Biotest pro sledování účinku léčby pupečníkové krve proti stárnutí

Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Katedra biotechnologie, College of Life Science, Univerzita CHA, Gyeonggi-do 13488, Korejská republika

2. Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02114, USA

3. Department of Systems Biology, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA *Tito autoři přispěli stejným dílem.

Odpovídající autor: Hakho Lee, PhD. Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, USA. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, PhD. Katedra biotechnologie, College of Life Science, Univerzita CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, Korejská republika. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Ivyspring International Publisher. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). Úplné znění podmínek naleznete na http://ivyspring.com/terms.

Přijato: 2018.10.04; Přijato: 18. 11. 2018; Zveřejněno: 01.01.2019

Cistanche má účinek proti stárnutí

Abstraktní

Pozadí: Léčba starých zvířat plazmou v raném vývojovém stádiu (např. plazma z pupečníku) ukázala působivý potenciál zpomalit degradaci neuronálních a kognitivních funkcí související s věkem. Převedení takových zjištění do klinické reality však vyžaduje účinné způsoby hodnocení účinnosti léčby; ideální metody by měly být minimálně invazivní, vhodné pro sériové testy, nákladově efektivní a kvantitativní.

Metody: Vyvinuli jsme nový přístup k monitorování pomocí biosenzorůproti stárnutíterapie. Pokročili jsme dvě klíčové komponenty senzoru: i) metabolit přenášený krví byl identifikován jako náhradní marker stárnutí; a ii) byl vyvinut kompaktní a nákladově efektivní testovací systém pro aplikace na místě. Léčili jsme staré myši buď lidskou pupečníkovou plazmou nebo fyziologickým roztokem; nestranné profilování metabolitů na myší plazmě odhalilo kyselinu arachidonovou (AA) jako silný indikátor spojený sproti stárnutíúčinek. Dále jsme implementovali konkurenční magneto-elektrochemický senzor (cMES) optimalizovaný pro detekci AA přímo z plazmy. Vyvinutá platforma mohla detekovat AA přímo z malých objemů plazmy (0,5 µL) během 1,5 hodiny.

Výsledky: Testy cMES potvrdily silnou korelaci mezi hladinami AA aúčinek proti stárnutí: Hladiny AA, i když se stárnutím klesaly, se zvýšily u starých myší léčených plazmou, které také vykazovaly zlepšené učení a paměť.

Závěry: Platforma cMES posílí možnosti pre- i klinicképroti stárnutívýzkum umožněním minimálně invazivního, longitudinálního sledování léčby; tyto kapacity urychlí rozvojproti stárnutíterapie, zlepšující kvalitu individuálního života.

Klíčová slova: Anti-aging, Kyselina arachidonová, Profilování metabolitů, Magneto-elektrochemický senzor, Biosenzor

Úvod

Stárnutí je stále více uznáváno jako klinický rizikový faktor kognitivní degenerace (např. neurodegenerace, demence) a dalších chronických onemocnění (např. rakovina, kardiovaskulární onemocnění, svalová degenerace) [1]. S prodlužující se délkou lidského života a rostoucí starší populací se vyvíjí značné úsilí k objasnění mechanismů stárnutí [1–3] a k nalezení terapeutických strategií ke zpomalení nebo dokonce zvrácení procesů stárnutí [4]. Ve skutečnosti byly hlášeny slibné výsledky ze studií na zvířatech; dospělým myším, které dostaly transfuzi plazmy od mladých myší, se vrátily kognitivní funkce, synaptická plasticita a neuronální aktivita [5]. Rychlý vývoj vproti stárnutíočekávají se léčebné postupy a jejich převedení do studií na lidech [6]. Současné metriky pro sledování účinků léčby však mají omezenou praktičnost, protože metody jsou často obtížně aplikovatelné u lidí (např. invazivní zobrazování mozku, kontrolované pozorování chování) a subjektivní (např. dotazníky o zkušenostech pacientů). Jeden klíčový předpoklad pro postupproti stárnutíterapie tak spočívá ve vývoji kvantitativních, minimálně invazivních testů pro monitorování léčby.

Usoudili jsme, že metabolity by byly silným zdrojem proproti stárnutíbiomarkery. Metabolity jsou základním fenotypem v organismu a jsou studovány jako diagnostické biomarkery pro další onemocnění [7]. Zejména stárnutí je typicky spojeno s metabolickými změnami nebo dysfunkcí, která ovlivňuje celkové profily metabolitů v organismech. Jako takové si lze představit, že sledování složení a/nebo hladin metabolitů by informovalo o účinnostiproti stárnutíléčba. Kromě toho by testy metabolitů, zejména ve formě krevních testů, mohly být kvantitativní a minimálně invazivní; tyto přednosti by usnadnily seznámení se s různými léčebnými režimy nebo skupinami pacientů a sledování dynamiky (anti-)stárnutí prostřednictvím sériového odběru vzorků.

