Beta Vulgaris Rubra L. (řepná řepa) Slupka Metanolový extrakt snižuje oxidační stres a stimuluje buněčnou proliferaci prostřednictvím zvýšení exprese VEGF v H2O2 indukovaných oxidačně stresovaných lidských endoteliálních buňkách pupečníkové žíly

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní:Antioxidační kapacita polyfenolů a flavonoidů přítomných v dietních látkách pomáhá zastavit vývoj reaktivních forem kyslíku (ROS) a chránit buňky hladkého svalstva endotelu před oxidativním stresem/indukovanou nekrózou. Červená řepa (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) je běžně konzumovaná zelenina představující bohatý zdroj antioxidantů. Bioaktivní sloučeniny ze slupky červené řepy a jejich role v endoteliálních buňkách lidské pupeční žíly (HUVEC) jsou stále nedostatečně prozkoumány. V této studii byl připraven methanolový extrakt z červené řepy (BPME) a ​​byl analyzován jeho vliv na biologickou účinnost, jadernou integritu, potenciál mitochondriální membrány, růst vaskulárních buněk a hladiny genové exprese související s imunoregulací v HUVEC s indukovaným oxidačním stresem. . Výsledky plynové chromatografie-hmotnostní spektroskopie (GC-MS) potvrdily, že BPME obsahuje 5-hydroxymethylfurfural (32,6 procenta), methylpyruvát (15,13 procenta), furfural (9,98 procenta) a 2,3-dihydro{{ 14}},5-dihydroxy-6-methyl-4H-Pyran-4-on (12,4 procenta). Extrakt BPM účinně zvýšil buněčnou proliferaci a byl potvrzen testem MTT; jaderná integrita byla potvrzena testem barvení propidium jodidem (PI); mitochondriální membránový potenciál（Aψm）byl potvrzen testem barvení JC-1. Test Annexin V potvrdil, že HUVEC ošetřené BPME vykazovaly 99 procent životaschopných buněk, ale pouze 39,8 procenta životaschopnosti bylo prokázáno u HUVEC ošetřených samotnou H2O2. Kromě toho BPME ošetření HUVEC po dobu 48 hodin snížilo mRNA expresi lipidového peroxidu (LPO) a zvýšilo NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endoteliální oxid dusnatý syntáza (eNOS a hladiny exprese mRNA vaskulárního buněčného růstového faktoru (VEGF). Zjistili jsme, že léčba BPME snížila prozánětlivé (nukleární faktor-k (Fk ), tkáňový nekrotický faktor- (TNF- ), toll-like receptor-4(TLR-4), interleukin-1 ( IL-1 )) a vaskulární zánět (intracelulární adhezní molekula (ICAM), vaskulární buněčná adhezní molekula (VCAM), EDN, IL-1 ) související mRNA exprese. Závěrem lze říci, že ošetření slupky červené řepy účinně zvýšilo růstové faktory vaskulárních hladkých buněk a vývoj mikrotubulů, zatímco snížilo vaskulární zánětlivé regulátory. BPM může být prospěšný pro regeneraci hladkých buněk cév, opravu tkání a potenciál proti stárnutí.

klíčová slova:červená řepa; oxidační stres; mitochondrie; angiogeneze; zánět

1. Úvod

Angiogeneze je fyziologický proces vaskulogeneze z existující vaskulatury v těle [1. Je nezbytný nejen pro embryonální vývoj a reprodukci, ale také pro buněčný cyklus a opravu tkání[2,3]. Je však spojena s patogenezí různých onemocnění, jako je růst nádorů, revmatoidní artritida a různá ischemická a zánětlivá onemocnění [3-5]. Cévní endotel hraje důležitou roli v udržování vaskulární hemostázy regulací krevního cévního tonu a imunitních a zánětlivých reakcí [6,7].puritans vitamín CEndoteliální buňky (EC) jsou tenké monocelulární vrstvy, které vystýlají všechny vnitřní povrchy krevních cév a produkují různé molekuly, které působí lokálně nebo na vzdálených místech [7]. Endotel je zásadní pro tělesnou homeostázu a jakákoli změna v odpovědi endotelových buněk vede k primárním událostem zánětlivých a vaskulárních chorobných procesů, jako je ateroskleróza a hypertenze [6,8,9]. Tato onemocnění způsobují oxidační stres, který mění strukturu EC a funkční integritu a vede k endoteliální dysfunkci [9]. EC lidské pupeční žíly (HUVEC) byly široce používány jako model pro studie související s lidským vaskulárním endotelem. Navíc představují užitečný model pro studium hlavních biologických drah zapojených do funkce endotelu [10].

