CAR-neutrofily zprostředkované dodání nanoléčiv reagujících na mikroprostředí nádoru pro chemoimunoterapii glioblastomu

Glioblastom (GBM) je jedním z nejagresivnějších a nejsmrtelnějších solidních nádorů u lidí. Zatímco účinná terapeutika, jako jsou nově vznikající chimérické antigenní receptorové (CAR)-T buňky a chemoterapeutika, byla vyvinuta k léčbě různých druhů rakoviny, jejich účinnost při léčbě GBM byla z velké části omezována hematoencefalickou bariérou a hematoencefalickou bariérou. Lidské neutrofily účinně překračují fyziologické bariéry a vykazují efektorovou imunitu proti patogenům, ale krátká životnost a odolnost primárních neutrofilů vůči editaci genomu omezuje jejich široké použití v imunoterapii. Zde geneticky upravujeme lidské pluripotentní kmenové buňky s CRISPR/Cas9-zprostředkovaným genem knock-in, abychom exprimovali různé anti-GBM CAR konstrukty s T-specifickými CD3ζ nebo neutrofily-specifickými -signálními doménami. CAR-neutrofily s nejlepší protinádorovou aktivitou jsou produkovány tak, aby specificky a neinvazivně dodávaly a uvolňovaly nanoléčiva reagující na nádorové mikroprostředí za účelem cílení na GBM bez potřeby vyvolávat další zánět v místech nádoru. Tato kombinovaná chemoimunoterapie vykazuje vynikající a specifické anti-GBM aktivity, snižuje mimocílové podávání léčiva a prodlužuje životnost u samic myší s nádorem. Společně je tento biomimetický CAR-neutrofilní systém dodávání léků bezpečnou, silnou a všestrannou platformou pro léčbu GBM a případně dalších ničivých onemocnění.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

Glioblastom (GBM) se vyznačuje vysokou mortalitou, krátkou dobou života a špatnou prognózou s vysokou tendencí k recidivám1,2. Terapeutické účinnosti chirurgie i chemoterapie primárně brání jemná mozková struktura a fyziologická hematoencefalická bariéra (BBB) ​​nebo hematoencefalická bariéra (BBTB)3–5. Zejména dodávání léků do centrálního nervového systému (CNS) pro léčbu mozkových nádorů je velmi náročné:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Přirozená imunita a plasticita neutrofilů proti různým druhům rakoviny12–16, včetně GBM, byly méně prozkoumány než jejich aplikace jako přenašečů buněk při podávání léků8–10. Cirkulující neutrofily v krvi domů do hypoxického nádorového mikroprostředí (TME), kde se z nich stávají heterogenní neutrofily spojené s nádorem (TAN), základní složka imunosupresivního TME, která přispívá k progresi rakoviny a terapeutické rezistenci12,17. Podobně jako u makrofágů byly v hypoxickém TME18–21 nalezeny protinádorové fenotypy N1 a pronádorové N2 TAN. Byly vyvinuty různé terapeutické strategie k přímému zacílení na neutrofily se zaměřením na depleci nebo inhibici neutrofilů12,22, což vedlo k několika klinickým studiím (např. inhibitor CCR5 Maraviroc v NCT03274804). Přímá aplikace neošetřených neutrofilů jako nanonosičů tedy může představovat další riziko pro pacienty s rakovinou, u kterých mohou být neutrofily obchodující s drogami přeprogramovány na imunosupresivní protumorový fenotyp N2 v rámci TME po navádění na místa nádoru13,23. Kromě toho by měly být prozkoumány a posíleny vnitřní protinádorové aktivity naivních neutrofilů, aby se dosáhlo optimalizované terapeutické účinnosti při použití jako lékový nosič v kombinaci s chemoterapeutiky.

Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému

Modifikace chimérického antigenního receptoru (CAR) významně zvýšila protinádorové aktivity imunitních T nebo přirozených zabíječů (NK) buněk24–27. Jejich účinnost u pevných nádorů je však stále omezená, částečně kvůli jejich relativně nízké schopnosti transportu a penetrace nádoru. Přítomnost fyziologického BBB a BBTB dále brání účinnosti těchto nově vznikajících terapeutik proti GBM v mozku. Spekulovali jsme, že kombinace CAR inženýrství a vysoce pohyblivých neutrofilů by mohla udržet jejich protinádorový fenotyp N1 a poskytnout vynikající terapeutickou účinnost při léčbě GBM. Primární neutrofily jsou krátkodobé a odolné vůči úpravám genomu28, což omezuje jejich použití v imunoterapii zaměřené na CAR. Lidské pluripotentní kmenové buňky (hPSC), které jsou přístupnější pro editaci genů a jsou schopné masivně se diferencovat na neutrofily, by mohly poskytnout neomezený zdroj vysoce kvalitních CAR-neutrofilů pro cílenou imunoterapii za chemicky definovaných podmínek bez xeno29. Neutrofily také přednostně fagocytují mikrobiální patogeny s drsným nebo dlouhým povrchem, jako je S. aureus a E. coli30, což by mělo být vzato v úvahu při návrhu nanočástic při podávání léků zprostředkovaných neutrofily. Safari a kol. nedávno popsali preferovanou fagocytózu intravenózně podávaných prodloužených částic, bez komplikované povrchové úpravy, cirkulujícími neutrofily30. Takový snadný a bioinspirovaný design v nanočásticích naplněných léčivem může maximalizovat obsah léčiva v neutrofilech a umožnit terapeutické úrovně dodávání léčiva do cílových míst.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20 % podaných nanoléčiv je dodáváno do mozkových nádorů neutrofily CAR ve srovnání s 1 % volnými nanoléčivy. Stručně řečeno, náš biomimetický CAR-neutrofilní systém dodávání léků je bezpečnou, silnou a všestrannou platformou pro léčbu GBM a dalších ničivých onemocnění.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

Výsledek

Screening neutrofilně specifických CAR struktur na zesílené protinádorové aktivity

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90 % a většina cílených klonů je heterozygotních (doplňkový obr. 1a–d). Exprese CAR na upravených hPSC byla dále potvrzena RT-PCR a analýzou průtokové cytometrie CLTX-IgG4 (doplňkový obr. 1e–g). Jak se očekávalo, hPSC exprimující CAR si zachovaly vysoké hladiny exprese pluripotentních markerů, včetně OCT4, SSEA4 a SOX2 (doplňkový obrázek lf).