Zde popisujeme novou strategii biosenzorů pro monitorováníproti stárnutíléčba. Byly vyvinuty dva klíčové prvky: i) metabolit přenášený krví byl identifikován jako náhradní marker stárnutí; a ii) byl vyvinut rychlý, nákladově efektivní testovací systém pro aplikace v rutinních klinických podmínkách. Konkrétně jsme léčili kohortu starých myší (asi 2 roky starých) plazmou z lidské pupečníkové krve. Komplexní metabolomické analýzy myší krve odhalily, že kyselina arachidonová (AA), jejíž hladina významně klesala s věkem, se u léčené skupiny naopak zvyšovala. Toto pozorování nás vedlo k navržení magneto-elektrochemického senzoru pro malé molekulární cíle: optimalizovali jsme kompetitivní elektrochemickou reakci, při níž byl AA zachycen na magnetických kuličkách a koncentrován pro vyšší citlivost. Vyvinutá platforma mohla detekovat AA přímo z malých objemů plazmy (0,5 µL) během 1,5 hodiny. Pomocí této platformy bychom mohli dále stanovit pozitivní korelaci mezi hladinami AA v krvi a lepším výkonem zvířat v motorické úloze.

Výsledek

Léčba dospělých myší plazmou z pupečníkové krve Obrázek 1a ukazuje celkové schéma experimentu.

Jako činidlo jsme použili plazmu získanou ze vzorků lidské pupečníkové krve. Předchozí studie ukázaly, že staré myši, kterým byla injikována plazma mladých myší, obnovily funkci prostorové paměti a systémové podávání lidské plazmy z pupečníkové krve zlepšilo kognici závislou na hipokampu u starých myší [5, 8]. Injekce plazmy, která postrádá buněčné složky, minimalizovala riziko imunitní rejekce pocházející z neshody druhů. Starší myši (počáteční věk, 18 měsíců staré) byly randomizovány a dostávaly buď plazmu (léčebná skupina) nebo fyziologický roztok (falešná skupina) pomocí injekce do ocasu (130 ul; podrobnosti viz obr. S1). Jako pozitivní kontrola byly použity mladé myši (3 měsíce staré). Plazma pocházející z pupečníkové krve nebyla sloučena a každé myši byla opakovaně podávána infuze plazmy od stejného dárce (obr. S1). Po 4-týdenní léčbě byly myši podrobeny testu chování (tj. rotarod) a byla jim odebrána krev pro analýzy.

Obrázek 1. Návrh experimentu. Plazma z lidské pupečníkové krve byla podávána mladým (3-měsíčním), starým (20- a 23-měsícům) a starým skupinám léčeným plazmou (20-) a 23-měsíční). Tyto tři skupiny byly podrobeny 2-zkušebním testům na rotarodu za účelem měření motorické koordinace a učení. Necílené profilování metabolitů bylo provedeno na krvi ze tří skupin a většinyproti stárnutí-příslušná cesta byla stanovena prostřednictvím bioinformatického přístupu. Biosenzor byl vyvinut k detekci nejdůležitějšího metabolitu dráhy.

Obrázek 2. Stanovení biomarkerů metabolitů spojených s léčbou plazmou z lidské pupečníkové krve. (A) Globální profil poruchy metabolitů. Řádky odpovídají vlastnostem (jedinečná kombinace hodnoty m/z a retenčního času) od LC/MS a kolon po vzorky. Řádky jsou hierarchicky seskupené. (B) Graf skóre PCA pro zmenšení rozměrů. Vzorky byly vyneseny proti hlavní složce (PC) 1 a 2. Hodnoty v závorkách legend os jsou proporce rozptylu vysvětlené těmito složkami. PC1 s největší pravděpodobností vysvětluje účinky proti stárnutí vzhledem k tomu, že skupina léčená plazmou byla mnohem blíže skupině mladých než skupině falešné. (C) Analýza obohacení dráhy. Metabolity byly identifikovány porovnáním naměřených hodnot m/z s informacemi o molekulové hmotnosti. Každý kruh představuje konkrétní nalezenou cestu. Pro danou dráhu umístění x nebo velikost kruhu odpovídá relativní centrální centralitě (míra dopadu dráhy) metabolitů a umístění nebo barvě y (nižší hodnoty p pro červenou a vyšší pro modrou) do té míry, které metabolity jsou nadměrně zastoupeny. Dominantní dráhy mají vyšší hodnoty x a y. Metabolismus kyseliny arachidonové (AA) byl tedy identifikován jako nejpravděpodobnější cesta pro vysvětleníúčinky proti stárnutíplazmy pupečníkové krve.

Metabolické analýzy vzorků krve myší

Nejprve jsme provedli nezaujaté profilování metabolitů s malou molekulou v myší plazmě. Vzorky krve ze všech tří skupin myší byly podrobeny analýze kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií (LC/MS). Data m/z jsme zpracovali pomocí MAIT (nástroje pro automatickou identifikaci metabolitů) a identifikovali statisticky významné znaky pomocí ANOVA (8572 unikátních kombinací m/z a retenčního času) (obr. 2a). Hierarchická shluková analýza (HCA) metabolitů odhalila dva klíčové vzorce: i) profily metabolitů byly výrazně odlišné u starých (neléčených) a mladých myší; a ii) profil starých myší ošetřených plazmou byl bližší profilu mladých myší.