Kliknutím sem se dozvíte více

Bioaktivní sloučeniny a fytochemikálie se hojně vyskytují v ovoci, zelenině, zelených bylinkách a mnoha rostlinách, které vykazují četné zdravotní přínosy, jako jsou protizánětlivé, antioxidační, antikarcinogenní a angiogenní vlastnosti [11-13]. V tomto ohledu červená řepa (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) patří do čeledi Amaranthaceae a je klasifikována jako jeden z nejlepších zdrojů vysokých hladin antioxidantů [14,15. Konkrétně obsahuje více fytochemikálií, které jsou biologicky aktivní, včetně betalainů, flavonoidů, polyfenolů, terapeutických enzymů, kyseliny askorbové, kyseliny dehydroaskorbové (DHAA) a anorganického dusičnanu (NO3)[16-18]. Kromě toho poskytuje cenné základní živiny, jako je draslík, vápník, hořčík, sodík, železo, zinek, fosfor, měď a mangan [19]. Několik studií uvádí, že extrakt z červené řepy (kořen) má četné příznivé účinky díky svým hypoglykemickým, hypolipidemickým, protizánětlivým, antihypertenzním a antiproliferativním vlastnostem [20-22].sistancheVšechny tyto prospěšné vlastnosti mohou být spojeny se schopností bioaktivních sloučenin pohlcovat volné radikály. Konzumace červené řepy je tedy spojena s četnými nutričními a zdravotními přínosy. Díky své nutriční hodnotě může být použit jako funkční zdroj potravy proti oxidativnímu stresu, který vyvolává chronická metabolická onemocnění, jako je diabetes 2. typu a kardiovaskulární onemocnění [23].

Na základě přehledu literatury má Beta vulgaris silné antioxidační, imunoregulační a angiogenní vlastnosti. Apigenin byl nalezen v listech řepy; má antiproliferativní účinky v jaterních a střevních buňkách a může zlepšit komorbiditu obezity indukovanou dietou s vysokým obsahem tuků prostřednictvím aktivace AMPK [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] zjistili, že Beta vulgaris chrání vaskulární EC před externě indukovaným oxidačním stresem, který může být způsoben kombinovaným účinkem několika bioaktivních sloučenin přítomných v této rostlině. Doposud nebyl mechanistický účinek na proliferaci EC a účinek angiogeneze kůry kořenů Beta vulgaris nedostatečně prozkoumán. Proto jsme se zaměřili na provedení této studie, abychom prozkoumali proliferaci vaskulárních buněk, vývoj mikrotubulů, oxidační stres a kapacitu angiogeneze související s kůrou kořenů Beta vulgaris pomocí analýzy buněčné morfologie a genové exprese v HUVEC. Jsou zkoumány angiogenní účinky methanolového extraktu ze slupek červené řepy spojené s jadernou integritou, vývojem mikrotubulů, mitochondriální účinností a stimulací buněčného cyklu v lidských vaskulárních EC.

2. Materiály a metody

2.1. Příprava Metanolového extraktu z červené řepy (Beta vulgaris rubra L.)

Vzorky čerstvé červené řepy (Beta Vulgaris var. Rubra L.; BVr.) byly původně získány ze skladů zeleniny v Rijádu, Království Saúdské Arábie (KSA). Čerstvá červená řepa byla omyta destilovanou vodou, aby se odstranily stonky a kontaminanty. Vnější slupka byla oloupána, odstraněna a nakrájena na malé kousky. Vzorky byly vysušeny v horkovzdušné sušárně při 40 stupních a poté rozemlety na prášek za použití elektronického mixéru. Poté bylo 500 g prášku extrahováno ve sterilní láhvi obsahující 1 1 methanolu (Sigma, St. Louis, MO, USA) po dobu 24 hodin při teplotě místnosti na třepačce a opakováno třikrát. Poté byl k filtraci extraktu použit Whatmanův filtr (Whatman, Clifton, NJ, USA). Nakonec se snížením tlaku z extraktu oddělí rozpouštědlo a extrakt se shromáždí jako pevná suchá látka po odpaření methanolu. Extrahovaný vzorek byl do dalšího použití uchováván v chladničce při 4 °C.

