 plus CD103* pozorováno jen málo buněk TEyRA (2,6 procenta, 0 procent a 1,7 procenta, respektive). Místo toho tyto buňky obsahovaly velké subpopulace TFw1 (26 procent, 0,24 procent, respektive 10 procent) a TEy2 ells (30 procent, 46 procent a 27 procent, v tomto pořadí). Mezi CD69 plus CD103-a zejména mezi buňkami CD69*CD103* byla pozorována mnohem větší subpopulace TEM4 (6 procent, 11 procent a 34 procent, v tomto pořadí).

Vzhledem k těmto rozdílům a předchozímu pozorování, že populace T-buněk ledvin sotva obsahovaly TN a TcM buňky, jsme dále zkoumali CD69-CD103-buňky nalezené v ledvinové tkáni, abychom určili, do jaké míry byly tyto buňky nejen cirkulující buňky procházející cirkulací ledvin. Abychom toho dosáhli, porovnali jsme tyto buňky s cirkulujícími buňkami. CD69-buňky CD103~ v ledvinové tkáni se významně lišily od buněk v oběhu: T-bet, Ki{5}} a CXCR3 byly častěji exprimovány ledvinovými T buňkami, bez ohledu na fenotyp CD8/CD4 (obrázek 5a-c). Naproti tomu IL-7R, CCR7, CD28 a CD27 byly všechny exprimovány významně méně často ledvinovými T buňkami CD69-CD103-, bez ohledu na fenotyp CD8/CD4 (obrázek 5d- G). CD69-CD103-CD4 T buňky v ledvinové tkáni exprimovaly KLRG1 významně častěji než v krvi a CD69-CD103-CD8 T buňky v ledvinové tkáni exprimovaly Eomes významně častěji než v krvi.

Dále jsme chtěli vidět, jak koexprese CD69 a CD103 ovlivnila markery funkčního potenciálu. Nejprve jsme se podívali na markery spojené s cytotoxickým potenciálem. Ačkoli byly zaznamenány rozdíly mezi jednotlivými subpopulacemi, nebyly pozorovány žádné následné vzory pro T-bet a Eomes v CD8 T buňkách, když byly CD69 nebo CD103 koexprimovány (obrázek 6a, b). Naproti tomu u CD4 T buněk se oba tyto transkripční faktory zvýšily společně s Koexprese CD69 a CD103 (obrázek 6a,b). Při pohledu na KLRG1 jsme si všimli, že u CD8 T buněk exprese KLRG1 klesala společně s koexpresí CD69/CD103. U CD4 T buněk byl pozorován podobný trend. Zde však pouze buňky CD69-CD103-exprimovaly KLRG1 s vyšší frekvencí než buňky CD69 plus CD103- a CD69 plus CD103* (obrázek 6c). Frekvence exprese granzymu B také klesaly spolu s markery tkáňové rezidence, přičemž frekvence jeho exprese byla nejnižší mezi buňkami CD69 plus CD103*, v rámci CD8 i CD4 T buněk (obrázek 6d). Exprese Ki-67, která byla vyšší mezi ledvinovými T buňkami ve srovnání s T buňkami v krvi, se nelišila podle koexprese CD69 nebo CD103 (obrázek 6e).

Poté jsme zkoumali markery normálně spojené s necytotoxickým paměťovým profilem podle koexprese CD69/CD103. Exprese IL-7Ra, CCR7 a CD28 byla nejvyšší v populacích CD69-CD103-, s trendem v definování exprese spolu s koexpresí CD69/CD103 (obrázek 6f-h ). Poté jsme se podívali na expresi CXCR3 a CXCR6. Oba chemokinové receptory byly nejčastěji exprimovány buňkami CD69tCD103t, bez ohledu na fenotyp CD8/CD4, a vykazovaly vzestupný trend s koexpresí CD69/CD103. Pouze u CXCR6 byl tento trend statisticky významný a ovlivnil jak CD8, tak CD4 Telly (obrázek 6j,k). Závěrem lze říci, že CD69-CD103- buňky v ledvinové tkáni se podstatně liší od buněk v oběhu a mohou se týkat jiné populace TBv, která není označena expresí CD69 nebo CD103. Jediným markerem, který se konzistentně lišil, bez ohledu na fenotyp CD8/CD4, pokud jde o koexpresi CD69 a CD103, byl CXCR6.

3.7. T buňky v ledvinové tkáni častěji produkují interferon než T buňky v krviNakonec jsme zkoumali kapacitu produkce cytokinů pomocí CD8/CD4-definovaných populací T buněk v ledvinové tkáni. Nejprve jsme porovnali produkci interferonu-y (IFNy), tumor nekrotizujícího faktoru (TNF ), interleukinu-2 (IL-2), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF) a IL-17 pomocí stimulovaných populací T lymfocytů definovaných CD8/CD{10}} nalezených v krvi až po ty ve zdravé ledvinové tkáni (obrázek 7a-e). Je zajímavé, že pouze IFNy byl konzistentně exprimován větším podílem T buněk ve zdravé ledvinové tkáni ve srovnání s T buňkami v krvi, bez ohledu na fenotyp CD8/CD4 (obrázek 7a). Rozdíly byly zaznamenány také na úrovni jednotlivých podskupin. Konkrétně TNF a GM-CSF byly častěji produkovány CD4 T buňkami v tkáni ledvin (obrázek 7b.c). S ohledem na polyfunkčnost (tj. počet současně produkovaných cytokinů) bylo zjištěno, že CD4 T buňky v ledvinové tkáni jsou více polyfunkční než CD4 buňky v krvi (obrázek 7f).

