Myši s podmíněným knockoutem karboxypeptidázy E vykazují poruchy učení a paměti a neurodegeneraci, část 2

Nissl a imunofluorescenční barvení

Zvířata byla perfundována 4% paraformaldehydem a byly získány zmrazené řezy mozkových tkání. Mozkové tkáně byly nařezány na 30 um řezy pro barvení Nissl, doublecortinem (DCX), CPE a MAP2.

V posledních letech, s neustálým rozvojem lékařské techniky, stále více lidí začalo věnovat pozornost tomu, jak zlepšit svou paměť, aby zvládli stále složitější a rychlejší tempo života. Doublecortin se přitom postupně stal jedním z horkých témat diskusí.

Co je tedy doublecortin? Doublecortin je látka v mozku, která hraje důležitou roli při podpoře a udržení funkce paměti. Je distribuován hlavně v synapsích mezi neurony v mozku. Může regulovat excitabilitu neuronů a podporovat přenos informací mezi neurony, čímž zlepšuje lidské kognitivní schopnosti a paměť.

Některé studie prokázaly úzký vztah mezi hladinou doublecortinu a pamětí. Někteří starší dospělí mají například výrazně nižší hladiny doublecortinu a zároveň klesá paměť. Nejen to, některá neurologická onemocnění, jako je Alzheimerova choroba a Parkinsonova choroba, jsou také spojena se sníženou hladinou doublecortinu.

Neignorujte však, že doublecortin není všelék. Lidem může pomoci zlepšit paměť jen do určité míry, ale nemůže vyřešit všechny problémy s pamětí. Kromě toho, ačkoli některé experimenty ukázaly, že suplementace doublecortinem může zlepšit kognitivní schopnosti a schopnosti učení, tyto experimenty nemohou plně prokázat, že doublecortin může zlepšit lidskou inteligenci.

Pokud si tedy chcete zlepšit paměť, nestačí doplňovat samotný doublecortin. Mnoho dalších faktorů může pomoci zlepšit paměť. Například více cvičení, udržování dobrého postoje, pravidelná práce a odpočinek atd. mohou lidem pomoci zlepšit jejich paměť.

Stručně řečeno, mezi doublecortinem a pamětí skutečně existuje určitý vztah, ale neměli bychom na doublecortin klást příliš velká očekávání. To neznamená, že bychom neměli věnovat pozornost doublecortinu. Naopak, musíme hlouběji porozumět jeho roli, abychom si lépe udrželi a zlepšili své fyzické zdraví. Pojďme společně zlepšit naši paměť! Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť. Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola může také regulovat rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů. Tyto látky jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může maso také zlepšit průtok krve a podporovat dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostane dostatek živin a energie, a tím zlepší mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klikněte na vědět doplňky pro posílení paměti

Králičí antiDCX protilátka (1:1000; Cell Signaling Technology, Boston, USA, 4604S),myší anti-CPE protilátka (1:1000; BD bioscience, New Jersey, USA,610758), králičí anti-GFAP protilátka (1:200; Cell Signaling Technology, 80788) a králičí anti-MAP2 protilátka (1:1000; Cell Signaling Technology, 8707) byly použity pro imunofluorescenci.

Sekundární protilátky byly Alexa Fluor 594 kozí anti-myší sekundární protilátka (1:1000; Invitrogen, Carlsbad, CA, 11005) nebo Alexa Fluor 594 kozí anti-králičí sekundární protilátka (1:1000; Invitrogen, 11012). Relativní intenzita fluorescence MAP2 a GFAP v hipokampálním Sub a dmPFC při 100násobném zvětšení byla vypočtena pomocí softwaru ImageJ (National Institutesof Health, USA).

Západní blotting

Hipokampální a PFC tkáně byly připraveny, jak bylo popsáno dříve [22]. Proužky byly analyzovány pomocí softwaru ImageJ. Vzorky proteinů byly analyzovány na 10% SDS-polyakrylamidových gelových elektroforézních gelech a přeneseny na nitrocelulózové membrány (0,22 μm; Millipore, Billerica, MA, USA).