2.2. Analýza plynovou chromatografií a hmotnostní spektroskopií

Metanolový extrakt ze slupek červené řepy (BPME) byl vstříknut do kapilární kolony oxidu křemičitého (30 m×0,25 mm ID×0,25 um tloušťka filmu) přístroje GC-MS (Agilent 6890N/5973I , Kalifornie, CA, USA) s hmotnostně selektivním detektorem pro detekci chemického složení. Teplota přístroje byla nastavena jako počátečních 70 stupňů, udržování 2 min, na 305 stupňů při 20 stupních/min, následované držením po dobu 1 min. Celková doba běhu GC byla nastavena na 45 minut s plynným heliem (99,999 procent) jako nosným plynem (konstantní průtok 1,2 ml/min), 250 stupňů jako teplota vstřikovače a 230 stupňů jako teplota zdroje iontů. Na základě spektra GC-MS bylo vypočteno relativní procento odpovídající složky a hmotnostní spektra neznámé složky byla identifikována porovnáním se známými 62,000 vzory dostupnými v National Institute of Standard and Technology počítačová knihovna (NIST08).

Cistanche může proti stárnutí

2.3. Materiály a chemikálie pro buněčné kultury

HUVEC byly zakoupeny od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Materiály pro buněčné kultury, jako je Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, trypsin a další byly získány od Gibco (Paisley, UK). Penicilin-streptomycin (PS) a fetální bovinní sérum (FBS) byly zakoupeny od Hyclone Laboratories, USA.co je cistancheChemikálie použité v experimentu molekulární biologie byly získány od Sigma-Aldrich, zejména MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromid], PI a JC-1 barvivo. SYBR Green PCR Master Mix a souprava pro syntézu cDNA byly získány od Qiagen (Hilden, Německo).

2.4.HUVEC

HUVEC byly kultivovány v DMEM a doplněny 1 procentem PS a 10 procenty FBS komplexu. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře při 37 °C, 5 % CO a subkultivovány přibližně každé 3 dny.

2.5. Buněčná životaschopnost a buněčná proliferace pomocí MTT testu

HUVEC (1×104 buňky/jamka) byly kultivovány s udržovacím médiem a ponechány adherovat přes noc v 96-jamkové kultivační destičce. Poté bylo médium nahrazeno novým kultivačním médiem obsahujícím zvyšující se koncentrace BPME (0,0.05,{{10}}.1,0.2 0,4, 0,8, 1,6 a 3,2 ug/ml) podle mapy testovací destičky MTT a inkubovány po dobu 24 a 48 hodin; neošetřené buňky byly použity jako kontroly. Po inkubační době byly experimentální buňky ošetřeny 20 μl/jamku 5 mg/ml MTT （3-【4,5-dimethylthiazol-2-yl】-2, 5-difenyltetrazoliumbromid, který byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO)) a dále inkubován po dobu 4 hodin při 37 stupních. Poté bylo médium odstraněno a vytvořený purpurový formazan byl rozpuštěn ve 100 ul 100% DMSO. Absorbance roztoku byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) při vlnové délce 570 nm. Procento (procento) buněčné proliferace bylo vypočteno podle následující rovnice: (absorbance vzorku/průměrná absorbance kontroly) x 100.

2.6. Experimentální design

Současný test buněčné proliferace testoval nižší koncentraci BPME ({{0}},1 a 0,2 ug/ml) a ukázal proliferující HUVEC a morfologii mikrotubulů bez toxicity. Byly vybrány objemy dávky 0,1 a 0,2 ug/ml BPME a ošetřeny normálními HUVEC a 10 mM H, O,-indukovanými oxidativně stresovanými HUVEC po dobu 48 hodin pro stanovení buněčné proliferace, protizánětlivé , angiogenní a apoptotické potenciály (obrázek 1). Kontrola vehikula byla také udržována po dobu 48 hodin v obou skupinách. Kvercetin （10 μM） byl použit jako referenční kontrola v obou experimentálních skupinách.Čistota proti stárnutíPo inkubaci byly neošetřené a experimentální buňky analyzovány na buněčnou a jadernou morfologii a potenciál mitochondriální membrány pomocí BDM MitoScreen (C-1)Kit; apoptóza byla stanovena metodou buněčného třídění na bázi Annexinu V/apoptózy v průtokové cytometrii. Byl zkoumán oxidační stres a prozánětlivé hladiny genové exprese související s angiogenezí.