K produkci de novo CAR-neutrofilů byly hPSC exprimující CAR nejprve diferencovány na multipotentní hematopoetické a poté myeloidní progenitory pomocí cytokinové léčby specifické pro stadium35 (obr. 2c). Následné použití G-CSF a agonisty kyseliny retinové AM580 podpořilo silnou produkci neutrofilů36. Podobně jako jejich protějšky v periferní krvi (PB), neutrofily CLTX-CAR odvozené od hPSC vykazovaly typickou morfologii neutrofilů a povrchové markery CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b a CD18 (doplňkový obrázek 2). Dále jsme stanovili účinky exprese CAR na protinádorovou cytotoxicitu neutrofilů odvozených z hPSC jejich společnou kultivací s buňkami glioblastomu (GBM) U87MG in vitro. Jak se očekávalo, neutrofily CLTX-CAR odvozené od hPSC vykazovaly zlepšenou schopnost usmrcovat nádor ve srovnání s neutrofily PB (obr. 2d), což je v souladu s předchozími pozorováními u CLTX CAR-T buněk27. Mezi těmito různými CAR zprostředkovávala CAR č. 1 vynikající aktivity zabíjení nádorů u hPSC-neutrofilů. Zejména CAR #4 na bázi řetězce je nejméně účinný při spouštění neutrofily zprostředkovaného zabíjení nádorů, což může být způsobeno nižší kopií ITAM než v podjednotce ζ a nižší expresí CAR nesoucích na buněčném povrchu28. Neutrofily uvolňují cytotoxické reaktivní formy kyslíku (ROS) a tumor nekrotizující faktor- (TNF-), aby zabily cílové buňky. Produkce ROS a TNF- (obr. 2e, f) z různých neutrofilů se dobře shodovala s jejich zvýšenou cytolýzou. Jak se očekávalo, produkce ROS a TNF- z různých neutrofilů po společné kultivaci s normálními SVG p12 gliovými buňkami zůstala tak nízká jako u negativní kontrolní skupiny (doplňkový obrázek 3a, b). Kromě toho byla zvýšená protinádorová cytotoxicita CAR-neutrofilů pozorována pouze při společné inkubaci s buňkami GBM, včetně U87MG, primárních dospělých GBM43 a dětských buněk SJ-GBM2 (doplňkový obr. 3c), což prokazuje vysokou specifitu našeho CLTX -AUTO. Je pozoruhodné, že neutrofily CAR vykazovaly vysokou biokompatibilitu s normálními gliovými buňkami SVG p12, hPSC a buňkami odvozenými od hPSC (doplňkový obrázek 3d), což je v souladu s předchozím pozorováním, že inaktivované primární neutrofily nezabíjejí zdravé buňky16. Souhrnně CAR neutrofily odvozené od hPSC, zejména CAR neutrofily nesoucí CD3ζ, vykazovaly zvýšenou protinádorovou cytotoxicitu a produkovaly více ROS a TNF- in vitro, což zdůrazňuje jejich potenciál v cílené imunoterapii.

Obr. 1|Schéma zvýšené antiglioblastomové účinnosti pomocí kombinované imunoterapie CAR-neutrofilů a nanoléků reagujících na nádorové mikroprostředí. Lidské pluripotentní kmenové buňky byly upraveny pomocí CAR a diferencovány na CAR-neutrofily, které jsou naplněny hrubými nanočásticemi oxidu křemičitého (SiO2 NP) obsahujícími tirapazamin cílený na hypoxii (TPZ) nebo jinými léky, jako duální imunochemoterapie. b Systémově podávané CAR-neutrofil@R-SiO2- TPZ NP nejprve napadají vnější normoxické nádorové buňky vytvořením imunologických synapsí a zabíjejí nádorové buňky fagocytózou. Po apoptóze by CAR-neutrofily mohly uvolňovat R-SiO2-TPZ NP, které jsou překonány nádorovými buňkami. Poté nano-proléčiva reagují na hypoxické nádorové mikroprostředí a účinně zabíjejí nádorové buňky. TEOS tetraethylorthosilicate, BTES bis[3-(triethoxysilyl)propyl]tetrasulfid, TPZ tirapazamin, BTZ benzotriazinyl.

CAR-neutrofily si udržely vynikající protinádorové aktivity v imunosupresivních nádorových mikroprostředích

Podobně jako u makrofágů byly v imunosupresivním nádorovém mikroprostředí nalezeny protinádorové fenotypy N1 a pronádorové N2 neutrofilů asociovaných s nádorem17. Protumorové neutrofily N2 hrají kritickou roli v nádorové angiogenezi, metastázování a imunosupresi, ale terapeutické cílení tohoto typu buněk bylo náročné.

Spíše než strategii systémové deplece22 jsme zde hodnotili potenciál CAR-inženýrství při udržení protinádorového fenotypu neutrofilů. Neutrofily odvozené z CAR hPSC a PB byly ošetřeny hypoxií (3 % O2) a TGF, které přispívají k imunosupresi nádorového mikroprostředí37,38, aby se vyhodnotila jejich trvalá aktivita zabíjení nádorů. Zatímco PB neutrofily vykazovaly významně sníženou cytolýzu proti GBM buňkám za imunosupresivních podmínek, CAR-neutrofily si udržely vysoké aktivity zabíjení nádorů (doplňkový obr. 4a). Podobná pozorování byla také provedena při uvolňování TNF a generování ROS (doplňkový obr. 4b, c) z PB nebo CAR-neutrofilů za imunosupresivních a normálních podmínek. Abychom dále potvrdili fenotyp neutrofilů za hypoxických podmínek a podmínek TGF, měřili jsme expresi N1-specifické iNOS a N2-N2-specifické arginázy na izolovaných neutrofilech průtokovou cytometrií (doplňkový obr. 4d–f). Ve srovnání s normoxií, imunosupresivní hypoxií a TGF významně snížily hladiny exprese iNOS a zvýšily hladiny arginázy v neutrofilech PB, zatímco neutrofily CAR si udržely vysoké hladiny exprese iNOS. Předchozí studie naznačují, že aktivace signální dráhy Syk-Erk vede k produkci ROS39–42. Proto jsme detekovali a porovnali aktivaci Syk-Erk u nemodifikovaných neutrofilů a CAR-neutrofilů a naše výsledky naznačovaly významně vyšší aktivaci dráhy Syk-Erk u CAR-neutrofilů pod hypoxií (doplňkový obr. 5a–d), která může udržet nezměněná produkce ROS CAR-neutrofilů při hypoxii. Celkově vzato, CAR-neutrofily si udržely protinádorový fenotyp a udržely si vysoké protinádorové aktivity za podmínek napodobujících mikroprostředí nádoru in vitro, což zdůrazňuje jejich potenciál v cílené imunoterapii.

Obr. 2|Screening neutrofilně specifických struktur chimérického antigenního receptoru (CAR) se zvýšenými protinádorovými aktivitami zprostředkovanými neutrofily. a Schéma různých struktur CAR. b Schéma konstruktu CAR #1 a strategie cíleného knock-in v lokusu AAVS1 bezpečného přístavu lidských pluripotentních kmenových buněk (hPSC). Svislá šipka označuje AAVS1 cílenou sgRNA. Červené a modré horizontální šipky označují primery pro testování účinnosti cílení a homozygotnosti. HDR: homologní rekombinační oprava. c Schéma optimalizované diferenciace neutrofilů z hPSC za chemicky definovaných podmínek. d Testy cytotoxicity proti buňkám glioblastomu U87MG byly provedeny v různých poměrech cílových neutrofilů a nádorů za použití uvedených neutrofilů. Data jsou reprezentována jako průměr ± SD z pěti nezávislých biologických replikátů, dvoustranný Studentův t-test. Byla stanovena tvorba reaktivních forem kyslíku (ROS) (e) a ELISA analýza uvolňování TNF (f) z různých neutrofilů po společné kultivaci s buňkami U87MG. n=5 biologicky nezávislých vzorků. Data jsou reprezentována jako průměr ± SD, dvoustranný Studentův t-test. Zdrojová data jsou poskytována jako soubor zdrojových dat.