Analýza hlavních komponent (PCA) odhalila inherentní struktury metabolomických dat (obr. 2b). Asi 50 procent celkových variací bylo vysvětlitelných první (PC1) a druhou hlavní složkou (PC2). Všechny tři kohorty (tj. mladé, plazmou ošetřené a falešné skupiny) se usadily na diskrétních pozicích, což ukazuje, že byly identifikovány biologicky relevantní rysy pro diferencující skupiny skupin. Zajímavé je, že věková skupina ošetřená plazmou se od falešného pokusu vzdálila směrem k mladé skupině. Abychom kvantifikovali oddělení skupin, vypočítali jsme hierarchické shlukování na dvou hlavních komponentách. V dendrogramu byly mladé a plazmou ošetřené skupiny seskupeny na nižší úrovni odlišnosti (nebo na vyšší úrovni podobnosti, 1120,9) než neošetřená skupina (3162,5) (obr. S2). Tyto výsledky naznačují, že vybrané znaky (proměnné nebo řádky na obr. 2a) lze použít k odvození biomarkeru metabolitu relevantního pro stárnutí aproti stárnutí. Vlastnosti jsme anotovali známými metabolity pomocí databáze ve veřejné doméně [9].

Dále jsme hodnotili funkce a vzájemnou propojenost identifikovaných metabolitů pomocí mapování KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [10]. Pro danou dráhu jsme měřili i) nadměrné zastoupení kandidátního metabolitu a ii) jeho důležitost (tj. centralitu mezilehlosti) [11] jako klíčového mezilehlého uzlu mezi páry jiných metabolitů (podrobnosti viz Metody). Zjistili jsme, že metabolismus kyseliny arachidonové (AA) byl nejvíce zastoupenou cestou (nejvyšší hodnota y na obr. 2c) a metabolity v této dráze měly tendenci se nacházet v komunikačních cestách (vyšší hodnoty x na obr. 2c) a řídí tok informací. Z mnoha metabolitů v metabolismu AA jsme jako biomarker vybrali samotnou AA; jako výchozí vstup do dráhy může být samotný AA zástupcem jiných narušených metabolitů.

Kompetitivní magneto-elektrochemický senzor (cMES) pro detekci AA v plazmatu

Dále jsme se rozhodli vyvinout rychlý testovací systém na místě pro detekci AA. Rozhodli jsme se pro použití technologie magneto-elektrochemického snímání [12–17]. Kombinuje obohacování cíle a detekci do jediné platformy: magnetické kuličky (MB) se používají k zachycení a značení molekulárních cílů a cíle vázané na kuličky jsou detekovány pomocí elektrochemického snímání. Tento přístup má mnoho praktických výhod: i) nativní vzorky (plazma nebo krev) mohou být přímo použity bez potřeby čištění vzorků; ii) test dosahuje vysoké citlivosti detekce prostřednictvím magnetického obohacení a enzymatické amplifikace signálu; iii) na základě schématu elektrické detekce lze senzory snadno miniaturizovat jako přenosné zařízení (obr. 3a).

Detekce AA pomocí magneto-elektrochemického snímání však představovala technickou výzvu; protože AA je malá molekula (~304,5 Da), bylo obtížné použít imunotesty s párem AA-protilátek. Proto jsme prozkoumali formát kompetitivního testu (cMES; kompetitivní magneto-elektrochemický senzor), který vyžadoval pouze jednu AA protilátku (obr. 3b). Pro zachycení cíle jsme MB potáhli AA-protilátkami (MBAb). Připravili jsme také kompetitivní činidlo (AA-HRP) konjugací AA s oxidačním enzymem (křenová peroxidáza, HRP). Konkrétně jsme použili haptenovou formu; AA konjugovaná na hovězí sérový albumin (BSA) a dále konjugovaná HRP na nosič BSA (obr. S3). Pro test cMES byly vzorky krve smíchány s MBAb a AA-HRP. Množství AA-HRP bylo dostatečné k nasycení AA-vazebných míst v MBAb (Metody). To by vedlo k rozdílnému zatížení MB HRP v závislosti na množství endogenních AA ve vzorcích. Postupné přidávání chromogenního elektronového mediátoru (3,3',5,5'-tetramethylbenzidin, TMB) generovalo elektrický proud, který byl odečítán planární elektrodou. Reakční doba pro zachycení AA a inkubaci TMB byla optimalizována pro maximalizaci úrovně signálu (obr. S4).

Obrázek 3. Kompetitivní magneto-elektrochemický senzor (cMES) pro AA test. (A) Schéma zařízení. Zařízení cMES má malé rozměry a umožňuje

operace na místě. (B) Navrhli jsme kompetitivní elektrochemický test pro detekci AA. Magnetické kuličky (MBAb) byly konjugovány s protilátkami proti AA.