2.7. Zkouška barvení propidium jodidem na jaderné poškození

Buněčné morfologie pro charakteristické poškození jádra, pyknózu nebo apoptotické morfologické změny po léčbě {{0}},1 a 0,2 ug/ml BPME (s nebo bez H, O2) v HUVEC byly stanoveny pomocí analýzy barvením PI pod inverzní fluorescenční mikroskopií, jak je popsáno v Leite et al. [27].

2.8. Stanovení potenciálu mitochondriální membrány （△中m） podle JC-1 Dye Stained

Potenciál mitochondriální membrány (△!m) byl stanoven pomocí JC{{0}} testu k posouzení mitochondriální účinnosti v kontrole vehikulem a 0,1 a 0,2 ug/ml HUVEC ošetřených BPME (s a bez H2O2). Stručně, barvicí roztok JC-1 byl smíchán s podobným objemem kultivačního média a poté přidán k experimentálním HUVEC a inkubován ve tmě po dobu 20 minut při 37 stupních. Poté bylo nenavázané barvivo JC-1 dvakrát jemně promyto pomocí 200 μl promývacího pufru pro barvení JC-1 při 4 stupních. Poté byla akumulace j-agregovaného proti barvení JC-1 pozorována pod fluorescenční mikroskopií pomocí fluorescenčního mikroskopu a byly zachyceny snímky. Kromě toho byl potenciál mitochondriální membrány měřen v průtokové cytometrii pomocí soupravy BDIM MitoScreen (JC-1).

2.9. Anexinová analýza vlapoptózy pomocí průtokové cytometrie

Ke kvantifikaci životaschopných, proapoptotických, časně apoptotických a nekrotických buněk byla použita metoda detekční soupravy Annexin V/PI založená na průtokové cytometrii (Sigma Chemicals, USA). HUVEC vyvolané oxidačním stresem (1×10 stupeň/jamka) byly umístěny na 24-jamkové destičky a inkubovány s BPME（0,1 a 0,2 ug/ml）nebo kontrolním vehikulem pro 48 hodin Po inkubaci byly buňky inkubovány ve 400 ul 5 ul Annexin V-fluorescein isothiokyanátu (FITC) a 5 ul vazebného pufru obsahujícího PI; poté byly buňky udržovány po dobu 15 minut při teplotě místnosti (RT) ve tmě. Buňky byly analyzovány průtokovou cytometrií (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), aby se identifikovaly apoptotické (PInegativní a Annexin V pozitivní) a pozdní apoptotické (PI-pozitivní a Annexin V pozitivní) buňky [28].

2.10. Kvantitativní analýza PCR v reálném čase

Kit Fastlane@ Cell to cDNA (Qiagen, Hilden, Německo) byl použit k extrakci celkové RNA a syntéze cDNA z kontroly vehikulem, BPME ošetřených HUVEC (s a bez H-O2) pomocí kvantitativního PCR (qPCR) poloautomatického přístroje (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA). Úrovně exprese oxidačního stresu zahrnují (peroxid lipidů, NOS-3), antioxidant (Nrf-2, GSK-3 a GPx), prozánětlivý (nukleární faktor-k (NF-k ), tumor nekrotizující faktor- (TNF-), interleukin-1 (IL-1), vaskulární buněčný růstový faktor (VEGF), toll-like receptor-4(TLR-4), a vaskulární zánět (intracelulární adhezní molekula (ICAM), vaskulární buněčná adhezní molekula (VCAM), EDN1 a endoteliální oxid dusnatý syntáza (eNOS)) související geny a referenční gen, -aktin, byly analyzovány v HUVEC a kvantifikovány metodou Yuan a spol.

2.11 Statistická analýza

Všechny experimenty byly replikovány a výsledná data byla vyjádřena jako střední hodnoty ± standardní odchylka (SD). Statistická analýza rozdílů mezi skupinami byla provedena jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA) pomocí softwaru SPSS (verze 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).cistanche benefíciosPoté byl proveden Tukeyův test vícenásobného srovnání, pokud byly nalezeny významné rozdíly. Všechny výsledky byly prezentovány jako průměr ± SD pro šest opakování v každé skupině. Hodnota p < 0,05="" byla="" považována="" za="" významnou="">

3. Výsledky

3.1.Bioaktivní molekuly v BPME

Chemické složky BPME byly potvrzeny pomocí GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). Chemické složení extraktu ze slupek červené řepy bylo stanoveno porovnáním dostupných hmotnostních spekter s databází National Institute of Standard and Technology (NIST) Spectral. Výsledky GC-MS potvrdily, že BPME obsahoval hydroxyaceton (8,18), 5-hydroxymethylfurfural (32,6 procenta), methylpyruvát (15,13 procenta), beta-d-allopyranózu (1,48 procenta), furfural (9,98 procenta),{ {15}}hydroxy-gama-butyrolakton (1,32 procenta) a 2,3-dihydro-3.5-dihydroxy-6-methyl-4H-Pyran{ {27}}jedna (12,4 procenta; obrázek 2a, tabulka 1).