Příprava a charakterizace hPSC CAR-neutrofilů naplněných nanočásticemi SiO2 obsahujícími tirapazamin (TPZ)

Neutrofily PB byly použity jako buněčné nosiče k dodávání zobrazovacích a terapeutických léků do mozkových nádorů8–10, i když cílená infiltrace neutrofilů vyžaduje zánět vyvolaný operací nebo světlem a podávání léků mimo cíl může být problémem11. Pro další zlepšení protinádorových aktivit CAR-neutrofilů jsme připravili nanočástice oxidu křemičitého (SiO2-NP) s drsným nebo hladkým povrchem pro zavedení chemoterapeutických nebo radiačních léků do neutrofilů. Snímky z transmisního elektronového mikroskopu (TEM) ukázaly, že obě nanočástice SiO2 byly dobře rozptýlené a vykazovaly sférickou morfologii s jednotnou velikostí (obr. 3a, doplňkový obr. 6a). Analýza rozložení složení pomocí skenování TEM (STEM) s energeticky rozptýlenou rentgenovou spektroskopií (EDS) ukázala, že prvek síry (S) byl rovnoměrně distribuován v celých hrubých nanočásticích SiO2 (R-SiO2) (obr. 3b). Pomocí izoterm adsorpce-desorpce dusíku (N2) a odpovídající analýzy distribuce velikosti pórů byly změřeny velikosti pórů R- a SSiO2 NP jako 25 nm a 35 nm (obr. 3c, doplňkový obr. 6b). Vzhledem k velké ploše povrchu a velké velikosti pórů by terapeutická léčiva mohla být účinně zavedena do R- i S- SiO2 NP, jak je doloženo prolékem tirapazaminem (TPZ) reagujícím na hypoxii (obr. 3d, doplňkový obr. 6c) . Po zatížení TPZ nebyly pozorovány významné změny v disperzitě, morfologii a velikosti R-SiO2-TPZ pomocí TEM a analýzy dynamického rozptylu světla (doplňkový obrázek 6d, e). Tetrasulfidové vazby začleněné do R-SiO2 NP jsou citlivé na redukční prostředí a mohou být rychle degradovány velkým množstvím glutathionu (GSH) přítomným v nádorových buňkách43. Dále jsme stanovili degradabilitu R-SiO2–TPZ NP reagující na GSH v přítomnosti 10 mM, 1 mM a 10 μM GSH, které byly stejné jako intracelulární podmínky rakovinných buněk, normálních buněk a extracelulárního prostředí43. Po ošetření 10 mM GSH byla počáteční sférická struktura R-SiO2-TPZ NP vážně zničena po 24 hodinách (doplňkový obrázek 6f, g). Nanočástice se po 48 hodinách zcela rozpadly na malé úlomky, což vedlo k uvolnění TPZ způsobem reagujícím na GSH (obr. 3e). Zbytky R-SiO2 NP nezpůsobily žádnou významnou cytotoxicitu testovaným buňkám in vitro (doplňkový obr. 6h), což ukazuje na relativní bezpečnost R-SiO2 NP.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Dále jsme hodnotili proveditelnost použití SiO2–TPZ NP k zavedení terapeutických léků do CAR-neutrofilů jako kombinovanou chemoimunoterapii k dosažení zvýšené terapeutické účinnosti. Po centrifugaci jsme pomocí fluorescenčního mikroskopu a analýzy průtokovou cytometrií měřili buněčnou absorpci SiO2–TPZ NP neutrofily (obr. 3f, g) a detekovali jsme významnější buněčnou absorpci R-SiO2–TPZ NP než S-SiO2– NP TPZ neutrofily. Buněčný obsah Si v neutrofilech byl měřen jako 11,3 a 19,1 ng Si/ug proteinu pro hladký a drsný Si02 NPs@TPZ (obr. 3h), v tomto pořadí, hmotnostní spektrometrií s indukčně vázanou plazmou (ICP-MS). Vzhledem k jejich vysoké zatěžovací kapacitě v neutrofilech byly R-SiO2–TPZ NP použity pro následné experimenty. Poté jsme se snažili otestovat fyziologické funkce neutrofilů CAR po zatížení R-SiO2–TPZ NP. Nebyly pozorovány žádné změny v životaschopnosti buněk (obr. 3i, doplňkový obr. 6i), schopnosti transwell migrace (obr. 3j), chemotaxi a odpovídající rychlosti (obr. 3k, 1) CAR-neutrofilů před nebo po naložení R-SiO2 –TPZ NP, prokazující jejich vysokou biokompatibilitu. Byla také provedena časově závislá analýza zatížení nanoléčiva a maximálního obsahu zatížení bylo dosaženo 1 hodinu po inkubaci buněk-NP (doplňkový obrázek 7a). Více než 95 % CAR-neutrofilů bylo úspěšně naplněno R-SiO2–TPZ NP (doplňkový obr. 7b). Hladina exprese CD11b, povrchového proteinu neutrofilů, který zprostředkovává adhezi a migrační funkci po stimulaci zánětlivých molekul, se na CAR-neutrofily s nebo bez nanesení R-SiO2-TPZ nezměnila (doplňkový obrázek 7c, d). Superoxid nebo reaktivní formy kyslíku (ROS) se uvolňují z aktivních neutrofilů, aby zabíjely mikroby a nádorové buňky44. Jak se očekávalo, tvorba ROS CAR-neutrofily byla významně zvýšena po léčbě N-formylmethionin-leucyl-fenylalaninem (fMLP) a nebyly pozorovány významné rozdíly v produkci ROS CAR-neutrofily před a po naložení R-SiO2- TPZ (obr. 3m). Celkově naše data prokázala, že CAR-neutrofily naložené R-SiO{51}}TPZ si udržely fyziologické aktivity neutrofilů divokého typu a mohly aktivně migrovat směrem k zánětlivým stimulům, což zdůrazňuje jejich potenciál v cílené chemoimunoterapii rakoviny.

CAR-neutrofily naplněné nanočásticemi R-SiO2-TPZ účinně zabíjejí buňky glioblastomu

Dále jsme hodnotili účinek R-SiO2-TPZ na schopnost CAR-neutrofilů zabíjet nádory. Intimní interakce efektor-cíl byla předpokladem pro cytolýzu zprostředkovanou neutrofily. Jak se očekávalo, CAR-neutrofily@R-SiO2-TPZ vytvořily imunitní synapse s nádorovými buňkami během 2 hodin a vykazovaly podobná čísla interakcí efektor-cíl jako CAR-neutrofily bez léků (obr. 4a, doplňkový obr. 8) . Pozoruhodné je, že nebyly nalezeny žádné pozorovatelné interakce mezi CAR-neutrofily@RSiO2-TPZ a nerakovinnými somatickými buňkami (doplňkový obr. 8), což zdůrazňuje specifičnost CLTX-CAR proti mozkovým nádorům. Dále byly R-SiO2–TPZ NP uvolněny z neutrofilů do kultivačního média (doplňkový obr. 9a, b) 12 hodin po kokultivaci a vstoupily do zbývajících nádorových buněk (obr. 4a). Dvacet čtyři hodin po koinkubaci CAR-neutrofilů naložených SiO2–TPZ NP s nádorovými buňkami obsahovalo až 95 % nádorových buněk R-SiO2–TPZ NP (obr. 4a, doplňkový obr. 9c), což ukazuje na úspěšnou transportní kaskáda zahrnující nosné neutrofily, které uplatňují svou funkci efektorových buněk a podléhají apoptóze, čímž pasivně uvolňují R-SiO2–TPZ NP do cílových nádorových buněk45. Také jsme potvrdili hypoxickou responzivní funkci a cytotoxicitu proléčiva TPZ v nádorových buňkách pomocí elektronové paramagnetické rezonance (EPR) spektroskopické analýzy tvorby radikálů z TPZ (doplňkový obr. 9d) a průtokové cytometrické analýzy TOPRO-3 na nádoru buňky (doplňkový obr. 9e) při hypoxii a normoxii. Pro stanovení cytolýzy R-SiO2–TPZ NP-naplněných CAR neutrofilů jsme implementovali in vitro model znovuvyvolání nádoru normoxie-hypoxie (obr. 4b). Dvacet čtyři hodin po normoxické kokultivaci vykazovaly CAR-neutrofily naložené R-SiO2-TPZ NP nebo nevykazovaly podobnou protinádorovou cytotoxicitu (obr. 4c) a obě byly vyšší než u PB-neutrofilů naložených R -SiO2-TPZ NP nebo ne a R-SiO2- TPZ NP samotné. Zvýšená cytotoxicita je způsobena především zvýšenou schopností neutrofilů zacílit nádor po inženýrství CAR. Po dalších 12 a 24-h hypoxické kokultivaci s nádorovými buňkami vykazovaly CAR-neutrofily s R-SiO2-TPZ NP-naplněnými CAR-neutrofily lepší protinádorovou schopnost ve srovnání s jinými skupinami (obr. 4d, e). Navíc neutrofily CAR naložené R-SiO2-TPZ NP vykazovaly vynikající cytolýzu proti znovu nasazeným čerstvým nádorovým buňkám (obr. 4f), což ukazuje na protinádorovou schopnost uvolněného R-SiO2-TPZ nanočástice po apoptóze neutrofilů.

