Krátká inhalace sevofluranu může snížit tvorbu gliálních jizev po hypoxicko-ischemickém poranění mozku u novorozených potkanů, část 1

Abstraktní

Předchozí studie ukázaly, že postkondicionování sevofluranem může poskytnout neuroprotekci po hypoxicko-ischemickém poškození a zlepšit funkci učení a paměti u vyvíjejících se mozků hlodavců.

Hypoxicko-ischemické poškození označuje patologický stav způsobený cerebrální ischemií, hypoxií, metabolickou poruchou a poškozením nervových buněk v důsledku poruch kardiovaskulárního a cerebrovaskulárního systému. Se sociálním pokrokem a změnami životního stylu se hypoxicko-ischemické poškození stává stále častějším. Tento stav může způsobit mnoho poškození lidského zdraví, včetně ovlivnění inteligence a paměti.

Přestože hypoxie a ischemie mohou způsobit pokles mozkových funkcí, neznamená to, že bude negativně ovlivněna paměť. Správnými metodami můžeme naopak zlepšit paměť a zvýšit výkonnost mozku. Zde je několik způsobů, jak zlepšit paměť:

1. Zdravá strava: Vliv stravy na paměť je velmi důležitý. Potraviny bohaté na bílkoviny, vitamíny a minerály mohou pomoci udržet zdravý nervový systém a funkce myšlení.

2. Více cvičte: Fyzické cvičení může podpořit krevní oběh, zvýšit průtok kyslíku, posílit imunitu těla a snížit riziko onemocnění. Cvičením můžete zlepšit svou paměť.

3. Posilujte sebevědomí: Důvěra je důležitým faktorem v paměti člověka. Pokud věříte, že určitý úkol zvládnete, snadno dosáhnete požadovaných výsledků a navíc si můžete efektivně zlepšit paměť.

Je vidět, že hypoxicko-ischemické poškození není stav, který nevyhnutelně poškodí lidskou paměť. Pokud ovládáme správné metody a dobře se staráme o svůj mozek, můžeme přijmout zdravou budoucnost s pozitivním přístupem. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola je tradiční čínský léčivý materiál, který má mnoho jedinečných účinků, jedním z nich je zlepšení paměti. Účinnost Cistanche deserticola pochází z mnoha aktivních složek, které obsahuje, včetně kyseliny tříslové, polysacharidů, flavonoidních glykosidů atd. Tyto složky mohou podporovat zdraví mozku různými cestami.

Klikněte na 10 způsobů, jak zlepšit paměť

Klasický model Rice-Vannucci byl použit k vyvolání hypoxického ischemického poškození a novorozené (postnatální den 7) potkanů ​​byly ošetřeny 2,4% sevofluranem po dobu 30 minut po hypoxicko-ischemickém poškození.

Naše výsledky ukázaly, že postkondicionování sevofluranem významně zlepšilo funkci učení a paměti krys, snížilo astrogliózu a tvorbu glialscarů, zvýšilo počet dendritických trnů a chránilo histomorfologii hipokampu. Mechanicky postkondicionování sevofluranem snížilo expresi von Hippel-Lindau faktoru indukovaného hypoxií-1 a zvýšilo expresi DJ-1.

Injekce 1,52 ug inhibitoru hypoxií indukovatelného faktoru-1 YC-1 (Lificiguat) do levé postranní komory 30 minut před hypoxicko-ischemickým poraněním zvrátila neuroprotekci vyvolanou sevofluranem. Toto zjištění naznačuje, že sevofluran může účinně zmírnit astrogliózu v hippocampu a snížit poruchy učení a paměti způsobené tvorbou gliálních jizev po hypoxicko-ischemickém poškození.

Základní mechanismus může souviset s upregulovanou DJ-1 expresí, sníženou ubikvitinací hypoxií indukovatelného faktoru-1 a stabilizovanou hypoxií indukovatelnou expresí-1. Tato studie byla schválena Výborem pro péči o laboratorní zvířata Čínské lékařské univerzity v Číně (č. schválení 2016PS337K) dne 9. listopadu 2016.

Klíčová slova: poranění mozku; mozek; centrální nervový systém; in vivo; zranění; Modelka; plasticita; krysa; zotavení; regenerace; repairChinese Library Classification No. R453; R741; R614.2+1.