Po zablokování 5% odtučněným mlékem byla membrána blotována protilátkami proti myším anti- -aktinovým protilátkám (1:1000, CST, 4967S), myším anti-CPEprotilátkám (1:1000; BD bioscience, 610758), myším anti- BDNF protilátka (1:600, Abcam, UK, ab108319), králičí anti-p-TrkB protilátka (1:1000; Boster, Wuhan, Čína, BM4437), králičí anti-AKT (1:2000, Cell Signaling Technology, 4691S) a anti-p-AKT (1:2000, Cell Signaling Technology, 23430S) přes noc při 4 stupních.

Po promytí byly membrány inkubovány s anti-myšími nebo anti-králičími IgG protilátkami po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Hladina proteinové exprese pro každý vzorek byla normalizována na -aktin.

Statistická analýza

Data byla analyzována jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA) pro víceskupin. Analýza byla provedena pomocí GraphPad Prism 8.0 (software PrismGraphPad). Všechny hodnoty jsou označeny průměrem ± standardní chyby (SEM). P < 0.05 bylo považováno za významné.

VÝSLEDEK

Analýza tělesné hmotnosti a glukózy v plazmě

Pro analýzu tělesné hmotnosti a glukózy v plazmě byly použity myši ve věku 1–20 týdnů (obr. 1a). Výsledky ukázaly, že mezi myšmi WT, CPEflox/− a CPEflox/flox nebyly žádné významné rozdíly v tělesné hmotnosti. Hladiny glukózy v inplazmě nalačno a metabolismus byly hodnoceny ve věku 10 týdnů (obr. 1b). Zjistili jsme nogenotypové rozdíly mezi zvířaty WT, CPEflox/− a CPEflox/flox.

Ztráta učení a paměti u myší CPEflox/flox

Z testu v otevřeném poli jsme pozorovali, že mezi každou skupinou genotypu nebyl žádný rozdíl ve vzdálenosti ujeté v přístroji v otevřeném poli (obr. 2a). To naznačuje, že autonomní chování a chování myší CPEflox/flox nebylo ovlivněno. Pro učení a paměť u myší jsme použili test rozpoznávání objektů (obr. 2b). Pozorovali jsme, že myši CPEflox/flox strávily podstatně méně času objevováním nových objektů než myši WT. Y-bludiště a FCT-krátkodobé wascarried k posouzení krátkodobé paměti u myší (obr. 2c-e).

V testu Y-bludiště strávily myši WT a CPEflox/− více času v novém rameni než myši CPEflox/flox. Pro krátkodobou FCT byla retence krátkodobé paměti u myší CPEflox/flox horší než u myší WT a CPEflox/−. Pro dlouhodobé uchování paměti (obr. 2f) test kondicionování strachu ukázal, že myši WT a CPEflox/− měly významně lepší paměť na šok do nohy než myši CPEflox/flox.

Myši CPEflox/flox vykazují degeneraci subikula (Sub).

Použili jsme western blotting k charakterizaci exprese hladin CPE v hippocampu ve srovnání s vnitřním kontrolním proteinem -aktinem (obr. 3a, b). Výsledky ukázaly, že protein CPE v hipokampu myší CPEflox/flox významně poklesl. Po paradigmatu stresu sub-oblast myší CPEflox/flox zcela degenerovala, ale ne před nošením, zatímco hippokampální formace myší WT byla neporušená (obr. 3c).

Myši CPEflox/flox vykazují snížení intenzity GFAP a MAP2 a signalizace TrkB v hippocampu

Hodnotili jsme expresi Akt/mTOR-zprostředkovaných proteinů souvisejících s BDNF/TrkBpathway. Western blot analýza BDNF proteinů ukázala, že ve srovnání s WT myšmi, obsah BDNFproteinu v hippocampu CPEflox/flox myší ukázal stejné množství ve srovnání s WT a CPEflox/- myší (obr. 4a, b). P-TrkB protein byl významně snížen u CPEflox/flox myší ve srovnání s WT a CPEflox/- myší (obr. 4a, c).