Kontrolní vzorky obsahovaly pouze AA-HRP a byly smíchány s magnetickými kuličkami. Testované vzorky byly smíchány s magnetickými kuličkami a AA-HRP. (C) Elektrické proudy

měřeno přenosnou čtečkou cMES. V testu cMES se velikost proudu snižuje se zvyšující se koncentrací AA [AA]. Signál z ovládání

vzorek nastavil výchozí hodnotu pro [AA]=0 ng/mL. Proudový rozdíl (∆I) mezi kontrolními a cílovými vzorky plazmy byl použit jako analytická metrika. (D)

Známá množství AA byla přidána do séra a měřena pomocí cMES. Limit detekce byl ~ 126 ng/ml. (E) cMES a ELISA byly porovnány pro

konkordance. Výsledky obou modalit ukázaly dobrou shodu (R2=0,959). Data jsou zobrazena jako průměr ± SEM z trojnásobného měření.

Obrázek 4. Měření AA ve vzorcích plazmy. (A) Analýza časového průběhu hladiny myšího AA po injekci plazmy. Myším (n=6) jsme vstříkli 13{{10}} μl plazmy (koncentrace AA=7,2 µg/ml) a odebrali myším krev po 3, 7 a 14 dní. Poté byly monitorovány hladiny AA v krvi myší. Hladiny AA významně vzrostly v den 3 a vrátily se na normální úroveň po 7 dnech. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (b)="" byly="" testovány="" vzorky="" myší="" plazmy.="" v="" kontrolní="" skupině="" (n="5)" měly="" mladé="" myši="" (věk="" 5="" a="" 8="" měsíců)="" vyšší="" hladiny="" aa="" než="" staré="" myši="" léčené="" falešně="" (věk="" 20="" a="" 23="" měsíců;="" n="8)." u="" skupiny="" léčené="" plazmou="" (n="5)" bylo="" pozorováno="" trvalé="" zvýšení="" aa.="" *p="">< 0,05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" (c)="" vzorky="" plazmy="" ze="" stejných="" kohort="" jako="" v="" (b)="" byly="" analyzovány="" hmotnostní="" spektrometrií.="" hladiny="" aa="" vykazovaly="" podobný="" trend="" jako="" naměřené="" pomocí="" cmes.="" *p="">< 0,05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" data="" jsou="" zobrazena="" jako="" průměr="" ±="">

V důsledku kompetitivního testu se velikost elektrického proudu snižovala s vyššími koncentracemi AA v plazmě ([AA]). Připravili jsme proto kontrolní vzorek inkubací MBAb pouze s AA-HRP. Kontrolní vzorek byl použit k nastavení horní základní linie (tj. [AA]=0 ng/mL) pro výpočet rozdílů signálu; byly měřeny elektrické proudy z kontrolního vzorku a vzorku plazmy a čistý rozdíl |∆I |=|Icontrol – Iplasma|byl získán (obr. 3c). Takový

diferenciální měření také kompenzovala běžný signál pozadí.

Titrační experiment (obr. 3d) s použitím vzorků obohacených různým množstvím AA odhalil limit detekce (LOD) jako ~125,9 ng/ml. LOD testu byla ~300-krát nižší než typická koncentrace AA (38 µg/ml) v plazmě mladých myší (5 měsíců, n=2). Na základě těchto výsledků jsme naředili počáteční vzorky plazmy (100-násobně) přidáním roztoku pufru (viz Metody). Signál z nespecifické vazby byl blízký úrovni vnitřního pozadí (~43 nA), což potenciálně těžilo z vysokého faktoru ředění. Také jsme potvrdili, že výsledky testu se shodovaly s výsledky konvenčního testu ELISA (R2=0.961, obr. 3e). Test cMES byl však rychlejší (1 hodina) než ELISA (4 hodiny), většinou kvůli rychlé vazebné kinetice; v cMES zachycují MB AA v celém objemu vzorku (3-dimenzionální difúze), zatímco zachycení AA spoléhá na 1-rozměrovou difúzi v testu ELISA založeném na destičkách.

Monitorování AA u myší ošetřených plazmou

Použili jsme cMES k analýze hladin AA u myší po jediném ošetření plazmou. Protože AA je přirozeně přítomna v lidské pupečníkové krvi, injekce plazmy by aditivně zvýšila hladiny myšího AA. Průměrná koncentrace AA ze šesti různých plazmy z lidské pupečníkové krve byla 7,2 ± 0,5 ug/ml (průměr ± SEM). Myším (n=6) jsme injekčně podali 130 µl plazmy z lidské pupečníkové krve a sledovali jsme jejich hladiny AA (obr. 4a). Plazmatická injekce okamžitě zvýšila hladiny AA v krvi (den 3; p < 0,01,="" ve="" srovnání="" se="" všemi="" ostatními="" časovými="" body),="" ale="" účinek="" byl="" dočasný;="" hladiny="" aa="" se="" vrátily="" k="" normálu="" 7="" dní="" po="" léčbě="" (p="0,34," ve="" srovnání="" s="" časovým="" bodem="" před="" injekcí="">