Dále jsme sledovali rozdíly v kapacitě produkce cytokinů mezi stimulovanými T buňkami ze zdravé a aloštěpové tkáně. Nebyly zjištěny žádné rozdíly v produkci jednotlivých cytokinů nebo v řadě současně produkovaných cytokinů mezi T buňkami ze zdravé ledvinové tkáně nebo tkáně aloštěpu (obrázek S7). Protože CD69 je exprimován při stimulaci T buněk, studovali jsme pouze rozdíl mezi CD103-negativními a CD103-exprimujícími CD4 a CD8 T buňkami (obrázek 7g-). Při srovnání CD4 a CD8 T buněk exprimujících CD103 s buňkami neexprimujícími CD103 v ledvinové tkáni jsme si všimli, že CD8 a CD4 CD103 buňky exprimovaly více IFNy než CD{15}} buňky (obrázek 7g). Kromě toho, ačkoli buňky produkující IL-1ZA byly nízké mezi CD103 plus CD8 a CD4 T buňkami v tkáni ledvin, byly v této populaci konzistentně nacházeny častěji ve srovnání s populací CD103-. Závěrem lze říci, že více T' buněk v ledvinové tkáni produkovalo IFNy ve srovnání s cirkulujícími T buňkami, bez ohledu na fenotyp CD8/CD4. Nejvyšší procento buněk produkujících IFNy bylo skutečně nalezeno mezi CD103-exprimujícími CD4 a CD8 T-buňkami derivovanými z ledvin. Kromě toho se T buňky v ledvinových aloštěpech s ohledem na tyto parametry nelišily od buněk ve zdravé ledvinové tkáni.

4. Diskuze

V této studii jsme se zabývali rozmanitostí podskupin T buněk podle exprese CD8 a CD4 a markerů tkáňové rezidence, CD69 a CD103, v lidských ledvinách a srovnávali jsme je s krví. V tkáni ledvin byl skutečně detekován značný počet CD8 a CD4 T buněk. Kromě toho tyto T buňky v ledvinách obsahovaly značné množství CD69*CD103-buněk. CD69 plus CD103 plus buňky byly také detekovány, ale převážně mezi CD8 T buňkami a mezi CD4 T buňkami se prakticky nevyskytovaly. Podobný nález se dříve týkal TRM plic [23]. Jak se očekávalo, takové populace exprimující CD69 a CD103-místo toho v oběhu téměř chyběly. Nápadný rozdíl při srovnávání T buněk v ledvinách s těmi v krvi se týkal odlišné distribuce tradičních CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definovaných podskupin. Je zajímavé, že exprese CD28 nebyla častěji exprimována, když T buňky koexprimovaly CD69 samotný nebo v kombinaci s CD103. Teoreticky by to mělo způsobit, že tyto populace budou méně citlivé na kostimulační signály CD80 a CD86. Další rozdíly se týkaly vyšší frekvence exprese CXCR3, CXCR6 a Ki-67. Kromě toho ledvinové T buňky častěji obsahovaly buňky produkující IFNy a byly často polyfunkční. V ledvině CD103 plus Tpys skutečně obsahovaly více buněk produkujících IFN než jejich CD103-negativní protějšky. Kromě toho buňky CD103T častěji produkovaly IL-17, ačkoli se to týkalo skromné ​​populace.

CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCI LEDVIN/RENÁL

S ohledem na častější expresi CXCR3 ledvinovými T buňkami CD8 a CD4 se již dříve ukázalo, že osa CXCR3/CXCL10 se podílí na utváření populací TpM v kůži, játrech a lymfatické tkáni [24-28]. Kromě toho se podílí na přenosu na stresovaný epitel a zánět v obecném smyslu [14-17]. Vzhledem k vysokým frekvencím CXCR3 mezi těmito T buňkami ve zdravé ledvinové tkáni se zdá, že CXCR3 se podílí také na homeostáze TRM v ledvinové tkáni a nemusí nutně zahrnovat zánět nebo signály nebezpečí. S ohledem na CXCR6 se již skutečně ukázalo, že osa CXCR6/CXCL16 je zásadní pro transport Tpst do různých kompartmentů, jako jsou plíce, kůže, játra a mozek, a může se týkat univerzálního mechanismu nezbytného pro vedení a udržení TRM do a v tkáních, také pokud jde o TRM v lidské ledvinové tkáni [18-22].