Výsledky ukázaly, že myši CPEflox/flox vykazovaly snížení exprese hippocampu fosforylovaného Akt a fosforylovaného mTOR ve srovnání s myšmi WT (obr. 4a, d, e). Výsledky imunofluorescence ukázaly sníženou expresi CPE v hipokampální části (obr. 4f, g). Použili jsme anti-MAP2 imunobarvení, abychom ukázali intenzitu MAP2 v oblasti sub a hilu hipokampu (obr. 4f).

Výsledky imunofluorescence ukázaly sníženou intenzitu MAP2 u Sub andhilus myší CPEflox/flox, ale ne u myší WT a CPEflox/- (obr. 4f, h,i). Kromě toho imunobarvení DCX ukázalo, že neurogeneze v DG hippocampu u myší CPEflox/− byla podobná jako u myší u WT, ale u myší CPEflox/flox byla významně snížena (obr. 4f, j). Intenzita GFAP v hipokampálním Sub byla významně nižší u myší CPEflox/flox než u myší WT (obr. 4f, k).

Myši CPEflox/flox vykazují snížení intenzity GFAP a MAP2 v dmPFC

K charakterizaci exprese hladin CPE v dmPFC ve srovnání s -aktinem jsme použili western blot (obr. 5a, b). Výsledky ukázaly, že protein CPE v dmPFC myší CPEflox/flox byl významně snížen. Po paradigmatu stresu výsledky imunofluorescence ukázaly sníženou intenzitu MAP2 u myší dmPFCCPEflox/flox, ale ne u myší WT (obr. 5c, d). Kromě toho byla intenzita GFAP v dmPFC významně nižší u myší CPEflox/flox u myší WT (obr. 5c, e).

DISKUSE

V této studii jsme vytvořili myš CPE-cKO pro studium fenotypu ztráty funkce CPE v neuronech mozku. Předchozí studie ukázala, že u myší CPE-KO se rozvine obezita a diabetes a ve věku 8 týdnů jsou těžší než myši WT [5]. Naše měření ukázala, že nedošlo k žádné významné změně tělesné hmotnosti, hladin glukózy v plazmě a glukózové tolerance u myší CPEflox/flox ve srovnání s myšmi WT.

Behaviorální studie určily, že stresové paradigma u CPEflox/flox myší zhoršuje učení a paměť. Kromě toho stres a snížená exprese CPE vedly k subdegeneraci hipokampu, snížené neurogenezi v DG a snížené hustotě neuronů v hippocampu Sub a dmPFC.

CPE je enzym zpracovávající prohormony, který zpracovává prohormon, který odštěpuje C-terminální bazický zbytek z prekurzoru enkefalinu za vzniku enkefalinu [23]. Jako aneuroprotektivní faktor hraje CPE důležitou roli v embryonálním a postnatálním vývoji mozku [24].

Kazuistika ukázala, že homozygotní nesmyslná mutace v genu CPE je spojena s klinickými fenotypy složenými z obezity, intelektuálního postižení a hypogonadismu [2]. CPEfat/fat myši vykazují pokles hladin CPE a zvýšení hladin proinzulinu, což podporuje roli CPE při dysregulaci inzulínu [25]. Spontánní bodové mutace v CPE snižují aktivitu enzymu, což vede k těžké obezitě [4]. U CPE-KO myší se rozvine diabetes a tyto myši mají vysoké hladiny glukózy ve věku 8–10 týdnů.

Vysoká hladina glukózy byla udržována přibližně 2 měsíce a poté začala klesat, což naznačuje reverzibilní fenotyp diabetu [26]. Naše studie prokázala, že mezi CPEflox/flox a WT myšmi nebyl žádný významný rozdíl v hladinách plazmatické glukózy a glukózové toleranci ve věku 10 týdnů. CPE-KOmice začínají přibírat na váze přibližně ve 4 týdnech věku a do 8 týdnů jsou těžší než vrhy WT [27]. Bylo prokázáno, že myši CPE-KO vykazují zvýšenou spotřebu potravy.