Dále sledujeme hladiny AA v plazmě po plném léčebném plánu (obr. S1). Byly použity tři různé kohorty myší: skupina léčená plazmou (n=8) a falešná (n=8) věková skupina (ve věku 20-23 měsíců) a mladá kontrolní skupina (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Léčba plazmou vedoucí ke zlepšení kognitivních funkcí a chování u starých myší

Dále jsme hodnotili behaviorální fenotypy zvířecích kohort, zejména hodnotili jejich motorické učení a paměťové funkce. Provedli jsme {{0}}zkušební rotarodové testy 1 a 4 měsíce po plazmové nebo simulované léčbě (obr. 5a); latence (doba běhu) myši před pádem na rotující tyč byla použita k posouzení motorické výkonnosti zvířete. 1 měsíc po léčbě (20-měsíční věk) byla latence jak u simulované skupiny, tak u skupiny léčené plazmou významně nižší (p < 0,0001)="" než="" u="" mladých="" (5-měsíčních="" )="" skupina="" (obr.="" 5b).="" skupina="" léčená="" plazmou="" však="" vykázala="" postupné="" zlepšování="" motorického="" učení="" a="" paměti,="" zatímco="" stejná="" schopnost="" se="" snížila="" ve="" skupině="" s="" falešnou="" léčbou.="" změny="" v="" úrovních="" aa="" vedly="" ke="" změnám="" chování,="" které="" by="" mohly="" sloužit="" jako="" časný="">proti stárnutíléčebný efekt (obr. 5c).

Analýzy mozkové tkáně (obr. 5d, 5e) ukázaly, že staré myši (sham skupina) měly menší plochu DCX-pozitivních buněk v subventrikulární zóně než mladé myši. Naopak plocha DCX-pozitivních buněk se u zvířete ošetřeného plazmou zvýšila a zůstala nezměněna (p=0 0,04), což ukazuje, že injikovaná plazma z pupečníkové krve stimulovala neurogenezi starého mozku. Výsledky naznačují potenciální přínos léčby plazmou na trvalou neurogenezi, která vedla ke zlepšení motorické funkce v léčené skupině.

Diskuse

Pokroky v omlazovacích terapiích současně zvyšují potřebu objektivního a kvantitativního měření pro zjištění účinnosti léčby. Proto jsme naši studii navrhli tak, aby identifikovala molekulární biomarkery, které mohou nejlépe vysvětlit fenotypové rysy stárnutí aproti stárnutíléčba. Naše pokusy na zvířatech vedly k následujícím pozorováním: i) profily metabolitů kohort mladých a dospělých myší jsou evidentně odlišné; a ii) injekce lidské pupečníkové plazmy do starých myší změní jejich metabolitové vzorce blíže těm u mladých myší. Je zajímavé, že jsme našli kyselinu arachidonovou (AA) jako nejúčinnější náhradní biomarkerproti stárnutíléčba; Metabolismus AA byl vysoce neregulovaný jak u mladých myší, tak u myší léčených plazmou a bylo zjištěno, že hraje klíčovou roli v interakci s jinými metabolickými cestami, jako je metabolismus kyseliny linolové [10, 18].

Dále jsme vyvinuli rychlý, přenosný senzorový systém (cMES), který usnadňuje detekci AA v rutinním výzkumu a klinických podmínkách. Specificky jsme integrovali kompetitivní testovací schéma s imunomagnetickým obohacením ve snaze detekovat malé molekulární cíle (tj. metabolity) přímo ze vzorků plazmy. Tato kombinace přináší následující výhody. (i) Test těží z rychlé vazebné kinetiky, protože magnetické kuličky zachycují AA v celém objemu vzorku (3-rozměrná difúze). (ii) Procesy testu (např. promývací kroky) jsou zjednodušeny pomocí externích magnetů používaných pro sběr kuliček. (iii) Magnetickou koncentrací kuliček vázaných na AA v blízkosti detekční elektrody lze zlepšit celkový analytický signál (~72 procent) [12]. Ukázali jsme, že cMES test používá<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Obrázek 5. Behaviorální a molekulární testy. (A) 2-zkušební testy Rotarod byly provedeny 1 a 4 měsíce po injekci plazmy. (B) Skupina ošetřená plazmou

prokázalo progresivní zlepšení motorické koordinace; výkon byl nakonec blízko výkonu mladé skupiny (druhý pokus ve 3 měsících). Doba běhu falešné skupiny se s věkem zkracovala. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01.="" (c)="" u="" skupiny="" léčené="" plazmou="" předcházelo="" zvýšení="" hladin="" aa="" zlepšení="" motorických="" funkcí.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001.="" (d)="" mozkové="" buňky="" v="" subventrikulární="" zóně="" byly="" imunobarveny="" na="" marker="" neurogeneze,="" doublecortin="">