3.2. Buněčná proliferace

In vitro buněčný proliferační potenciál BPME proti HUVEC je uveden na obrázku 2b. V experimentálních skupinách nebyla pozorována žádná významná inhibice růstu buněk ve srovnání s kontrolou s vehikulem. Touto studií bylo potvrzeno, že zvýšení koncentrace BPME ošetřeného HUVEC vedlo ke zvýšené buněčné proliferaci a životaschopnosti po 48 hodinách (112 procent) ve srovnání s 24 hodinami (103 procent) léčby. Kromě toho snímky HUVEC ošetřených BPME po 48 hodinách pomocí světelného mikroskopu potvrdily normální buňky s jednotným tvarem morfologie adherentních buněk, byl patrný zvýšený počet proliferujících (replikačních) buněk bez jakéhokoli poškození (obrázek 2c).

3.3. Analýza buněčné a jaderné morfologie, tvorby mikrotubulů a JC-1 Pobyt v HUVECS

Obrázek 3 ukazuje morfologii vývoje mikrotubulů ve fluorescenčních mikroskopických snímcích. H2O2-indukované oxidativně stresované HUVEC vykazovaly špatnou proliferaci a nepravidelnou morfologii adherentních buněk ve srovnání s kontrolními HUVEC. Normální HUVEC ošetřené 0,2 ug/ml BPME vykazovaly proliferující buňky prostřednictvím replikace nebo neogeneze s morfologií mikrotubulů. Mezitím 0.1 ug/ml dávka buněk ošetřených BPME ukázala 1{{1{12}}}}}0 procent adherentních buněk s ranými stádii mikrotubulů. Oxidačně stresované HUVEC ošetřené 0,2 ug/ml BPME identifikovaly proliferující nové buňky s morfologií mikrotubulů a snížené oxidační poškození buněk. Navíc 0,1 ug/ml BPME také zvýšilo normální morfologii vaskulárních buněk s proliferujícími buňkami.

Obrázek 4a ukazuje normální morfologii jaderné struktury s kulovitým tvarem v kontrolních a BPME（0.1 nebo 0.2 ug/ml） ošetřených HUVEC. Obrázek 4b ukazuje obrázky pro PI barvení normálních a HUVEC s oxidačním stresem indukovaným H, O. H2O2-ošetřené HUVECs ukazují jádra s nepravidelnými tvary, vykazující kondenzaci a pyknózu po 3{{10}} } min. Nicméně, 0.2 ug/ml ošetření BPME pro HUVEC pod oxidačním stresem vykazovalo kruhová jádra s normální morfologií. Ve srovnání s 0,2 ug/ml extraktu BPME mělo 0,1 ug/ml BPME menší ochranný účinek proti oxidativnímu stresu vyvolanému H2O2-u HUVEC.

Obrázek 5a ukazuje výsledky barvení JC-1 pro HUVEC, včetně kontrolních buněk a buněk ošetřených BPME; obrázek ilustruje zdravé buňky s aktivními mitochondriemi, jak je potvrzeno záporně nabitým vychytáváním extramitochondriálních lipofilních kationtových JC-1 (zelená barva) a J-agregátů převedených intramitochonem s červenou barvou – opravdu. Obrázek 5b ukazuje výsledky barvení JC-1 pro 0,2 ug/ml BPME podávaného HUVEC s oxidačním stresem indukovaným H2O2; výsledky potvrdily, že téměř 94 procent záporně nabitých mitochondrií přeměnilo lipofilní kationtové JC-1(zelená barva) na červené J-agregáty ve srovnání s léčbou 0,1 ug/ml BPME (61,4 procenta) nebo

Oxidační stres indukovaný HO, v HUVEC (2 procenta). Mitochondriální membránový potenciál (MMP) byl pozorován jako vyšší u buněk ošetřených BPME ve srovnání s referenčním lékem quercetinem.