Zvýšená spotřeba je výsledkem nesprávných signálů řídících dietní chování, včetně rovnováhy orexigenních a anorektických neuropeptidů v hypotalamu [5]. Správné zrání těchto neuropeptidů vyžaduje správný transport a zpracování těchto neuropeptidů, v čemž hraje CPE důležitou roli [28].

Zaznamenali jsme tělesnou hmotnost myší od 1 do 20 týdnů a výsledky ukázaly, že odstraněné neurony CPEin neovlivnily tělesnou hmotnost. V naší studii CPE-cKO nezměnil hmotnost ani spotřebu glukózy. Může se stát, že podmíněný knockout CPE v neuronech neovlivňuje signály řídící dietní chování. Proto je taková CPE-cKO myš cenným modelem pro studium fenotypu ztráty funkce CPEin neuronů mozku.

CPE hraje v centrálním nervovém systému různé role, včetně udržování normální kognitivní funkce, správné neuronální struktury a přežití neuronů [3]. Předpokládá se, že CPE hraje roli v buněčném zpracování prekurzorových proteinů. Má také neuroprotektivní aktivitu, nezávislou na své enzymatické aktivitě, působí extracelulárně jako neurotrofní faktor [25]. Byla prokázána nová role CPE v neurovývoji a větvení proximálních dendritů, což je nezbytné pro migraci a dendrogenezi kortikálních neuronů [29]. CPE-KO myši ve stresu bez aktivity CPE vykazují mnoho behaviorálních abnormalit, včetně deficitu učení a paměti [30]. Předchozí studie hodnotily procesy učení a paměti, když byla zvířata stará přibližně 2 měsíce, když se hmotnost myší právě začala rozcházet [31].

Bylo zjištěno, že stres ovlivňuje atvarózní úrovně analýzy hippocampu [32]. Behaviorálně studie zjistily, že stres obecně zhoršuje různé úkoly učení a paměti závislé na hippocampu [20]. Neurálně studie na zvířatech odhalily, že stres mění následnou synaptickou plasticitu a vlastnosti spouštění hipokampálních neuronů [33]. Strukturálně studie ukázaly, že stresové změny morfologie neuronů potlačují produkci nových granulovaných neuronů v gyrus dentatus a zmenšují objem hipokampu [34]. Provedli jsme testy rozpoznávání objektů, Y bludiště a testy kondicionování strachu na myších CPEflox/flox ve věku 10 týdnů. Pro rozpoznávání objektů vykazovaly myši WT zjevnou preferenci pro nový objekt.

Naproti tomu myši CPEflox/flox nedokázaly během těchto období vykázat preferenci pro jakýkoli objekt. K vyhodnocení krátkodobé paměti myší bylo použito Y bludiště. Myši WT byly zvědavější než myši CPEflox/flox, aby prozkoumávaly oblasti, které předtím nenavštívily. . Kromě toho byl test stavu strachu použit k hodnocení krátkodobé a dlouhodobé rozpoznávací paměti.

Myši WT byly účinnější v rozpoznávání podmíněných podnětů než myši CPEflox/flox. Je třeba poznamenat, že podmíněné myši CPE KO byly nedávno vytvořeny pod promotorem Pomc, který vyřadí buňky exprimující proopiomelanokortin. Tyto CPE-cKO myši vykazovaly normální fyziologii, chování a hladiny neuropeptidů[35]. Naproti tomu naše podmíněné CPE KO myši pod Camk2apromotorem vykazovaly zhoršenou paměť a neurodegeneraci, což podporuje hypotézu, že CPE je neuroprotektivní protein proti stresu [36].