Měřítko je 50 µm. Všimněte si, že falešná skupina měla významně menší plochu DCX-pozitivních buněk v subventrikulární zóně než mladé myši, zatímco plocha se zvýšila u zvířat ošetřených plazmou a zůstala nezměněna. (E) Byla změřena plocha DCX-pozitivních buněk na snímku (D). *p < 0.05;="" ***p=""><>

Bylo prokázáno, že AA podporuje růst svalů a vývoj mozku [19, 20]. Další zprávy také zdůraznily potenciální výhody AA vproti stárnutí[21, 22]. Současná studie je v souladu s těmito zjištěními, ale její rozsah byl omezen na stanovení korelačního vztahu mezi úrovněmi AA aproti stárnutífenotypy. Sériové monitorování AA však ukázalo, že zvýšení AA u myší léčených plazmou bylo pravděpodobně z endogenních zdrojů, nikoli z plazmy s transfuzí. Navíc trvaleproti stárnutíúčinky byly pozorovány u myší příjemců dokonce 4 měsíce po ukončení léčby plazmou. Zlepšilo se motorické učení a paměťové funkce; a v mozku se zvýšil počet neuronálních prekurzorových buněk. Tato pozorování silně naznačují fyziologické změny u myší ošetřených plazmou; přesný mechanismus musí být ještě objasněn.

V budoucím výzkumu by se mělo řešit několik dalších omezení této studie. Za prvé, test cMES musí být zpřesněn pro vyšší přesnost. Zejména s nedostatkem skutečně negativních vzorků (tj. krevních vzorků bez jakékoli endogenní AA) bylo obtížné zohlednit signály z nespecifické vazby. Je možné, že účinek krevních matric může být zanedbatelný, protože jsme vzorky zředili 100-násobně. Takový předpoklad je však třeba ověřit použitím vzorků plazmy s delecí AA, které by mohly být připraveny z myšího modelu s deficitem AA [23] nebo prostřednictvím imunodeplece AA. Za druhé jsme se pro jednoduchost zaměřili na detekci jediného metabolitu v metabolismu AA, ale tento přístup může ignorovat biologický kontext, jako jsou interakce mezi metabolity v dané dráze. Zahrnutí panelu metabolitů by lépe zachytilo metabolické poruchy a také zvýšilo diagnostickou přesnost. cMES lze snadno škálovat pro detekci různých markerů při spotřebě malých množství vzorků. Za třetí, interpolace současných nálezů na lidi by byla náročná. Ačkoli myši a lidé sdílejí podobné metabolické dráhy, myši mají 7-krát vyšší rychlost metabolismu než lidé [24]. Pro stanovení optimálních dávek plazmy pro infuzi a pro stanovení výchozích hodnot pro biomarkery jsou nezbytné zkoušky na lidech; na základě studií na zvířatech plánujeme takové studie na lidech. Tyto snahy urychlí rozvojproti stárnutíterapie, zlepšování kvality života jednotlivců i snižování společenské zátěže.

Metody

Experimentální design

Plazma byla oddělena od lidské pupečníkové krve odebrané při porodu. Plazma z pupečníkové krve byla podávána intravenózní infuzí starým myším (18-měsíčním) a falešným kontrolním (18-měsíčním) a mladým myším (3-měsíční jako pozitivní) kontrola) byl injikován fyziologickým roztokem. 1 a 4 měsíce po transplantaci byly provedeny 2-zkušební testy na rotarodu k posouzení motorické koordinace a dlouhodobé paměti (obr. S1). Necílené profilování metabolitů bylo provedeno na krvi ze tří skupin a bioinformatická analýza stanovilaproti stárnutírelevantní dráha (metabolismus kyseliny arachidonové). Biosenzor byl vyvinut pro snadnou a účinnou detekci kyseliny arachidonové v krevním oběhu.

Příprava vzorku pupečníkové krve

Lidská pupečníková krev byla odebrána v rámci Institutional Review Board Všeobecné nemocnice CHA (Soul, Korea, IRB č. CHAMC-2015- 08-130-009). Lidská pupečníková krev byla darována od 4 dárců a ošetřena antikoagulantem citrát-fosfát-dextróza s adeninem (CPDA-1). Plazma lidské pupečníkové krve byla izolována centrifugací při 2,000 g po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Izolované vzorky plazmy byly skladovány při -80 stupni a použity s jediným cyklem zmrazení-rozmrazení při pokojové teplotě.