3.4. Potenciál mitochondriální membrány asistovaný FACS (△pm; BD MitoScan) a analýza annexinu V/apoptózy v HUVEC

Figure 6 shows the mitochondrial membrane potential capacity in BD MitoScan analysis after 0.2 ug/mL of BPME treatment of normal HUVECs and HUVECs with oxidative stress induced by H>O, Zjistili jsme, že 0,2 ug/ml léčby BPME zvýšilo MMP(Aum) na 92,7 procenta ± 3,7 procenta ve srovnání s buňkami HUVEC léčenými samotnou HO2 (27,9 procenta ±7,2 procenta). Naproti tomu buňky ošetřené kvercetinem vykazovaly 41,4 procenta ± 1,6 procenta procenta zvýšené MMP (Aum) ve srovnání s HUVEC ošetřenými BPME a H2O2 nebo H2O2 samotnými.

3.5. Kvantifikace hladin genové exprese v HUVEC

Oxidační stres (LPO3), antioxidant (NOS-3, Nrf-2, GSK-3 a GPX), prozánětlivý (IL-1, TNF-, NF-band TLR{ {7}}) a hladiny exprese mRNA související s VCAM, ICAM, EDN, eNOS) a VEGF mRNA byly kvantifikovány v kontrole s vehikulem, 0,1 a 0,2 ug/ml HUVEC ošetřené BPME a kvercetinem （10 μM） po 48 hodinách (obrázek 8). Zjistili jsme významně (str<0.001) increased="" levels="" of="" lpo,="" nos-3,="" and="" nf-kb.il-1.tnf-α,="" vcam,="" icam,="" edn,="" and="" enos="" expression="" and="" decreased="" nrf-2,="" gsk-3β,="" and="" gpx="" levels="" in="" ho,-induced="" huvecs.="" treatment="" with="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme="" significantly="" decreased="" oxidative="" stress="" and="" vascular="" inflammation="" and="" increased="" antioxidant="" factor-related="" mrna="" expression="" when="" compared="" with="" oxidative-stressed="" huvecs.="" vegf="" expression="" levels="" showed="" a="" significant="" two-fold="" increase="" in="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme-treated="" cells="" only="" when="" compared="" to0.1="" ug/ml="" of="" bpme.="" vegf="" expression="" was="" not="" detected="" in="" huvecs="" with="" oxidative="" stress="" induced="" by="" h2o2.="" the="" observed="" effect="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" 0.1="" ug/ml="" bpme="" or="" quercetin="" (10="">

4. Diskuze

Při extracelulárním nebo intracelulárním stresu biologická dostupnost reaktivních forem kyslíku (ROS) předčí antioxidační obranu a oxidační stres narušuje redoxní signalizaci a kontrolu [31]. Rozvoj oxidačního stresu je spojen s patogenezemi chronických poruch, jako jsou neurodegenerativní onemocnění, diabetes a ateroskleróza. Oxidační stres například iniciuje endoteliální dysfunkci a podporuje systémový zánět a nábor makrofágů [32]. Aktivované imunitní buňky migrují do vaskulatury a uvolňují cytokiny a chemokiny spojené s vazokonstrikcí a remodelací krevních cév buněk hladkého svalstva a zánětem postihujícím buňky hladkého svalstva cév a cévní stěnu [33]. Zvýšený vaskulární oxidační stres končí poškozením cév, ztuhlostí buněk hladkého svalstva a strukturálními abnormalitami elastinu. Kromě toho byl vaskulární oxidační stres stimulován u jiných patologických stavů, jako je viscerální obezita nebo ateroskleróza, kvůli zvýšené aktivitě NADPH oxidázy (NOX-2) v perivaskulární tukové tkáni [34]. Cévní oxidační stres způsobuje zásadní epigenetické změny, ke kterým dochází během stárnutí, a končí procesem časného stárnutí [35].

Rozvoj produkce ROS a oxidačního stresu v biologickém systému do značné míry závisí na mitochondriální dysfunkci, kromě NOX-2, endoteliální xanthinoxidázy, nekondenzované eNOS a lipoxygenázy [36]. Antioxidační vlastnosti dietních látek mohou neutralizovat tvorbu ROS prostřednictvím zvýšené antioxidační kapacity [26]. Extrakt z Ginkgo Biloba chrání před rozvojem aterosklerózy snížením tvorby ROS a aktivity lipoxygenázy u endoteliální dysfunkce indukované OxiLDL [37]. Kromě toho různé fenolické sloučeniny a flavanoidy z jedlých rostlin a zrn mají schopnost vychytávat ROS a peroxidaci lipidů [38]. Metanolový extrakt z červené řepy (Beta vulgaris) má antioxidační potenciál díky vysokému obsahu vlákniny, anthokyanů a flavonoidů, jako je vitexin a betanin [39]. V této studii byl BPME vybrán k identifikaci mitochondriálně závislého mechanistického přístupu k odhalení jeho účinku na potenciál mitochondriální membrány, zhášení LPO a inhibici hladin exprese mRNA souvisejících s vaskulárním zánětem.