Studie na CPE-KO myších odhalily několik úrovní abnormalit. Behaviorálně vykazují myši CPE-KO chování podobné depresi a poruchy učení. Elektrofyziologické analýzy ukázaly, že dlouhodobá potenciace hipokampu u CPE-KO myší byla narušena. Morfologická analýza prokázala, že hipokampus degeneroval po stresu, když byla CPE knockoutována [31]. CPE je regulován různými druhy stresu a je důležitý při ochraně neuronů [3]. Vliv nedostatku CPEproteinu na prefrontální kortex při stresu nebyl hlášen.

Není pochyb o tom, že chování učení a paměti vyžaduje interakci mezi rozsáhlými mozkovými sítěmi. Paměť a vybavování závisí na interakcích mezi prefrontálním kortexem a hipokampem [37]. Hipokampální prefrontální kortexový okruh proto hraje klíčovou roli v kognitivní regulaci a konsolidaci paměti [38]. U myší CPE-KO způsobila delece proteinu CPE poškození hipokampálních neuronů CA3 [39].

Předchozí studie ukázala, že stres z odvykání zvyšuje sekreci glukokortikoidů a indukuje spouštění neuronů v granulosocytech DG ke zvýšení sekrece glutamátu, což vede k excitotoxicitě a smrti neuronů CA3 u myší CPE-KO [40]. Je možné, že cKO genu CPE v neuronech má menší účinek na endokrinní systém.

Bylo také prokázáno, že po přechodné globalischemii byly neurony v oblasti CA1 zranitelnější a vykazovaly pouze přechodné zvýšení exprese CPE [41]. Genetické léze hipokampálních podoblastí ukázaly odlišné funkce v učení a paměti [42]. Klasický „trisynaptický“ okruh (DG > CA3 > CA1 > Sub) je topologicky uspořádaná a částečně se nepřekrývající dorzální-dorzální, střední, střední až střední a ventrální-ventrální projekce [43].

Hlavní organizací savčí hipokampální formace je jednosměrný okruh, ve kterém jsou informace přenášené z povrchové vrstvy entorhinálního kortexu do DG postupně zpracovávány v podpole CA: CA3, CA2 a CA1. Dorzální CA1 vysílá svou hlavní projekci přímo do vnitřní entorhinální kortexové vrstvy 5 nebo nepřímo přes dorzální Sub (objížďkový okruh) [42].

Jedním ze zajímavých rozdílů mezi přímými a nepřímými hipokampálními výstupními cestami je to, že v posledně jmenovaných, dorzálních subprojektech do vrstvy 5 entorhinální kůry a mnoha kortikálních a subkortikálních oblastí mozku[44]. Některé klinické studie ukázaly, že podoblasti DG a CA jsou selektivně aktivovány během vytváření epizodické paměti, zatímco Sub je aktivní během vzpomínání na epizodu [45].

V této studii se významně snížila exprese proteinu CPE v hippocampu a dmPFC myší CPEflox/flox. Poškození neuronů a apoptóza v podoblasti tedy vedou k deficitům paměti. U myší CPEflox/flox mohou být neurologické deficity způsobeny částečnými kompenzačními mechanismy, včetně poškození neuronů hippocampalSub a dmPFC.

Astrocyty zprostředkovávají vývojové, fyziologické a patologické procesy [46]. Jsou považovány za klíčové podpůrné prvky funkce neuronů, které poskytují strukturální a metabolickou podporu neuronů [47]. Astrocyty ovlivňují nábor a funkci neuronů na lokální a síťové úrovni [48]. Zjistili jsme, že počet astrocytárních buněk v hipokampálním Sub a dmPFC se významně snížil, pravděpodobně proto, že CPE je důležitý při diferenciaci nervových kmenových buněk na astrocyty [49].
BDNF je považován za důležitý regulátor vícenásobných stresorů [50]. Reguluje synaptický přenos a dlouhodobou potenciaci v hipokampu a podílí se na tvorbě určitých forem paměti [51]. Nedávno bylo CPE indikováno jako kritický růstový a trofický faktor chránící hipokampus před stresem indukovanou smrtí pyramidálních neuronů a kognitivní poruchou [36]. V této studii jsme zjistili, že exprese BDNF byla stejná jako u WT myší. Tento výsledek ukazuje, že navzdory expresi podobných hladin BDNF vykazují myši CPEflox/flox úplnou neurodegeneraci se silným stresem.