Poté jsme provedli analýzu sekvenování RNA (RNA-seq) na nádorových buňkách, abychom objasnili potenciální molekulární mechanismus, který je základem zesílené protinádorové cytolýzy neutrofilů expresí CAR a R-SiO2-TPZ NP. Analýza genové exprese prokázala, že ve srovnání s kontrolou a R-SiO2-TPZ NP, CAR-neutrofily naplněné R-SiO2-TPZ NP nebo bez nich významně snížily expresi cytoplazmových a membránových genů v nádorových buňkách ( Doplňkový obr. 10a, obr. 4g), dále podporuje jejich fagocytózu nádorových buněk po společné kultivaci. Zatímco všechny experimentální skupiny zvýšily buněčný oxidační stres v nádorových buňkách, R-SiO2-TPZ-naplněné CAR-neutrofily překonaly ostatní skupiny ve spouštění signalizace oxidačního stresu. Kromě toho CAR-neutrofily naložené R-SiO2-TPZ významně podporovaly apoptózu a snižovaly proliferaci v nádorových buňkách. Abychom dále porozuměli zvýšeným protinádorovým aktivitám R-SiO2-TPZ-naplněných CAR-neutrofilů, použili jsme inhibitor fagocytózy cytochalasin D a vychytávač reaktivních forem kyslíku (ROS) N-acetyl-cystein (NAC) a inhibitor ROS GSK2795039 do společné kultury nádor-neutrofil. Cytolýza nádorových buněk CAR-neutrofily byla významně snížena 5 μM cytochalasinem D, 5 mM NAC a 100 nM GSK2795039 (doplňkový obr. 10b, c), což ukazuje na prominentní roli fagocytózy a ROS v nádorových buňkách zprostředkovaných neutrofily CAR zabíjení. Zbývajících 40 %-50% lýzy nádorových buněk v přítomnosti neutrofilů a NAC nebo GSK2795039 ukazuje na zapojení mechanismu nezávislého na ROS v neutrofily zprostředkovaném zabíjení nádorů, což stojí za další zkoumání.

Obr. 3|Příprava a charakterizace hPSC CAR-neutrofilů naplněných nanočásticemi SiO2 obsahujícími tirapazamin (TPZ). a–e Jsou zobrazeny snímky elementárního mapování (b) hrubých nanočástic SiO2 z transmisního elektronového mikroskopu (TEM) (a) a energeticky disperzní spektroskopie (EDS). c Je znázorněna izoterma adsorpce-desorpce dusíku hrubých nanočástic SiO2 spolu s grafem distribuce velikosti pórů Barrett-JoynerHalenda (BJH). Biologické triplikáty byly provedeny nezávisle. Obsah zatížení TPZ v nanočásticích SiO2 (d) a glutathion (GSH)--responzivní uvolňování TPZ (e) byly měřeny v uvedeném čase. n=3 biologicky nezávislých vzorků. Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) pro (e). Fluorescenční snímky (f) a analýza průtokovou cytometrií (g) neutrofilů naplněných hladkým a drsným SiO2-TPZ. Biologické triplikáty byly provedeny nezávisle. h Byl měřen buněčný obsah SiO2 v CAR-neutrofilech odvozených z hPSC. n=5 biologicky nezávislých vzorků, dvoustranný Studentův t-test. Buněčná životaschopnost (i), n=3 biologicky nezávislých vzorků, transmigrace (j), n=5 biologicky nezávislých vzorků, schopnosti chemoatrakce (k, l), n=20 biologicky nezávislých vzorků a Byla prokázána schopnost generování ROS (m) CAR-neutrofilů odvozených z hPSC naložených hrubým SiO2-TPZ nebo bez něj, n=5 biologicky nezávislých vzorků, dvoustranný Studentův t-test. PMA: forbol myristát acetát. Všechna data na tomto obrázku jsou reprezentována jako průměr ± SD. Zdrojová data jsou poskytována jako soubor zdrojových dat.

Funkční hodnocení CAR-neutrofilů nabitých nano léčivy pomocí modelů biomimetického glioblastomu in vitro

Abychom dále vyhodnotili aktivity R-SiO2-TPZ NP-naplněných CAR-neutrofilů, implementovali jsme model nádoru hematoencefalické bariéry (BBB) ​​založený na transwell s použitím lidských cerebrálních mikrovaskulárních endoteliálních buněk (obr. 5a, doplňkový obr. 11a). Jak se očekávalo, R-SiO2-TPZ NP-naplněné CAR-neutrofily vykazovaly vynikající transmigrační schopnost napříč in vitro BBB modelem (obr. 5b), účinně zabíjející cílové nádorové buňky po transmigraci za normoxických i hypoxických podmínek (obr. 5c , d) a uvolňování více zánětlivých cytokinů (obr. 5e), které mohou přitahovat další efektorové buňky, aby zabily nádorové buňky. Kromě toho neutrofily CAR významně neovlivnily životaschopnost endoteliálních buněk po transmigraci (doplňkový obrázek 11b). R-SiO2-TPZ NP-naplněné CAR-neutrofily si zachovaly vynikající transmigrační schopnost během druhého transmigračního experimentu (obr. 5f) a vynikající protinádorovou schopnost ve srovnání s jinými skupinami (obr. 5g). Trojrozměrný (3D) model nádorových sféroidů byl poté použit k hodnocení penetrační kapacity nádoru R-SiO2-TPZ NP-naplněných CAR-neutrofilů (obr. 5h). CAR-neutrofily postupně migrovaly směrem do středu sféroidu tumoru a rovnoměrně distribuovaly ve sféroidu po 8 hodinách inkubace (obr. 5i). Byl pozorován vysoký stupeň společné lokalizace mezi CAR neutrofily a R-SiO2-TPZ NP (doplňkový obrázek 12a–c), což dokazuje, že R-SiO2-TPZ NP byly zapouzdřeny stabilně v CAR -neutrofily během infiltrace nádoru před jejich cytolýzou. Bez podávání zprostředkovaného neutrofily byly R-SiO2-TPZ NP nalezeny pouze na vnější vrstvě sféroidů nádoru. Ve srovnání s R-SiO2-TPZ NP a CAR-neutrofily vykazovaly R-SiO2-TPZ NP-naplněné CAR neutrofily lepší protinádorovou cytolýzu v 3D modelu nádoru (obr. 5j). CAR-neutrofily@R-SiO2 NP mohou být také použity k dodání jiných léků, včetně klinického temozolomidu (TMZ) a JNJ - 64619187, do 3D modelů nádorů a účinně zabíjet buňky GBM (doplňkový obrázek 12d–f). Celkově vzato, kombinační neutrofily CAR a nano léčiva vykazovaly vynikající protinádorové aktivity v podmínkách napodobujících biomimetické mikroprostředí nádoru in vitro, což zvýrazňuje terapeutický potenciál chemoimunoterapie na bázi kombinované neutrofily.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

In vivo distribuce CAR neutrofilů dodaných R-SiO2-TPZ nanočástic

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20 % podaných nanoléčiv bylo dodáno do mozkových nádorů CAR-neutrofily ve srovnání s 1 % volnými nanoléčivy, což je v souladu s předchozími zprávami6. Cílené dodání R-SiO2-TPZ NP do hostitelského mozku přes BBB pomocí CAR-neutrofilů bylo také potvrzeno histologickou analýzou (obr. 6d). Naopak, samotné R-SiO2-TPZ NP se hromadily hlavně v játrech a slezině. Naše data společně prokázala vylepšené cílené dodávání R-SiO2-TPZ NP neutrofily CAR bez nutnosti indukovat další zánět v místě nádoru, což zdůrazňuje proveditelnost a bezpečnost chemoimunoterapie založené na neutrofilech při léčbě rakoviny.