Úvod

Novorozenecká hypoxicko-ischemická encefalopatie (HIE) je běžnou komplikací v novorozeneckém období způsobenou mnoha faktory, jako je novorozenecká asfyxie, intrauterinní tíseň a onemocnění hyalinembrány (Douglas-Escobar a Weiss, 2015;Barkhuizen et al., 2017).

HIE je hlavní příčinou úmrtí kojenců a primárním zdrojem neurologických následků (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). Devadesát procent přeživších HIE má dlouhodobou neurologickou dysfunkci, jako jsou poruchy učení, kognitivní a motorické dysfunkce a andepilepsie (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). Současná léčba HIE se zaměřuje především na symptomatickou léčbu, včetně mechanické ventilace, korekce hypotenze, suplementace glukózy a případně omezení příjmu tekutin.

Vyžaduje se však účinná léčba schopná zvrátit nebo snížit dlouhodobé poškození mozku (Stankowski a Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Jako klíčová součást učení a rozpoznávání je hippocampus, včetně gyrus dentatus (DG) , CA1 a CA3 regiony, se podílí na transformaci a integraci periferních informací do nervových center (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Hipokampus je přecitlivělý na hypoxicko-ischemické (HI) poškození, které může vyvolat apoptózu hipokampálních neuronů, stimulovat nadměrnou reaktivní gliózu a vést k tvorbě glialscaru (Hopkins a Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Proliferace astrocytů je klíčová pro utěsnění místa infarktu, remodelaci struktury hipokampu a dočasné řízení lokální imunitní reakce během akutní fáze (Rolls et al., 2009).

Hypertrofie a tvorba gliálních jizev však přispívá k aberantní neurogenezi, brání růstu dendritické páteře a omezuje tvar synapse, což dále zhoršuje funkce učení a rozpoznávání (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda a Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Shi a kol., 2017).

Gliální fibrilární acidický protein (GFAP) a chondroitin sulfátové proteoglykany, jako je neurokan, jsou patologickými markery astrogliózy a gliálních jizev, jejichž exprese může být upregulována vysoce aktivovanými astrocyty (Pekny a Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Inhibice astrogliózy a gliálních jizev tedy může být terapeutickým cílem pro HIE a její dlouhodobé neurologické následky.

Bylo prokázáno, že aplikace sevofluranu zmírňuje poranění HI u hlodavců. Studie zkoumající význam sevofluranového postconditioningu (SPC) pro zmírnění poškození HI zvýšením regulace hypoxií indukovatelného faktoru-1 (HIF-1) u dospělých hlodavců a novorozených potkanů ​​identifikovaly několik potenciálních mechanismů (Wang et al., 2019b; Yanget al., 2019; Du et al., 2020;

Jako klíčový fyziologický senzor hypoxie je HIF-1 transkripční faktor se stovkami downstream molekul zapojených do mechanismů inischemické tolerance, jako je vaskulární endoteliální růstový faktor a erytropoetin (Na et al., 2015). Bylo ověřeno, že hypoxická postkondicionace snižuje aktivaci astrocytů a mikroglií po HI v mozcích neonatálních potkanů ​​(Teo et al., 2015).

Proto jsme předpokládali, že HIF-1 může přispívat ke zmírnění tvorby gliových jizev a astrogliózy. HIF-1 může konstitutivně existovat v neuronech, čímž se rychle zvyšuje v expresi a hromadí se za hypoxických podmínek. Když se však kyslík vrátí k normálu, exprese HIF1 nemůže být udržována na dostatečně vysoké úrovni, aby nepřetržitě vyvíjela neuroprotektivní účinek kvůli degradaci prolylhydroxylázou a následné všudypřítomnosti proteiny von Hippel-Lindau (VHL) (Berra et al., 2003; Zhang a kol., 2018).

DJ-1 (kódovaný Park7) je údajně neuroprotektivní protein, zejména za oxidačních podmínek (Aleyasin et al., 2007, 2010). potvrzeno na modelu aParkinsonovy nemoci (PD). Parsanejad et al. (2014) navíc ukázali, že DJ-1 inhibuje ubikvitylaci závislou na VHL a stabilizuje expresi HIF-1.