ZÁVĚR

Stručně řečeno, tato studie ukazuje, že myši CPEflox/flox vykazují zhoršené učení a paměť pod stresovým paradigmatem zahrnujícím emoční a fyzický stres spojený s odstavením.

Snížená exprese CPE a stresové paradigma vedly k subdegeneraci hipokampu, snížené neurogenezi v DG a snížené hustotě neuronů v hipokampálním Sub a dmPFC.

REFERENCE

1. Cawley NX, Wetsel WC, Murthy SR, Park JJ, Pacak K, Loh YP. Nové role karboxypeptidázy E v endokrinní a nervové funkci a rakovině. Endocr Rev.2012;33:216–53.https://doi.org/10.1210/er.2011-1039

2. Durmaz A, Aykut A, Atik T, Özen S, Ayyıldız Emecen D, Ata A, et al. Nová příčina syndromu obezity spojená s mutací v genu karboxypeptidázy zjištěná u tří sourozenců s obezitou, mentálním postižením a hypogonadotropním hypogonadismem. J Clin Res Pediatr Endocrinol. 2021;13:52–60.https://doi.org/10.4274/jcrpe.galenos.2020.2020.0101

3. Ji L, Wu HT, Qin XY, Lan R. Dissecting carboxypeptidase E: properties, functionsand pathophysiological role in disease. Endocr Connect. 2017;6:R18–R38.https://doi.org/10.1530/ec-17-0020

4. Naggert JK, Fricker LD, Varlamov O., Nishina PM, Rouille Y, Steiner DF a kol. Hyperproinzulinémie u obézních tukových myší je spojena s karboxypeptidázovou mutací, která snižuje aktivitu enzymu. Nat Genet. 1995;10:135–42.https://doi.org/10.1038/ng0695-135

5. Cawley NX, Zhou J, Hill JM, Abebe D, Romboz S, Yanik T a kol. Karboxypeptidáza E knockoutovaná myš vykazuje endokrinologické a behaviorální deficity. Endokrinologie. 2004;145:5807–19.https://doi.org/10.1210/en.2004-0847

6. Bosch E, Hebebrand M, Popp B, Penger T, Behring B, Cox H a kol. Syndrom BDV: vznikající syndrom s hlubokou obezitou a neurovývojovým zpožděním připomínajícím Prader-Williho syndrom. J Clin Endocrinol Metab. 2021;106:3413–27.https://doi.org/10.1210/clinem/dgab592

7. Chen H, Jawahar S, Qian Y, Duong Q, Chan G, Parker A a kol. Missense polymorfismus v genu lidské karboxypeptidázy E mění enzymatickou aktivitu. HumMutat. 2001;18:120–31.https://doi.org/10.1002/humu.1161

8. Zhu X, Wu K, Rife L, Cawley NX, Brown B, Adams T a kol. Karboxypeptidáza E je nutná pro normální synaptický přenos z fotoreceptorů do innerretiny. J Neurochem. 2005;95:1351–62.https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2005.03460.x

9. Griego E, Herrera-López G, Gómez-Lira G, Barrionuevo G, Gutiérrez R, Galván EJ. Funkční exprese receptorů TrkB na interneuronech a pyramidálních buňkách oblasti CA3 krysího hippocampu. Neurofarmakologie 2021;182:108379https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2020.108379

10. Xiao L, Sharma VK, Toulabi L, Yang X, Lee C, Abebe D, et al. Neurotrofický faktor 1, nový tropin, je kritický pro prevenci stresem indukované smrti hipokampálních buněk CA3 a kognitivní dysfunkce u myší: srovnání s BDNF. Translpsychiatrie. 2021;11:24https://doi.org/10.1038/s41398-020-01112-w

For more information:1950477648nn@gmail.com