Pokusy na zvířatech

Zvířecí protokoly byly schváleny CHA University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Použili jsme 18-měsíční samice myší C57BL/6 k vyhodnocení metabolických poruch a behaviorálních fenotypů, které korelují se stárnutím aproti stárnutí. Pozitivní kontroly byly 3-měsíční samice myší C57BL/6. Všechny myši byly chovány při teplotě místnosti ve standardním 12hodinovém cyklu světlo-tma. U dospělých myší byla plazma z pupečníkové krve nebo fyziologický roztok (130 ul) intravenózně injikovány 12krát po dobu 4 týdnů. Izolovaná plazma z pupečníkové krve nebyla spojena a dané zvíře dostalo plazmu z pupečníkové krve od stejného dárce. Počet zvířat použitých v každém experimentu je popsán v odpovídajících částech metody. Plazma byla odebrána centrifugací (3,{10}} g, 15 minut při teplotě místnosti).

Získávání metabolitů a analýza dat

Pro profilování metabolitů přenášených krví byla myším odebrána krev srdeční punkcí v určených časových bodech: skupina mladých (3-měsíc starých, n=10), falešná skupina ({{ 4}}měsíc, n=10; 23-měsíc, n=12), skupina léčená plazmou (20-měsíc, n {{13 }}; 23-měsíc, n=5). Vzorky krve byly analyzovány pomocí systému kapalinové chromatografie-hmotnostní spektrometrie (LC-MS) (Agilent). Soubory LC/MS jsme převedli do standardního formátu mzXML (ProteoWizard) [25] a poté je zpracovali pomocí MAIT (souprava nástrojů pro automatickou identifikaci metabolitů) [26] pro detekci vlastností, statistickou analýzu a identifikaci metabolitů. Statisticky významné znaky (tj. ionizované a/nebo fragmentované metabolity) byly identifikovány pomocí analýzy rozptylu (ANOVA). Tyto vlastnosti byly porovnány se všemi možnými domnělými metabolity v databázi metabolomů [9] na základě poměru hmotnost/náboj hmotnostního spektrálního iontu (tolerance m/z 0.005). Charakterizovali jsme globální změny metabolitů pomocí analýzy hierarchického shlukování a vlastní struktury metabolomických dat pomocí analýzy hlavních složek (PCA). Do učení bez dozoru, jako je PCA a hierarchické shlukování, byly zahrnuty dvě nebo tři technická opakování (zajišťující, že technická variace je mnohem menší než biologická variace) na myš. Hierarchické shlukování na hlavních komponentách (HCPC) bylo provedeno pomocí FactoMineR, balíčku R [27]. Pro funkční analýzu byly pomocí analýzy KEGG dráhy (MetaboAnalyst 3.0) určeny nejpravděpodobnější metabolické dráhy, které budou narušeny stárnutím a léčbou plazmou [28]. Hypergeometrická distribuce byla použita k měření nadměrného zastoupení odpovídajících metabolitů ve specifických KEGG drahách.

Příprava imunomagnetických kuliček

Magnetické kuličky (5 mg) potažené epoxidovými skupinami (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen) byly suspendovány v 100 ul 0,1M roztoku fosforečnanu sodného. Bylo přidáno 100 mikrogramů protilátky proti kyselině arachidonové (Biomatik) a důkladně promícháno. Bylo přidáno 100 mikrolitrů 3M roztoku síranu amonného a směs byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 2 hodin a poté dále inkubována při 4 stupních přes noc s pomalým naklápěním. Konjugační reakce byla provedena při pH=7,4. Tyto procesy indukují tvorbu kovalentních vazeb mezi epoxidovými (kuličkami) a aminovými (protilátkovými) skupinami, což jsme dříve potvrdili vystavením konjugátů protilátka-kulička pH [29]. V průměru bylo na perličku imobilizováno 2,4 x 104 protilátek. Magnetické kuličky konjugované s protilátkou byly odděleny permanentním magnetem, dvakrát promyty roztokem PBS a resuspendovány ve 200 ul PBS s 1 procentem BSA. Korálky byly skladovány ve 4 stupních až jeden měsíc.

HRP konjugace s kyselinou arachidonovou

HRP byla poté konjugována s BSA pomocí redukční aminační chemie. Konkrétně 100 µg AA konjugovaného s BSA (RPU51089, Biomatik) byl rozpuštěn v 0,5 ml 0,2 M uhličitanově-biokarbonátového pufru (pH 9,4), přidán k jednomu miligramu lyofilizovaného EZ-linku Plus Activated Peroxidase (Thermo Scientific) a inkubuje se 1 hodinu při pokojové teplotě. Dále bylo přidáno 10 ul kyanoborohydridu sodného (Thermo Scientific) a směs byla inkubována po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Nakonec bylo přidáno 20 ul zhášecího pufru (Thermo Scientific) a následovala 15minutová inkubace při teplotě místnosti. Gelová elektroforéza a analýza proteinového pásu potvrdily konjugaci HPR k BSA-AA (obr. S3a). AA konjugované s HRP byly shromážděny a zakoncentrovány pomocí odstředivého filtru Amicon Ultra 100K (Millipore). Zbývající peroxidáza a BSA-AA byly čtyřikrát promyty PBS.