Předpokládali jsme tedy, že sevofluran stabilizuje protein HIF{0}} v hippocampu zvýšením regulace DJ-1, aby inhiboval všudypřítomnost HIF-1, a tím zlepšil dlouhodobé učení a funkci paměti.

Abychom prozkoumali roli HIF-1 ve vztahu mezi sevofluranem a astrogliózou, použili jsme YC-1 (Lificiguat), aselektivní antagonistu HIF-1, k úplné inhibici exprese HIF-1 na post-transkripční úrovni. V této studii jsme zkoumali roli HIF-1a v neuroprotekci u novorozených potkanů ​​HIE léčených SPC.

Materiály a metody

Zvířata
Výzkum na zvířatech byl proveden v synaptickém stádiu vývoje potkana, které začíná 7. postnatální den (P7), což odpovídá období růstu lidských kojenců od pozdního těhotenství do 3 let po narození (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Sedmidenní krysy Sprague-Dawley o hmotnosti 12–16 g byly vybrány z 20 březích krys (zakoupeny v Laboratoři nemocnice Shengjing, Čínská lékařská univerzita, Čína; poměr samec/samice, 1:1).

Všechny krysy měly volný přístup k vodě a potravě a byly udržovány na standardní vlhkosti a teplotě v laboratoři s 12-hodinovými cykly světlo/tma (8:00/20:00). Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny podle pokynů Národního institutu zdraví (Bethesda, MD, USA) pro péči a použití laboratorních zvířat.

Výbor pro péči o laboratorní zvířata Čínské lékařské univerzity formálně schválil popsané experimenty (Shenyang, Čína; schválení č. 2016PS337K) dne 9. listopadu 2016.

Z 25 březích potkanů ​​bylo vybráno 249 potkanů ​​P7 a náhodně rozděleno do skupin na základě tabulky náhodných čísel (Wang et al., 2019a). Naše konečná analýza zahrnovala celkem 201 novorozenců; míra úmrtnosti po léčbě HI byla 19 %.

Těchto 201 novorozených potkanů ​​bylo náhodně rozděleno do čtyř skupin: sham (n=54), HI (n=54), HI + sevofluran (HIS) (n=54) a HIS+ YC{{ 6}} (n=39) skupin. V každé skupině bylo 24 krys použito pro test western blot, 5 bylo použito pro imunohistochemii a Golgiho barvení a 10 bylo použito pro behaviorální testování. Zbývajících 45 krys ve skupinách simulace, HI a HIS bylo použito pro reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakci (RT- PCR).

Experimentální design a expozice anestetikum

Použitý model HIE byl popsán dříve (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Na základě vzdálenosti mezi řitním otvorem a reprodukčními orgány byla dokončena identifikace pohlaví postnatálních potkanů. Pro vytvoření modelu HIE byla hlava každé krysy P7 vložena do průhledné plastové trubky, která byla před uvolněním sevofluranu utěsněna bavlnou (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Levá společná krční tepna každé krysy byla trvale podvázána a mezi dvěma ligacemi byla tepna přeříznuta; každá operace byla dokončena do 5 minut. Následně se krysy probudily neovlivněné anestezií a byly umístěny zpět do klecí své matky na 2 hodiny. Pro podání SPC byly krysy umístěny do průhledné komory (Lingzhi Company, Hangzhou, Čína) připojené k asevofluranovému odpařovači; jeden kanál pomáhal při ventilaci, zatímco druhý odváděl vzorek plynu z komory na monitor.

Komora byla ventilována 30 % 02 a 70 % N2 po dobu 2 hodin u skupiny s falešnou léčbou, zatímco 8 % 02 a 92 % N2 byly podávány po dobu 2 hodin skupině HI. SPC bylo nastaveno okamžitě po HI: 2,4 % sevofluranu (1 minimální alveolární koncentrace) bylo inhalováno krysami v komoře s atmosférou 30 % O2 a 70 % N2 a rychlostí proudění vzduchu 2 l/min po dobu 30 minut. Ohřívací bazén stabilizoval teplotu uvnitř komory na 37 stupňů.