Kombinovaná chemoimunoterapie CAR-neutrofilů a nanočástic R-SiO2-TPZ vykazovala vynikající antiglioblastomové aktivity in vivo

Pro stanovení terapeutické účinnosti R-SiO2-TPZ NP-naplněných CAR neutrofilů byl založen in situ xenograftový model glioblastomu u NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) myší pomocí luciferázových buněk exprimujících U87MG. Myším s nádorem bylo intravenózně podáváno 5 x 106 neutrofilů týdně (obr. 7a) a byla měřena a kvantifikována nádorová zátěž u hostitelů (obr. 7b, c). Ve srovnání s myšmi léčenými PBS nebo PB-neutrofily léčba CAR-neutrofily a CAR neutrofil@R-SiO2-TPZ NP účinně zpomalila růst nádoru. CAR neutrofily@R-SiO2–TPZ NP vykazovaly mnohem vyšší protinádorovou cytotoxicitu než kterékoli jiné experimentální skupiny. Naopak, PB-neutrofily významně podporovaly růst nádoru v mozku, což mělo za následek smrt myší s nádorem již 23. den (obr. 7d), což naznačuje, že neutrofily bez inženýrství mohou představovat další rizika. Dále jsme měřili uvolňování lidského cytokinu v plazmě různých experimentálních skupin myší (obr. 7e). Všechny experimentální skupiny bez PBS produkovaly detekovatelný TNF a IL-6 v plazmě od 5. do 26. dne, což naznačuje aktivaci lidských neutrofilů po stimulaci nádoru. V souladu s pozorovanou vyšší rychlostí růstu nádoru nemodifikované neutrofily postupně uvolňovaly více IL-6 a TNF, což může u pacientů vést k syndromu uvolnění cytokinů a vyžadovat podrobnější bezpečnostní studie s blokátory IL-646,47 . Je pozoruhodné, že CAR-neutrofily@RSiO2-TPZ NP vykazovaly sníženou schopnost produkce cytokinů v pozdějších časových bodech (den 19 a den 26), což naznačuje potenciálně nízké riziko syndromu uvolnění cytokinů u pacientů léčených chemoimunoterapií založenou na CAR-neutrofily. Biokompatibilita kombinačních CAR-neutrofilů a R-SiO2-TPZ NP byla hodnocena prostřednictvím týdenního měření tělesné hmotnosti a sledováním patologických změn v hlavních orgánech myší. Nebyl pozorován žádný rozdíl v tělesných hmotnostech mezi CAR neutrofily@R-SiO2–TPZ NP léčenými myšmi a jakýmikoli jinými experimentálními skupinami (obr. 7f), což ukazuje na minimální systémovou toxicitu a vynikající biokompatibilitu CAR-neutrofilů @ R-SiO2–TPZ NP v rámci 28 dní léčby. Histologická analýza hlavních orgánů odebraných myším v den 30 ukázala, že myši ošetřené CAR-neutrofily@R-SiO2-TPZ NP nezpůsobily znatelné abnormality nebo poškození orgánů v srdci, játrech, slezině, plicích a ledvinách (doplňkový obr. 13), což dále potvrzuje bezpečnost kombinačních CAR-neutrofilů a R-SiO2-TPZ NP.

Obr. 4|CAR-neutrofily naplněné nanočásticemi R-SiO2-TPZ účinně zabíjejí buňky glioblastomu. Byly ukázány reprezentativní obrazy imunologických synapsí indikované polarizovanou akumulací F-aktinu na rozhraní mezi CAR-neutrofily a nádorovými buňkami po 6, 12 a 24 hodinách. Nanočástice R-SiO2-TPZ uvolněné z CAR-neutrofilů po fagocytóze nádorových buněk byly pohlceny nádorovými buňkami. Triplikáty byly provedeny nezávisle. b Schéma testu protinádorové cytotoxicity zprostředkované neutrofily. Cytotoxicita proti buňkám glioblastomu U87MG byla prováděna v různých poměrech neutrofilů k cíli nádoru s použitím uvedených neutrofilů ve 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e) a 72 h (f). n=3 biologicky nezávislých vzorků. Data jsou reprezentována jako průměr ± SD, jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA). g Analýza hromadného sekvenování RNA byla provedena na buňkách U87MG za různých podmínek. Heatmap ukazuje úrovně exprese vybrané cytoplazmy, membrány, oxidačního stresu, apoptózy a genů souvisejících s proliferací v uvedených glioblastomových buňkách. n=2 biologicky nezávislých vzorků. Zdrojová data jsou poskytována jako soubor zdrojových dat.

Obr. 5|Funkční hodnocení CAR-neutrofilů naložených nanočásticemi R-SiO2-TPZ pomocí modelů biomimetického glioblastomu (GBM) in vitro. Schéma našeho in vitro modelu nádoru GBM s hematoencefalickou bariérou (BBB), který se skládá z endoteliálních buněk na membráně buněčné inzerce a nádorových buněk na dně stejné transwell. b Je ukázána analýza migrace neutrofilů mezi jamkami po 12 hodinách. Anti-GBM cytotoxicita indikovaných neutrofilů po 24 h (c) a 36 h (d) byla měřena a kvantifikována. Byla provedena ELISA analýza IL{10}} a TNF uvolněných z uvedených neutrofilů po 36 hodinách. f Je ukázána druhá migrace různých neutrofilů po 48 hodinách. g Anti-GBM cytotoxicita indikovaných neutrofilů po 60 hodinách byla měřena a kvantifikována. h–j Schéma trojrozměrného (3D) modelu nádoru in vitro infiltrovaného neutrofily bylo ukázáno v (h). Byly ukázány reprezentativní fluorescenční obrazy infiltrovaných neutrofilů v 3D modelech nádorů. DAPI bylo použito k barvení buněčného jádra a CD45 bylo použito k barvení neutrofilů. Měřítko, 200 μm. Biologické triplikáty byly provedeny nezávisle. j Odpovídající schopnost indikovaných neutrofilů zabíjet nádor byla měřena a kvantifikována pomocí cytotoxického kitu. Data jsou reprezentována jako průměr ± SD z pěti nezávislých biologických replikátů, jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA). Zdrojová data jsou poskytována jako soubor zdrojových dat.