Test MTT potvrdil, že BPME významně zvýšil buněčnou proliferaci, což potvrdila zvýšená jaderná integrita při barvení PI účinnou dávkou {{0}},2 ug/ml BPME oproti testovanému 0. 1 ug/ml BPME. Identifikaci účinné dávky s nízkou koncentrací a nejvyšší aktivitou lze považovat za fyziologicky bezpečnou. Našli jsme fluorescenční mikroskopické barvení JC-1 a potenciál mitochondriální membrány byl obnoven jak v normálních, tak HO, indukovaných externě stimulovaných oxidativně stresovaných HUVEC po 0,2 ug/ml BPME. Mitochondriální dysfunkce mění oxidativní fosforylaci, která nedokáže přeměnit kyslíkové (O,.-) radikály na H, O a H, Oby glutathion peroxidázu. Kvůli nedostatečné detoxikaci ROS nebo nekontrolované produkci ROS je zvýšený mitochondriální oxidační stres spojen s aterosklerózou [40]. Extrakty z červené řepy účinně obnovily potenciál mitochondriální membrány, což úspěšně zvýšilo detoxikaci ROS a tvorbu H2O2. Analýza barvení annexinem V/PI potvrdila, že ošetření BPME udrželo procento životaschopných buněk a zvýšilo stadium buněčné proliferace jak u normálních HUVEC, tak u HUVEC s oxidačním stresem indukovaným H202. V této souvislosti Choo a kol. [41] potvrdili, že po vytvoření nadměrného ROS nebo exogenní HO v ischemickém místě mohou transplantované mezenchymální kmenové buňky (MSC) narušit vlastní proliferaci a kapacitu více linií. V regenerativní medicíně jsou buňky hladkého svalstva cév hlavními regulátory kontraktilních tonus tepen prostřednictvím udržování arteriálního periferního odporu, regulátorů krevního tlaku, průtoku krve a opravy tepen [42]. spojené se sníženou buněčnou kontraktilitou a zvýšeným stárnutím buněk. Při nepřetržitém stresu nebo v důsledku snížené mechanosenzitivity je ve starých buňkách hladkého svalstva identifikována snížená adaptace signálů mikroprostředí [43]. Současné výsledky potvrdily, že léčba BPME udržovala životaschopnou buněčnou populaci, jak dokazuje kapacita angiogeneze.

Identifikovaná proliferační kapacita BPME na HUVEC byla podpořena snížením exprese LPO a zvýšenou expresí antioxidačních genů. ROS a LPO jsou zpočátku generovány z mitochondriálního komplexu (I a I) a NOX-4 během buněčné proliferace nebo diferenciace [44]. Nadměrné ROS reagují a poškozují biomolekuly, zejména mění integritu genomové DNA, která je kritická pro buněčnou proliferaci a funkce [45]. Bylo však potvrzeno, že dietní příjem antioxidačních polyfenolů, jako je epigalokatechin a tokoferol, chrání buňky před oxidačním stresem a zvyšuje proliferační kapacitu [46]. V naší studii se hladiny exprese mRNA LPO snížily a bylo zjištěno, že NOS-3, Nrf{5}} a eNOS se zvýšily dvojnásobně v HUVEC s oxidačním stresem vyvolaným Hoo. eNOS je převládající izoforma NOS, zodpovědná za většinu NO. produktů v buňkách hladkého svalstva a vaskulárních tkáních. NE. dilatuje všechny typy cévních cév a chrání agregaci krevních destiček a adhezi leukocytů v EC[47]. Dosud existuje mnoho protichůdných zpráv o kardiovaskulárních rizikových faktorech a endoteliální dysfunkce byla spojena se sníženou nebo zvýšenou expresí eNOS [48]. Zvýšená exprese eNOS byla pozorována při vaskulárním onemocnění, což je pravděpodobně důsledek nadměrné produkce H-Oz. O2-7, produkt dismutace, může zvýšit expresi eNOS prostřednictvím transkripčních a post-transkripčních mechanismů [49]. Patogeneze vaskulárního onemocnění je doprovázena zrychlenou degradací NO. po reakci s O2-7 a nakonec ONOO-forma, což vede k odpojení eNOS a dysfunkci enzymu NOX [50]. Oxidační stres byl potlačen antioxidačními enzymy a hladiny mRNA GSK-3 a GPX byly po léčbě BPME zvýšeny. BPME obsahuje více fytochemikálií, které jsou biologicky aktivní, včetně betalainů, flavonoidů, polyfenolů, terapeutických enzymů, kyseliny askorbové, kyseliny dehydroaskorbové (DHAA) a anorganického nitrátu (NOg), a ty se mohou podílet na upregulaci antioxidační kapacity v HUVEC. V této souvislosti Cha et al. (2014) [51] uvádí, že kyselina chlorogenová účinně chrání před poškozením DNA v lidských keratinocytech vyvolaným oxidačním stresem.

