Beta Vulgaris Rubra L. (řepná řepa) Slupka Metanolový extrakt snižuje oxidační stres a stimuluje buněčnou proliferaci prostřednictvím zvýšení exprese VEGF v H2O2 indukovaných oxidačně stresovaných lidských endoteliálních buňkách pupečníkové žíly
Feb 22, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comvědět víc
Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 a Amna Abdullah Alotiby 2
Abstraktní:Antioxidační kapacita polyfenolů aflavonoidypřítomný v dietních látkách pomáhá zastavit vývoj reaktivních forem kyslíku (ROS) a chránit buňky hladkého svalstva endotelu před oxidativním stresem/indukovanou nekrózou. Červená řepa (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) je běžně konzumovaná zelenina představující bohatý zdrojantioxidanty. Bioaktivní sloučeniny ze slupky červené řepy a jejich role v endoteliálních buňkách lidské pupečníkové žíly (HUVEC) jsou stále nedostatečně prozkoumány. V této studii byl připraven methanolový extrakt z červené řepy (BPME) a jeho vliv na biologickou účinnost, jadernou integritu, potenciál mitochondriální membrány, růst vaskulárních buněk a hladiny genové exprese související s imunoregulací v HUVEC s indukovanouoxidačníbyl analyzován stres. Výsledky plynové chromatografie-hmotnostní spektroskopie (GC-MS) potvrdily, že BPME obsahuje 5-hydroxymethylfurfural (32,6 procenta), methylpyruvát (15,13 procenta), furfural (9,98 procenta) a2,3-dihydro{{11} },5-dihydroxy-6-methyl-4H-Pyran-4-on (12,4 procenta). Extrakt BPM účinně zvýšil buněčnou proliferaci a byl potvrzen testem MTT; jaderná integrita byla potvrzena testem barvení propidium jodidem (PI); mitochondriální membránový potenciál (∆ψm) byl potvrzen testem barvení JC-1. Test Annexin V potvrdil, že HUVEC ošetřené BPME vykazovaly 99 procent životaschopných buněk, ale pouze 39,8 procenta životaschopnosti bylo prokázáno u HUVEC ošetřených samotnou H2O2. Kromě toho BPME ošetření HUVEC po dobu 48 hodin snížilo expresi mRNA peroxidu lipidů (LPO) a zvýšilo NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endoteliální oxid dusnatý syntáza (eNOS a hladiny exprese mRNA vaskulárního buněčného růstového faktoru (VEGF). Zjistili jsme, že léčba BPME snížila prozánětlivé (nukleární faktor-κ (F-κ ), tkáňový nekrotický faktor- (TNF- ), toll-like receptor-4 (TLR-4), interleukin{{37} } (IL-1 )) a cévnízánět(intracelulární adhezní molekula (ICAM), vaskulární buněčná adhezní molekula (VCAM), EDN1, IL-1) související mRNA exprese. Závěrem lze říci, že ošetření slupky červené řepy účinně zvýšilo růstové faktory vaskulárních hladkých buněk a vývoj mikrotubulů, zatímco snížilo vaskulární zánětlivé regulátory. BPM může být prospěšný pro regeneraci hladkých buněk cév, opravu tkání a potenciál proti stárnutí.