Zatímco CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ NP významně zpomalily růst nádoru u myší s xenoimplantátem, rozdíl v přežití zvířat v experimentálních skupinách CAR-neutrofilů, SiO2-TPZ NP a CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ NP je nevýznamný (p > 0.05), což je pravděpodobně způsobeno smrtí krátkodobých neutrofilů během přípravy buněk a injekce. Dále jsme se zaměřili na tyto tři skupiny a určili, zda by zkrácení doby přípravy buněk a zvýšené dávky CAR-neutrofilů a nano léků způsobily nějaký rozdíl v přežití zvířat (obr. 7g). Při systémovém podání 6krát překonaly NP CAR-neutrofil@R-SiO2–TPZ ostatní dvě skupiny v prodloužení života myší s nádorem (obr. 7h), zatímco rozdíl v přežití zvířat ve skupinách CAR-neutrofilů a SiO2– NP TPZ zůstaly bezvýznamné. Zatímco mezi těmito dvěma nezávislými studiemi na zvířatech byla pozorována podobná křivka přežití u skupiny R-SiO2- TPZ, zkrácená doba izolace buněk a přípravy na injekci z celkových ~4 hodin na 1 hodinu během prvních 4 neutrofilů dávky vedly ke zlepšení přežití zvířat ve skupinách CAR-neutrofily před 32. dnem. Naše data souhrnně prokázala důležitost přípravy neutrofilů a optimalizace dávkování v budoucích klinických aplikacích neutrofilních terapeutik.

Diskuse

U myších neutrofilů bylo prokázáno, že jsou silným přenašečem, který účinně dodává nanoléčiva do zanícených pooperačních mozkových nádorů8,9. Proveditelnost a bezpečnost použití lidských neutrofilů při dodávání léčiv však stále zůstává nepolapitelná. Velké množství myších neutrofilů (10krát vyšší než celkový počet cirkulujících neutrofilů u myší11) použité v těchto studiích k dosažení terapeutického přínosu může dále bránit jejich klinické translaci, protože extrakce velkého počtu neutrofilů od pacientů s rakovinou může vést k neutropenii a představovat jiná rizika. K řešení těchto problémů jsme využili sílu samoobnovujících se hPSC při získávání neomezených de novo lidských neutrofilů29. Vyvinuli jsme výkonný bioinspirovaný neutrofily zprostředkovaný systém dodávání léků pomocí CAR-inženýrství29 a použili jsme upravené lidské CAR-neutrofily jako nanonosiče s výraznými protinádorovými aktivitami. Hrubé SiO2 NP fungují lépe než hladké SiO2 NP u nosičů neutrofilů CAR, což je v souladu s předchozími pozorováními, že neutrofily přednostně fagocytují hrubé mikrobiální patogeny30. Uvádí se, že neutrofily podporují proliferaci a progresi gliomových buněk48. V naší studii na zvířatech jsme pozorovali podobný protumorový účinek nemodifikovaných neutrofilů, což zdůrazňuje nutnost inženýrství CCAR nebo jiných modifikací neutrofilů, aby byla zajištěna jejich bezpečnost při dodávání léčiv a dalších terapeutických aplikacích. Je pozoruhodné, že naše CAR-neutrofily zprostředkované dodávání léků závisí pouze na nativní chemo-atraktantní schopnosti GBM, ale ne na zesílených pooperačních zánětlivých signálech, což naznačuje vysokou specificitu a terapeutický potenciál našeho systému podávání léků při eradikaci hluboce infiltrovaných gliomů. které nelze chirurgicky odstranit. Vzhledem k tomu, že chirurgická resekce a adjuvantní chemoterapie/radioterapie jsou primárními klinickými intervencemi pro GBM12, může kombinovaná léčba neutrofilními nanonosiči CAR a chirurgie/radioterapie dosáhnout optimální terapeutické účinnosti a stojí za další zkoumání. Konstrukty CAR specifické pro T a NK buňky byly široce používány ke zvýšení protinádorových aktivit T a NK buněk, ale CAR specifické pro neutrofily, které zlepšují protinádorové funkce neutrofilů, nebyly popsány. CD4ζ a CD4 chimérické imunitní receptory byly dříve popsány pro zvýšení cytolýzy neutrofilů proti buňkám transfekovaným HIVenv in vitro. Přesto byla účinnost lýzy pouze ~10 % při poměru efektor-cíl (E:T) 10:128. Fc RIIA (CD32a) je nízkoafinitní jednořetězcový transmembránový receptor pro monomerní IgG, který je vysoce exprimován v neutrofilech (30,000 až 60,000 molekul/buňka31) a jeho ligace indukuje Fc - závislé funkce v neutrofilech, jako je uvolňování obsahu granulí, mobilizace Ca2+, protinádorová cytotoxicita a fagocytóza49. Vzhledem k prominentní úloze CD32a v aktivaci a funkci neutrofilů jsme navrhli a otestovali konstrukty CAR založené na CD32a. Naše výsledky však ukázaly, že CD3ζ zprostředkovává významně lepší cytolýzu než CD32a, když je exprimován v neutrofilech odvozených od hPSC, což může být částečně způsobeno vyššími kopiemi ITAM v CD3ζ než CD32a: tři a jedna kopie a vyšší hladiny exprese ζ než na buněčném povrchu neutrofilů28. Stejně jako CD32a je Fc RIII (CD16b) dalším nízkoafinitním receptorem pro monomerní IgG a je exprimován na mnohem vyšší úrovni než CD32a na neutrofilech31. I když zesíťování CD16b indukuje pouze mobilizaci a degranulaci Ca2+, ale ne fagocytózu a cytolýzu v neutrofilech28,50, v budoucích studiích bude stále zajímavé provést systematické srovnání schopností CD3ζ- a CD16b -CAR při spouštění a posilování protinádorových funkcí neutrofilů.

Obr. 6|In vivo distribuce CAR neutrofilů dodaných R-SiO2-TPZ nanočástic (NP). Schéma intravenózně podaných Cy5- značených CAR neutrofil@R-SiO2 NP a R-SiO2 NP pro in vivo studii sledování buněk. 5 x 105 buněk U87MG exprimujících luciferázu (Luci) bylo stereotakticky implantováno do pravého předního mozku myší NRG. Po 4 dnech byly myši intravenózně ošetřeny PBS, 5 x 106 Cy5-značenými CAR neutrofily@R-SiO2 NP a R-SiO2 NP. b Časově závislá biologická distribuce Cy5+ neutrofilů v celém těle, mozku a dalších orgánech byla stanovena a kvantifikována fluorescenčním zobrazením v uvedených hodinách. c Biodistribuce CAR neutrofilů @ R-SiO2 NP a R-SiO2 NP u myší 24 hodin po injekci byla analyzována pomocí indukčně vázané plazmové optické emisní spektrometrie (ICP-OES) na bázi Si prvku a data byla vyjádřena jako procento injikované dávky na gram tkáně (%ID/g). n=5 biologicky nezávislých vzorků. Data jsou uvedena jako průměr ± SD. Zdrojová data jsou poskytována jako soubor zdrojových dat. d Byly ukázány reprezentativní fluorescenční obrazy CD45 a Si02 v uvedených xenoštěpech glioblastomu izolovaných z myší nesoucích nádor. Měřítko, 100 μm. Biologické triplikáty byly provedeny nezávisle.

Obr. 7|In vivo protinádorové aktivity kombinačních CAR-neutrofilů a R-SiO2-TPZ nanočástic (NP) byly hodnoceny pomocí intravenózní injekce. Schéma intravenózně podaných PBS, PB-neutrofilů, CAR-neutrofilů a CAR-neutrofil@ R-SiO2-TPZ NP pro in vivo studii usmrcování nádorů. 5 x 105 buněk U87MG exprimujících luciferázu (Luci) bylo stereotakticky implantováno do pravého předního mozku myší NRG. Po 4 dnech byly myši intravenózně léčeny uvedenými neutrofily týdně po dobu jednoho měsíce. Časově závislá nádorová zátěž byla stanovena (b) a kvantifikována (c) bioluminiscenčním zobrazením (BLI) v uvedených dnech. Data jsou průměr ± SD pro myši v (b) (n=5), jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA). d Byla ukázána Kaplan-Meierova křivka demonstrující přežití uvedených experimentálních skupin (n=5). Uvolněný lidský tumor nekrotizující faktor- (TNF) a IL-6 v periferní krvi (e) a tělesná hmotnost (f) různých myších skupin byly měřeny v uvedených dnech. Data jsou průměr ± SD, n=5 biologicky nezávislých vzorků. g, h Byla hodnocena protinádorová aktivita zvýšených frekvencí dávkování CAR-neutrofilů a RSiO2-TPZ NP. g Schéma intravenózně podaných CAR-neutrofilů, R-SiO2-TPZ NP a CAR-neutrofil@ R-SiO2-TPZ NP pro studii usmrcování nádorů in vivo. h Byla ukázána Kaplan-Meierova křivka demonstrující přežití uvedených experimentálních skupin (n=5). Kaplan-Meierovy křivky byly analyzovány log-rank testem. Zdrojová data jsou poskytována jako soubor zdrojových dat.