Endotelin-1 (Edn{1}}), vazokonstriktor odvozený z endotelu, provádí migraci buněk hladkého svalstva a působí jako antiapoptotický faktor v buňkách se stresem vyvolaným oxidem dusnatým[52,53]. Procesy vaskulární remodelace, migrace, proliferace a akumulace extracelulární matrix byly stimulovány jak Edn-1, tak NO [54,5]. Pozorovali jsme zvýšenou expresi Edn{9}} po léčbě BPME v HUVEC s oxidačním stresem. Po oxidativním stresu nebo akumulaci LPO je časným stadiem vaskulárního zánětu adheze leukocytů k buňkám endoteliálního hladkého svalstva, což je významné pro kritické události ischemie a aterosklerózy [56]. Je zprostředkována výrazy VCAM a ICAM; byla stimulována mnoha chemokiny a chemotaxními činidly, jako jsou exprese NF-kB, IL-1 a TNF-[57]. Inhibice aktivace IL-1 následované expresí adhezních molekul bylo dosaženo pomocí dietní fenolické sloučeniny kyseliny ellagové [58]. Léčba BPME na externě stimulované HUVEC s oxidačním stresem významně snížila prozánětlivé faktory specifické pro vaskulární buňky, jako jsou hladiny exprese VCAM, ICAM, NF-KB, IL-1 a TNF-x. V této souvislosti Crespo et al. [59] uvedli, že kaempferol a kvercetin inhibovaly prozánětlivé geny, jako jsou exprese VCAM, ICAM, NF-kB a IL-1, v daném pořadí. Celkově inhibice oxidativního stresu a potenciálu genové exprese BPME souvisejícího s vaskulárním zánětem podpořila expresi vaskulárních buněčných růstových faktorů a potenciálně napomohla proliferaci a růstu vaskulárních buněk.

5. Závěry

Současná zjištění potvrzují, že zvýšená exprese antioxidačních genů byla spojena se zhášením oxidačního stresu, což napomáhá překonat poškození proliferace a angiogeneze HUVEC. Černý česnek obsahující hydroxymethylfurfural potlačuje zánětlivý účinek TNF-indukované adheze monocytových buněk k HUVEC a dále potlačuje tvorbu ROS, expresi VCAM-1 a aktivaci NF-kB [60]. Navíc He a spol. [61] potvrdili, že hydroxymethylfurfural má potenciál chránit před hypoxií. Bylo také zjištěno, že slupka červené řepy obsahuje flavonoidy, furan a antioxidační složky, jako je 5-hydroxymethylfurfural, methylpyruvát, furfural a 2,3-dihydro-3,5- dihydroxy-6-methyl-4H-Pyran-4-on; tyto složky jsou zodpovědné za zvýšenou antioxidační kapacitu a potlačení prozánětlivých adhezních molekul buněk hladkého svalstva cév. Slupka červené řepy se používá jako stimulant pro antioxidační zásoby k uhašení vnějšího stimulu nebo vnitřního patologického stimulu peroxidačního buněčného stresu. Naše zjištění prokázala, že složky červené řepy pomáhají snižovat metabolický stres a zánět v HUVEC, což může být přínosné pro proliferaci cévních buněk a angiogenezi.

Tento článek je extrahován z Genes 2021, 12, 1380. https://doi.org/10.3390/genes12091380 https://www.mdpi.com/journal/genes