Elektrochemická detekce AA ve vzorcích plazmy

Pro elektrochemickou detekci AA byla odebrána krev od mladých (n {{0}}), simulovaných (n=8) a skupin léčených plazmou (n=5 po dobu 1 měsíce a n=5 po dobu 3 měsíců). Vzorky myší plazmy (0,5 µL) byly zředěny v 50 µL 1% BSA v PBS (×100-násobné ředění) a smíchány s roztokem imunomagnetických kuliček (50 µL) a roztokem AA konjugovaným s HRP (50 ul). Množství AA-HRP bylo dostatečně velké, aby saturovalo vazebná místa v magnetických kuličkách. Použili jsme asi 8,4 × 107 perliček na test, což zpřístupnilo 2,0 × 1012 AA-vazebných míst. Množství AA-HRP bylo ~1,7x1013; poměr mezi AA-HRP a vazebnými místy byl ~8:1. Směs byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny s pomalým naklápěním. Kontrolní kulička byla připravena smícháním 1 procenta BSA v PBS (50 ul) s roztokem imunomagnetických kuliček (50 ul) a roztokem AA konjugovaným s HRP (50 ul). Všechny zreagované kuličky byly odděleny permanentním magnetem a dvakrát promyty 80 ul PBS (1 procento BSA). Nakonec byly kuličky resuspendovány v 7 ul PBS. Připravený roztok kuliček a 20 ul roztoku TMB (Biomatik) byly naneseny na horní část elektrody. Po 6 minutách bylo zahájeno měření chronoamperometrie. Použili jsme miniaturizovaný elektrochemický senzor (prototyp systému vyvinutý společností AcurreHealth Inc.). Aktuální úrovně v rozsahu 40-45 s byly zprůměrovány. Použili jsme konverzní faktor (×100) k uvedení odhadovaných původních koncentrací AA v plazmě.

Enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA)

Experimenty ELISA byly provedeny pomocí soupravy ELISA s myší arachidonovou kyselinou (AA) (Biomatik) podle výrobních pokynů. Do každé jamky byly přidány sériově zředěné AA a inkubovány s HRP-konjugovaným AA při 37 stupních po dobu 40 minut. Po čtyřnásobném promytí promývacím pufrem byl přidán roztok TMB a inkubován po dobu 20 minut. Vyvíjení barvy bylo zastaveno přidáním zastavovacího roztoku. Absorbance byla odečtena při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Tecan).

Test rotarodu

Upravili jsme Rotarod test Konga et al. [30] k posouzení lokomoční koordinace. Rotarod s tyčí o průměru 3- cm začínal na 4 otáčkách za minutu a zrychloval o 4 otáčky za minutu za 30 sekund po dobu 5 minut. Myši byly umístěny na tyč a byla měřena doba, za kterou myši spadly z tyče. Každá myš byla podrobena 3 pokusům denně a doby běhu každého dne byly vypočteny jako průměr tréninkových časů. První rotační test byl proveden 1-měsíc po léčbě plazmou: mladá skupina (n=29), falešná skupina (n=17), skupina léčená plazmou (n {{ 11}}). Rekvalifikační kurz byl zahájen 4-měsíce po léčbě plazmou. Aby se předešlo přetrénování, byla provedena rekvalifikace po dobu 2 dnů. Další postup byl stejný jako při prvním sezení.

Zobrazování mozkové tkáně

1 měsíc (n=4) a 4 měsíce (n=3) po injekci lidské plazmy z pupečníkové krve nebo injekci fyziologického roztoku byla zvířata usmrcena a poté perfundována 4% paraformaldehydem (PFA) a PBS prostřednictvím levá komora. Jako kontroly byly použity mladé (n=5) a falešné skupiny (n=4). Jejich mozky byly

extrahované a kryoprotektivní. Každý mozek byl nařezán na kryotomu o tloušťce 30 μm. Na

po provedení imunohistochemie byla nespecifická vazba blokována 5% normálním kozím sérem v 0,3% Tritonu X-100 po dobu 40 minut. Primární protilátka proti Doublecortinu (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) byla aplikována přes noc při 4 stupních a poté byl k promytí použit PBS [31]. Sekundární protilátka Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) byla použita pro detekci DCX. Snímky byly pořízeny pomocí fluorescenčního mikroskopu (Nikon Eclipse 80i) a analyzovány pomocí snímku J [32].

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí základních funkcí R a lme4, balíčku R pro buď lineární

Modely se smíšenými efekty nebo zobecněný lineární model

(GLM) a následně LSD post-hoc test [33]. Data jsou prezentována jako průměr ± standardní chyba a hodnota p < 0,05="" byla="" považována="" za="">

Doplňkový materiál

Doplňkové figurky.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Poděkování

Děkujeme společnosti AccureHealth Inc. za poskytnutí miniaturizovaného elektrochemického senzoru. Tato studie byla částečně podpořena grantem Institute for Information and Communications Technology Promotion (IITP) financovaným korejskou vládou (MSIT) (2017M3A9B4025699).

Konkurenční zájmy

Autoři prohlásili, že neexistuje žádný konkurenční zájem.