Také jsme zde představili modulární a všestrannou platformu pro podávání neutrofilních léků hPSC, která může být v budoucnu přepracována a vyladěna tak, aby podporovala další úsilí založené na neutrofilech při léčbě jiných lidských onemocnění. Za prvé, CAR inženýrství je dostupnější v hPSC než v primárních imunitních T buňkách a neutrofilech. Vyžaduje pouze jednorázovou úpravu genomu k dosažení stabilní a homogenní exprese různých CAR29. Kromě CLTX CAR jsme také zkonstruovali stabilní hPSC linie, které exprimují univerzální anti-fluorescein (FITC)51 nebo anti-PD-L1 CAR52, přičemž oba by mohly být využity k získání univerzálních nanonosičů CAR-neutrofilů cílených na pevný nádor. Jiné genetické modifikace, jako je fibróza zacílená na anti-FAP CAR53, mohou být také prováděny k nasměrování neutrofilních nanonosičů k léčbě fatálních degenerativních onemocnění, včetně mozkového traumatu a srdeční fibrózy. Kromě toho by hPSC exprimující CAR mohly být také snadno přizpůsobeny k produkci CAR-T nebo CAR-NK buněk29 a kombinace těchto imunoterapií s CAR-neutrofilními nanonosiči mohou dosáhnout optimálních terapeutických protinádorových přínosů. A konečně, náš bioinspirovaný systém nanoléků reagující na nádorový glutathion (GSH) je modulární a všestranná platforma pro zavedení slibných chemoterapeutických nebo radioaktivních léků do CAR-neutrofilů pro cílené dodávání léků, jak dokládají klinické TMZ, JNJ64619187 a proléčivo TPZ. Budoucí studie testování jiných nanočástic mohou přinést optimalizované zatížení léčivem v neutrofilech a dosáhnout maximální terapeutické účinnosti in vivo.

I když jsme demonstrovali terapeutický koncept použití CAR-neutrofilů ke specifickému a účinnému dodávání chemoléků do mozkových nádorů přes BBB, v této studii existuje několik omezení. Za prvé, 4-denní inokulace nádorových buněk nemusí být dostatečná k vytvoření nádorů, které napodobují klinický scénář pro terapeutické vyšetření, a budoucí práce s různými obdobími inokulace nádorů je nezbytná k rekapitulaci různých fází vývoje glioblastomu a terapeutické odpovědi v různých pacientů 54,55. Za druhé, imunodeficientní myši, které jsme zde použili, postrádají adaptivní imunitu a pro lepší posouzení bezpečnosti a účinnosti CAR-neutrofilů produkovaných in vitro jsou zapotřebí další preklinické modely s neporušeným imunitním systémem, jako jsou psi v zájmovém chovu se spontánním gliomem56. I přes krátkou životnost je zapotřebí zejména profilování toxicity CAR-neutrofilů mimo cíl s naložením nanoléků nebo bez nich u zvířat, kterým byla podána infuze, včetně syndromu uvolnění cytokinů, neurotoxicity a mimonádorové toxicity pozorované u CAR-T buněk57. neutrofilů. Zatímco proveditelné přístupy, jako je inženýrství hypoimunogenních univerzálních dárců hPSC58–61 a bankovnictví lidských leukocytárních antigenů (HLA)-homozygotních knihoven hPSC62, jsou snadno dostupné, aby se zabránilo potenciálnímu riziku reakce štěpu proti hostiteli (GvHD), preklinické zvířecí modely s k posouzení translačního potenciálu našich neutrofilních terapeutik je stále zapotřebí intaktní imunitní systém. Nakonec byla pozorována omezená protinádorová cytotoxicita a prodloužení životnosti CAR-neutrofilních nanoléčiv u zvířat. Proto je pro dosažení maximální protinádorové účinnosti CAR-neutrofilních terapeutik nezbytné budoucí zkoumání účinnějších chemoterapeutických léků nebo radiosenzibilizátorů a kombinačních terapií s klasickou CAR-T a chirurgickou resekcí. Například nedávná studie o designu založeném na mechanismu vedla k účinnějšímu léku KL-50, který překonává získanou rezistenci, jak bylo pozorováno u klinického léku TMZ63, a lze jej tak začlenit do naší modulární platformy CAR-neutrofilních nanoléčiv pro potenciálně lepší terapeutickou účinnost. Prodloužení doby použitelnosti neutrofilů na 5 dní prostřednictvím léčby CLON-G (kaspázy-lysozomální membránová permeabilizace-oxidant-inhibice nekroptózy plus faktor stimulující kolonie granulocytů64) a/nebo použití dlouhodobějšího systému řízeného uvolňování léčiva u CAR-neutrofilů může také dosáhnout trvalé in vivo protinádorové účinnosti po apoptóze neutrofilů. Souhrnně naše zjištění jasně prokázala, že CAR-neutrofily naložené R-SiO2-TPZ by mohly udržet protinádorový fenotyp N1 a účinně zabíjet nádorové buňky za různých podmínek podobných nádoru in vitro. Funkční CAR-neutrofily by také mohly být produkovány ve velkých množstvích z upravených hPSC, aby přesně dodávaly nanoléky reagující na nádorové mikroprostředí k cílení GBM in vivo, což vede ke kombinované chemoimunoterapii s robustními a specifickými anti-GBM aktivitami a minimálním dodáváním léků mimo cíl. prodloužená životnost u myší s nádory.

Reference

1. Yang F. a kol. Synergická imunoterapie glioblastomu duálním cílením IL-6 a CD40. Nat. Commun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Současný stav imunoterapie glioblastomu. Nat. Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. a kol. Intratumorální podávání IL-12 posiluje imunoterapii CAR-T buňkami v preklinickém modelu glioblastomu. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrofily jako nové terapeutické cíle. Nat. Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrofily jako nový terapeutický cíl a nástroj pro léčbu rakoviny. Life Sci. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Metaanalýza dodávání nanočástic do nádorů pomocí fyziologicky založeného farmakokinetického modelování a simulačního přístupu. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. a kol. Analýza dodávání nanočástic do nádorů. Nat. Rev. Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. a kol. Neutrofily zprostředkované podávání protirakovinných léků pro potlačení recidivy pooperačního maligního gliomu. Nat. Nanotechnologie. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. a kol. MR zobrazování sledování zánětem aktivovatelných umělých neutrofilů pro cílenou terapii chirurgicky léčeného gliomu. Nat. Commun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Fotosenzibilizační priming nádorových mikroprostředí zlepšuje dodávání nanoterapeutik prostřednictvím infiltrace neutrofilů. Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Terapie rakoviny: Neutrofilní doprava v nanoléčivách rakoviny. Nat. Nanotechnologie. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Role neutrofilů u gliomu a mozkových metastáz. Přední. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. a kol. Polarizace fenotypu neutrofilů spojených s nádorem pomocí TGF-beta: "N1" versus "N2" TAN. Rakovinová buňka (2009).