klíčová slova:červená řepa; oxidační stres; mitochondrie; angiogeneze; zánět
1. Úvod
Angiogeneze je fyziologický proces vaskulogeneze z existující vaskulatury v těle [1]. Je nezbytný nejen pro embryonální vývoj a reprodukci, ale také pro buněčný cyklus a opravu tkání [2,3]. Je však spojena s patogenezí různých onemocnění, jako je nádorové bujení, revmatoidní artritida a různá ischemická a zánětlivá onemocnění [3–5]. Cévní endotel hraje důležitou roli v udržování vaskulární hemostázy regulací krevního cévního tonu a imunitních a zánětlivých reakcí [6,7]. Endoteliální buňky (EC) jsou tenké monocelulární vrstvy, které vystýlají všechny vnitřní povrchy krevních cév a produkují různé molekuly, které působí lokálně nebo na vzdálených místech [7]. Endotel je zásadní pro tělesnou homeostázu a jakákoli změna v odpovědi endotelových buněk vede k primárním událostem zánětlivých a vaskulárních chorobných procesů, jako je ateroskleróza a hypertenze [6,8,9]. Tato onemocnění způsobují oxidační stres, který mění strukturu EC a funkční integritu a vede k endoteliální dysfunkci [9]. EC lidské pupeční žíly (HUVEC) byly široce používány jako model pro studie související s lidským vaskulárním endotelem. Navíc představují užitečný model pro studium hlavních biologických drah zapojených do funkce endotelu [10]. Bioaktivní sloučeniny a fytochemikálie se hojně nacházejí v ovoci, zelenině, zelených bylinkách a mnoha rostlinách, které vykazují četné zdravotní přínosy, jako jsou protizánětlivé, antioxidační, antikarcinogenní a angiogenní vlastnosti [11–13]. V tomto ohledu patří červená řepa (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) do čeledi Amaranthaceae a je klasifikována jako jeden z nejlepších zdrojů vysokých hladin antioxidantů [14,15]. Konkrétně obsahuje více fytochemikálií, které jsou biologicky aktivní, včetněbetalainyflavonoidy,polyfenoly, terapeutické enzymy, kyselina askorbová, kyselina dehydroaskorbová (DHAA) a anorganický nitrát (NO3) [16–18]. Kromě toho poskytuje cenné základní živiny, jako je draslík, vápník, hořčík, sodík, železo, zinek, fosfor, měď a mangan [19]. Několik studií uvádí, že extrakt z červené řepy (kořen) má četné příznivé účinky díky svým hypoglykemickým, hypolipidemickým, protizánětlivým, antihypertenzním a antiproliferativním vlastnostem [20–22]. Všechny tyto prospěšné vlastnosti mohou být spojeny se schopností bioaktivních sloučenin pohlcovat volné radikály. Konzumace červené řepy je tedy spojena s četnými nutričními a zdravotními přínosy. Díky své nutriční hodnotě může být použit jako funkční zdroj potravy proti oxidativnímu stresu, který vyvolává chronická metabolická onemocnění, jako je diabetes 2. typu a kardiovaskulární onemocnění [23]. Na základě přehledu literatury má Beta vulgaris silné antioxidační, imunoregulační a angiogenní vlastnosti. Apigenin byl nalezen v listech řepy; má antiproliferativní účinky v jaterních a střevních buňkách a může zlepšit komorbiditu obezity indukovanou dietou s vysokým obsahem tuků prostřednictvím aktivace AMPK [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] zjistili, že Beta vulgaris chrání vaskulární EC před externě indukovaným oxidačním stresem, který může být způsoben kombinovaným účinkem několika bioaktivních sloučenin přítomných v této rostlině. Doposud nebyl mechanistický účinek na proliferaci EC a účinek angiogeneze kůry kořenů Beta vulgaris nedostatečně prozkoumán. Proto jsme se zaměřili na provedení této studie, abychom prozkoumali proliferaci vaskulárních buněk, vývoj mikrotubulů, oxidační stres a kapacitu angiogeneze související s kůrou kořenů Beta vulgaris pomocí analýzy buněčné morfologie a genové exprese v HUVEC. Jsou zkoumány angiogenní účinky methanolového extraktu ze slupek červené řepy spojené s jadernou integritou, vývojem mikrotubulů, mitochondriální účinností a stimulací buněčného cyklu v lidských vaskulárních EC.
2. Materiály a metody