Farber a spolupracovníci rozsáhle charakterizovali a porovnávali populace CD8 a CD4 TRM sídlící v různých typech lidských tkání odvozených od dárců orgánů. Popsali, jak se liší populace TRM v plicích, slezině, tenkém střevě a různých sekundárních lymfoidních tkáních s ohledem na transkriptom, ale také na expresi různých proteinů, včetně cytokinů, zkoumaných v současné studii [29-31. Tyto výzkumy však nezahrnovaly populace TRM v lidských ledvinách a údaje o tom

předmět je vzácný. Již dříve jsme ukázali, že CD8 T buňky zacílené na polyomavirové BK VP1 a LTAG proteiny, pocházející z viru, který má silný tropismus pro renální epiteliální buňky, jsou detekovatelné v aloimplantátových ledvinách. Tyto virově specifické T buňky exprimovaly CD69 a CD103 ve vyšším počtu než jejich protějšky nalezené v oběhu stejných pacientů. Kromě toho tyto T buňky obecně exprimovaly CD45RA-CD27-granzym B-negativní fenotyp[5]. Později jiní také informovali o populacích TRM v lidské ledvinové tkáni získané z transplantovaných nefrektomií. V této publikaci autoři uvádějí, že T buňky v těchto tkáních se týkaly hlavně CD8 T buněk [321. Místo toho jsme zjistili, že CD4 T buňky ve skutečnosti zahrnovaly největší podskupinu T buněk. Zjistili jsme však také, že rovnováha se posunula, i když ne významně, směrem k většímu počtu CD8 T buněk v aloštěpové tkáni ve srovnání se zdravou ledvinovou tkání. Jako takový by tento rozpor mohl být vysvětlen jinou studijní skupinou a může se stát, že ve zdraví je imunologická obrana více zaměřena na extracelulární hrozby, jako jsou bakterie, oproti více intracelulárním hrozbám, jako jsou viry a rakovina u imunokompromitovaných hostitelů. Nenašli jsme další rozdíly ve studovaných markerech mezi T buňkami zdravé ledviny a aloštěpu. Nicméně další výzkum využívající techniky s širším pohledem na transkriptomy, jako je sekvenování RNA nebo proteom, jako je hmotnostní spektrometrie, by měl být použit ke zjištění, zda tomu tak skutečně je.

Kromě toho de Leur a kol. popisují, jak TRM v ledvinách často exprimoval granzym B, zatímco jsme detekovali pouze malá množství granzymu B ve zdravé tkáni ledviny i ve tkáni aloštěpu [32]. V ledvinové tkáni jsme však detekovali podstatné T-bet a Eomes exprimující T buňky, které jsou v cirkulujících populacích T buněk normálně skutečně spojeny s vyšší expresí granzymu B [10]. I když to nemusí být překvapivé, vzhledem ke skutečnosti, že exprese granzymu B je také přímo indukována T-bet [33,34], tato asociace nebyla v současné studii mezi T buňkami ledvin zřejmá. Jak jsme my a jiní ukázali, že také TRM pocházející z lidských plic, mozku a kůže [25,26,3536] a také MAIT ælls 【6,7】 mají nízký obsah granzymu B obsah, i když často vyjadřuje značné množství T-betu a Eomes, může to být společný rys (lidského) TkM. Kromě toho bylo v plicním TRM pozorováno, že exprese granzymu B je po stimulaci rychle upregulována [35l, což naznačuje, že k tomu může dojít také u jiných TeM. Zde autoři předpokládali, že taková „skrytá cytotoxicita slouží k ochraně strukturální integrity tkání před poškozením cytotoxickými T buňkami.

Závěrem jsme ukázali, že T cls v ledvinové tkáni jsou přítomny ve značném počtu a zahrnují populace, které často exprimují CD69 plus a CD103 plus, molekuly, pomocí kterých T lymfocyty přilnou k tkáním a přetrvávají v nich. Zdá se však, že CD69-CD103- T buňky v ledvinové tkáni jsou odlišné od cirkulujících T buněk a mohou se týkat jiné odlišné populace TiM, která možná přetrvává v ledvinách jinými mechanismy, které budou odhaleny veterinářem. Další možností může být, že tyto CD69-CD103-T buňky se týkají populace, která seno teprve nedávno vystoupila z oběhu a seno pouze přechodně získalo nové fenotypové znaky v důsledku interakce s mikroprostředím ledvin. K objasnění těchto možností je zapotřebí dalšího zkoumání této populace. Dále. CD8 a CD4 ledvinové T buňky často aktivně cyklovaly a častěji exprimovaly CXCR6. Kromě toho populace CD8 a CD4 vytlačily zvláště vysokou expresi CXCR3, což silně implikuje tyto chemokinové receptory, stejně jako CXCR6 v přírůstku TRM a perzistenci v lidských ledvinách. Proto jsou zapotřebí další výzkumy, aby se zlepšil náš obraz populací Tpv v lidských ledvinách. Nicméně zde prezentovaná zjištění tvoří solidní první krok k podrobnější charakterizaci populací T buněk v ledvinové tkáni a jejich roli ve zdraví a nemoci.