14. Blaisdell, A. a kol. Neutrofily brání karcinogenezi děložního epitelu prostřednictvím debridementu hypoxických nádorových buněk. Cancer Cell 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. a kol. Úleva od hypoxie tumoru uvolňuje tumoricidní potenciál neutrofilů. J. Clin. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. a kol. Lidské polymorfonukleární neutrofily specificky rozpoznávají a zabíjejí rakovinné buňky. Onkoimunologie 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. a kol. Diverzita a plasticita neutrofilů v progresi a terapii nádoru. Nat. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).

18. Li X. a kol. Pokrok ve výzkumu kmenových buněk gliomu v imunitním mikroprostředí gliomu. Přední. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Immune microenvironment of gliomas. Laboratoř. Vyšetřování. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. a kol. Plasticita, heterogenita a rezistence nádorových buněk v klíčových mikroprostředích gliomu. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP a kol. Vznikající imunoterapie maligního gliomu: Od imunogenomiky k buněčné terapii. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP a kol. Neutrofily indukovaná ferroptóza podporuje nádorovou nekrózu při progresi glioblastomu. Nat. Commun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY a kol. Fenotypová diverzita a plasticita v subpopulacích cirkulujících neutrofilů u rakoviny. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Lidské přirozené zabíječské buňky odvozené od iPSC upravené s chimérickými antigenními receptory zvyšují protinádorovou aktivitu. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB a kol. Vysoce afinitní mutantní interleukin-13 cílené CAR T buňky zesilují dodávání klikatelných biodegradovatelných fluorescenčních nanočástic do glioblastomu. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. a kol. Nový systém dodávání ligandu pro neinvazivní vizualizaci a terapeutické využití nádorově omezeného biomarkeru IL13R 2. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. a kol. CAR T buňky řízené chlorotoxinem pro specifické a účinné cílení glioblastomu. Sci. Přel. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR a kol. Antigen-specifická cytolýza neutrofily a NK buňkami exprimujícími chimérické imunitní receptory nesoucí zeta nebo gama signální domény. J. Immunol. 161, 375-384 (1998).

29. Chang, Y. a kol. Konstrukce neutrofilů chimérického antigenního receptoru z lidských pluripotentních kmenových buněk pro cílenou imunoterapii rakoviny. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. a kol. Neutrofily přednostně fagocytují prodloužené částice příležitost k selektivnímu zacílení u akutních zánětlivých onemocnění. Sci. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Exprese, role a regulace neutrofilních Fc receptorů. Přední. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. a kol. Význam tyrosinů Fc receptorového řetězce ITAM při aktivaci neutrofilů a in vivo autoimunitní artritidě. Přední. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Role polymorfních forem neutrofilních Fc RIIa (CD32) a Fc RIIIb (CD16) ve fagocytóze lidských IgG1- a IgG3-opsonizovaných bakterií a erytrocytů. Transfus. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Lidské neutrofilní Fc receptory iniciují a hrají specializované neredundantní role u zánětlivých onemocnění zprostředkovaných protilátkami. Imunita. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. a kol. Chemicky definovaná generace lidského hemogenního endotelu a definitivních hematopoetických progenitorových buněk. Biomateriály 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS a kol. Efektivní a rychlé generování funkčních neutrofilů z indukovaných pluripotentních kmenových buněk pomocí ETV2-modifikované mRNA. Stem Cell Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. a kol. Role hypoxie v mikroprostředí nádoru a vývoj nádorových kmenových buněk: nový přístup k vývoji léčby. Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. a kol. Vliv hypoxického nádorového mikroprostředí a plasticity nádorových buněk na expresi imunitních kontrolních bodů. Cancer Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Role protein-tyrosin kinázy Syk v signalizaci oxidativního stresu v B buňkách. Antioxidanty Redox Signal. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. a kol. ROS a ROS-zprostředkovaná celulární signalizace. Oxidat. Med. Buňka. Dlouhověkost. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. a kol. Aktivační dráha Ras závislá na Syk fosforylaci proteinkinázy C. Proč. Natl. Akad. Sci. USA. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ Tyrosinkináza SYK: Rozhodující hráč v různých biologických funkcích. Nat. Rev. Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. a kol. Nanokompozit reagující na nádorové mikroprostředí pro plynný sirovodík a dynamickou enzymatickou terapii s vylepšeným trimodálním účinkem. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrofily k ROScue: Mechanismy aktivace NADPH oxidázy a bakteriální rezistence. Přední. Buňka. Infikovat. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. a kol. Neutrofily umožňují lokální a neinvazivní podávání lipozomů do zaníceného kosterního svalu a ischemického srdce. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ a kol. Souhrn schválení FDA: tocilizumab k léčbě těžkého nebo život ohrožujícího syndromu uvolnění cytokinů vyvolaného chimérickým antigenním receptorem T lymfocytů. Onkolog 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Syndrom uvolňování cytokinů a související neurotoxicita v imunoterapii rakoviny. Nat. Rev. Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. a kol. Neutrofily podporují fenotyp maligního gliomu prostřednictvím S100A4. Clin. Cancer Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. a kol. Buněčně specifická, aktivace závislá regulace funkce vazby ligandu neutrofilu CD32A. Krev https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Cytotoxicita zprostředkovaná lidskými Fc receptory pro IgG. Immunol. Dnes. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG a kol. Regulace toxicity podobné syndromu uvolňování cytokinů zprostředkované CAR T buňkami pomocí adaptérů s nízkou molekulovou hmotností. Nat. Commun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. a kol. Nový chimérický antigenní receptor obsahující signální doménu JAK-STAT zprostředkovává vynikající protinádorové účinky. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. a kol. Cílení na srdeční fibrózu pomocí upravených T buněk. Příroda. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. a kol. ErbB2/HER2-specifické NK buňky pro cílenou terapii glioblastomu. J. Natl. Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. a kol. CAR T buňky pro mozkové nádory: Poučení a cesta vpřed. Immunol. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB a kol. Údaje o bezpečnosti a prozatímním přežití po intrakraniálním podání M032, geneticky upraveného onkolytika HSV-1 exprimujícího IL-12, u psů v zájmovém chovu se sporadickými gliomy. Neurosurg. Zaostřeno 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Nedávné pokroky a objevy v mechanismech a funkcích CAR T buněk. Nat. Rev. Cancer 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. a kol. Generování hypoimunogenních T buněk z geneticky upravených alogenních lidských indukovaných pluripotentních kmenových buněk. Nat. Biomed. Ing. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. a kol. Hypoimunogenní deriváty indukovaných pluripotentních kmenových buněk se vyhýbají imunitní rejekci u plně imunokompetentních alogenních příjemců. Nat. Biotechnol. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. a kol. Generování hypoimunogenních lidských pluripotentních kmenových buněk. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW a kol. Editace genomu HLA DR pomocí TALEN v lidských iPSC produkovala imunotolerantní dendritické buňky. Stem Cells Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. a kol. Shoda MHC zlepšuje přihojení neuronů odvozených od iPSC u primátů kromě člověka. Nat. Commun. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. a kol. Návrh látek založený na mechanismu, které se selektivně zaměřují na lékově rezistentní gliom. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. a kol. Zacílení na více cest buněčné smrti prodlužuje skladovatelnost a zachovává funkci lidských a myších neutrofilů pro transfuzi. Sci. Přel. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. a kol. Fluorescenční indikátory pro kontinuální a liniově specifické hlášení fází buněčného cyklu v lidských pluripotentních kmenových buňkách. Biotechnol. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. a kol. Chemicky definovaná generace lidských definitivních hematopoetických kmenových a progenitorových buněk. STAR Protoc. 4, 101953 (2023).