2.1. Příprava červené řepy(Beta vulgaris rubra L.) Metanolový extraktVzorky čerstvé červené řepy (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) byly původně získány ze skladů zeleniny v Rijádu, Království Saudské Arábie (KSA). Čerstvá červená řepa byla omyta destilovanou vodou, aby se odstranily stonky a kontaminanty. Vnější kůže byla oloupána, aby byla odstraněna a nakrájena na malé kousky. Vzorky byly sušeny v horkovzdušné sušárně při 40 ◦Ca poté rozemlety na prášek pomocí elektronického mixéru. Poté bylo 5{{10}}}0 g prášku extrahováno ve sterilní lahvičce obsahující 1 l metanolu (Sigma, St. Louis, MO, USA) po dobu 24 hodin při pokojové teplotě na třepačkou a třikrát opakovat. Poté byl k filtraci extraktu použit Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, USA). Nakonec se snížením tlaku z extraktu oddělí rozpouštědlo a extrakt se shromáždí jako pevná suchá látka po odpaření methanolu. Extrahovaný vzorek byl do dalšího použití uchováván v chladničce při 4 ◦C. 2.2. Analýza plynovou chromatografií a hmotnostní spektroskopií Metanolový extrakt ze slupek červené řepy (BPME) byl nastříknut do kapilární kolony s oxidem křemičitým (30 m × {{60}},25 mm ID × 0 tloušťka filmu 0,25 µm) přístroje GC-MS (Agilent 6890N/5973I, Kalifornie, CA, USA) s hmotnostně selektivním detektorem pro detekci chemického složení. Teplota přístroje byla nastavena na počátečních 7{{90}} ◦C, udržování 2 min, na 305 ◦C při 20 ◦C/min, následované držením po dobu 1 min. Celková doba běhu GC byla nastavena na 45 minut s plynným heliem (99,999 procenta) jako nosným plynem (konstantní rychlost 1,2 ml/min), 250 ◦C jako teplota vstřikovače a 230 ◦C jako iontový zdroj teplota. Na základě spektra GC-MS bylo vypočteno relativní procento odpovídající složky a hmotnostní spektra neznámé složky byla identifikována porovnáním se známými 62,000 vzory dostupnými v National Institute of Standard and Technology počítačová knihovna (NIST08). 2.3. Materiály a chemikálie pro buněčné kultury HUVEC byly zakoupeny od American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Materiály pro buněčné kultury, jako je Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, trypsin a další byly získány od Gibco (Paisley, UK). Penicilin-streptomycin (PS) a fetální bovinní sérum (FBS) byly zakoupeny od Hyclone Laboratories, USA. Chemikálie použité v experimentu molekulární biologie byly získány od Sigma-Aldrich, zejména MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazolium bromid], PI a JC-1 barvivo. SYBR Green PCR Master Mix a souprava pro syntézu cDNA byly získány od Qiagen (Hilden, Německo). 2.4. HUVEC HUVEC byly kultivovány v DMEM a doplněny 1 procentem PS a 10 procenty FBS komplexu. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře při 37 ◦C, 5 procentech CO2 a subkultivovány přibližně každé 3 dny. 2.5. Buněčná životaschopnost a buněčná proliferace pomocí MTT testu HUVEC (1 x 104 buněk/jamka) byly kultivovány s udržovacím médiem a ponechány adherovat přes noc na 96-jamkové kultivační destičce. Poté bylo médium nahrazeno novým kultivačním médiem obsahujícím zvyšující se koncentrace BPME (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 a 3,2 ug/ml) podle mapy testovací destičky MTT a inkubováno po dobu 24 a 48 h; neošetřené buňky byly použity jako kontroly. Po inkubační době byly experimentální buňky ošetřeny 20 ul/jamku 5 mg/ml MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-difenyltetrazoliumbromid, který byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO)) a navíc inkubován po dobu 4 hodin při 37 ◦C. Poté bylo médium odstraněno a vytvořený purpurový formazan byl rozpuštěn ve 100 ul 100% DMSO. Absorbance roztoku byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) při vlnové délce 570 nm. Procento ( procento ) buněčné proliferace bylo vypočteno podle následující rovnice: (absorbance vzorku/průměrná absorbance kontroly) x 100. 2.6. Experimentální design Podle předkládaného testu buněčné proliferace vykazovala testovaná nižší koncentrace BPME (0,1 a 0,2 ug/ml) proliferující HUVEC a morfologii mikrotubulů bez toxicity. Byly vybrány objemy dávky 0,1 a 0,2 µg/ml BPME a ošetřeny normálními HUVEC a 10 mM H2O2-indukovanými oxidativně stresovanými HUVEC po dobu 48 hodin, aby se stanovila buněčná proliferace, protizánětlivé, angiogenní a apoptotické potenciály (Obrázek 1). Kontrola vehikula byla také udržována po dobu 48 hodin v obou skupinách. Kvercetin (10 uM) byl použit jako referenční kontrola v obou experimentálních skupinách. Po inkubaci byly neošetřené a experimentální buňky analyzovány na buněčnou a jadernou morfologii a potenciál mitochondriální membrány pomocí soupravy BDTM MitoScreen (JC{105}}); apoptóza byla stanovena metodou třídění buněk založenou na Annexinu V/apoptóze v partnerské cytometrii. Byly zkoumány hladiny genové exprese související s oxidativním stresem, prozánětlivými látkami a angiogenezí.
2.7. Test barvení propidium jodidem na poškození jádra Buněčné morfologie pro charakteristické poškození jádra, pyknózu nebo apoptotické morfologické změny po ošetření 0.1 a 0.2 µg/ml BPME (s nebo bez H2O2) v HUVEC byla stanovena pomocí analýzy barvení PI pod inverzní fluorescenční mikroskopií, jak je popsáno v Leite et al. [27].