Podávání léků

Přesně 30 minuty před HI bylo injikováno 1,52 ug HIF-1 inhibitoru (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) do levé postranní komory (Paxinos a Franklin, 2013) pomocí injekční stříkačku 5-μLHamilton (Yingweida Technology, Peking, Čína). Jak již bylo popsáno, YC-1 byl rozpuštěn v umělé mozkomíšním moku v koncentraci 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Western blot analýza

Krysy P7 byly anestetizovány 2% sevofluranem a tkáň hippocampu byla z mláďat extrahována 12, 24 a 48 hodin a 28 dní po operaci. Po extrakci byly tkáně okamžitě umístěny na led.

Celkové proteiny supernatantu byly izolovány přidáním radioimunoprecipitačního testovacího činidla (Beyotime, Haimen, Čína). Koncentrace proteinů byly stanoveny pomocí One BCA Kit (Beyotime).

Dále byly vzorky separovány na 12,5% dodecylsulfát-polyakrylamidových gelech a přeneseny na nitrocelulózové membrány. Po zablokování 5% bovinním sérovým albuminem (Sigma-Aldrich) při 4 stupních byla membrána inkubována s příslušnými primárními protilátkami, včetně anti-glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH; 1:2000; kat. č. 5174S; CellSignaling Technology , Danvers, MA, USA), anti-DJ-1 (1:1000;Kat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), anti-VHL (1:5000;polyklonální; Kat# ab77262; Abcam), anti -HIF-1 (1:900;polyklonální; Cat# ab2185; Abcam), anti-neurokan (1:200;monoklonální; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Dallas,TX, USA) , anti-postsynaptický protein hustoty 95 (PSD95; 1:1000;monoklonální; kat. č. 3409S; Cell Signaling Technology), protein asociovaný s růstem 43 (GAP43; 1:2000; polyklonální;Kat č. 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Chicago, IL, USA) a anti-GFAP (1:5000, polyklonální, kat. č. ab53554; Abcam).

Poté byly bloty inkubovány s anti-králičím IgG (1:5000; kat. č. ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Peking, Čína) nebo anti-myším IgG (1:5000; kat. č. ZB-2301; Zhongshanjinqiao) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě.

Proteinové bloty byly vizualizovány pomocí vylepšených chemiluminiscenčních detekčních činidel (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinové pásy byly kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ (National Institutes ofHealth). Pro analýzu western blotů byla data normalizována na GAPDH.

Imunohistochemie

Dvacet osm dní po chirurgickém zákroku bylo krysám podáno anestetikum za použití výše popsané metody, perfundované 4% formalínem a jejich mozky byly odebrány pro imunofluorescenční barvení.

Mozky byly ponořeny do 4% paraformaldehydu při 4 stupních po dobu 48 hodin, následně dehydratovány v sérii odstupňovaného ethanolu a nakonec vloženy do parafínu. Dále byly tkáně zalité v parafínu nařezány na 2,5{5}}μm silné řezy pomocí vibratomu a výsledné řezy byly skladovány při pokojové teplotě.

Každý mozek byl kontinuálně nařezán a tři diskontinuální mozkové řezy byly vybrány pro barvení NeuN (marker neuronů), GFAP (marker astrocytů) a neurocan (marker gliálních jizev). Pro dvojité značení byly tkáňové řezy inkubovány se dvěma smíšenými primárními protilátkami, včetně kozích anti GFAP (1:250; polyklonální; Cat# ab53554; Abcam), králičí antigeny (1:100; Cat# 12943; Cell Signaling Technology) a/nebo myší anti-neurokan (1:200; monoklonální; Cat# sc{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) při 4 stupních přes noc ve zvlhčené komoře.

Následně byly řezy promyty 0.1 Mfosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem a inkubovány 2 hodiny při pokojové teplotě s vhodnými sekundárními protilátkami, včetně anti-králičí IgG konjugované s Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies, Grand Island, NY, USA), anti-myší IgG konjugovaný s Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies) a anti-kozí IgG konjugovaný s fluorescein isothiokyanátem (1:200; Life Technologies).

Kontrastní barvení buněčných jader bylo provedeno 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (Beyotime) po dobu 5 minut.

Pro pozorování obarvených řezů byl použit mikroskop Olympus BX51 (OlympusCorporation, Tokio, Japonsko). Z každého řezu byla náhodně vybrána tři zorná pole levého hipokampu pro fotografování. Software ImageJ byl použit k odhadu kvantitativní kolokalizace, a tudíž k výpočtu Mandersova překryvného koeficientu.

For more information:1950477648nn@gmail.com