2.8. Test potenciálu mitochondriální membrány (∆ψm) pomocí JC-1 Barvení barvivem Potenciál mitochondriální membrány (∆ψm) byl stanoven pomocí testu JC-1 k posouzení účinnosti mitochondrií při kontrole vehikulem a {{4} },1 a 0,2 ug/ml HUVEC ošetřených BPME (s a bez H2O2). Stručně řečeno, barvicí roztok JC-1 byl smíchán s podobným objemem kultivačního média a poté přidán k experimentálním HUVEC a inkubován ve tmě po dobu 20 minut při 37 ◦C. Poté bylo nenavázané barvivo JC{14}} dvakrát jemně promyto pomocí 200 µl promývacího pufru pro barvení JC{16}} při 4 °C. Poté byla akumulace j-agregovaného proti barvení JC-1 pozorována pod fluorescenční mikroskopií pomocí fluorescenčního mikroskopu a byly zachyceny snímky. Potenciál mitochondriální membrány byl navíc měřen průtokovou cytometrií pomocí soupravy BDTM MitoScreen (JC-1).
2.9. Analýza annexinu V/apoptózy pomocí průtokové cytometrie Ke kvantifikaci životaschopných, proapoptotických, časně apoptotických a nekrotických buněk byla použita další metoda detekční soupravy Annexin V/PI založená na cytometrii (Sigma Chemicals, USA). HUVEC vyvolané oxidačním stresem (1 × 105/jamka) byly umístěny na 24-jamkové destičky a inkubovány s BPME (0,1 a 0,2 µg/ml) nebo kontrolním vehikulem pro 48 hodin Po inkubaci byly buňky inkubovány ve 400 ul 5 ul Annexin V-fluorescein isothiokyanátu (FITC) a 5 ul vazebného pufru obsahujícího PI; poté byly buňky udržovány po dobu 15 minut při teplotě místnosti (RT) ve tmě. Buňky byly analyzovány pomocí cytometrie (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), aby se identifikovaly apoptotické (PI negativní a Annexin V pozitivní) a pozdní apoptotické (PI-pozitivní a Annexin V pozitivní) buňky [28].
2.10. Kvantitativní analýza PCR v reálném čase Souprava Fastlane® Cell to cDNA (Qiagen, Hilden, Německo) byla použita k extrakci celkové RNA a syntéze cDNA z kontroly vehikulem, HUVEC ošetřených BPME (s a bez H2O2) pomocí poloautomatické kvantitativní PCR (qPCR). přístroj (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Úrovně exprese oxidačního stresu včetně (peroxid lipidů, NOS-3), antioxidant (Nrf-2, GSK-3 a GPx), prozánětlivý (nukleární faktor-κ (NF-κ), tumor nekrotizující faktor- (TNF-), interleukin-1 (IL-1), vaskulární buněčný růstový faktor (VEGF), toll-like receptor-4 (TLR-4)) a vaskulární zánět (intracelulární adhezní molekula (ICAM), vaskulární buněčná adhezní molekula (VCAM), EDN1 a endoteliální oxid dusnatý syntáza (eNOS)) související geny a referenční gen, -aktin, byly analyzovány v HUVEC a kvantifikovány metodou Yuan a kol. [29]. Hodnoty amplifikace (∆Ct) byly vypočteny jako rozdíl mezi Ct (léčená) a Ct (kontrola). Genová exprese byla vynesena pomocí vyjádření hodnoty 2−∆∆Ct.
2.11. Statistická analýza Všechny experimenty byly triplikovány a výsledná data byla vyjádřena jako střední hodnoty ± standardní odchylka (SD). Statistická analýza rozdílů mezi skupinami byla provedena jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA) pomocí softwaru SPSS (verze 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Poté byl proveden Tukeyův test vícenásobného srovnání, pokud byly nalezeny významné rozdíly. Všechny výsledky byly prezentovány jako průměr ± SD pro šest opakování v každé skupině. P-hodnota < 0.05="" byla="" považována="" za="" významnou="">
Cistanche pro zlepšení imunity
3. Výsledky
3.1. Bioaktivní molekuly v BPME Chemické složky BPME byly potvrzeny pomocí GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). Chemické složení extraktu ze slupek červené řepy bylo stanoveno porovnáním dostupných hmotnostních spekter s databází National Institute of Standard and Technology (NIST) Spectral. Výsledky GC-MS potvrdily, že BPME obsahoval hydroxyaceton (8,18 procenta), 5-hydroxymethylfurfural (32,6 procenta), methylpyruvát (15,13 procenta), beta-d-allopyranózu (1,48 procenta), furfural (9,98 procenta), 2-hydroxy-gama-butyrolakton (1,32 procenta) a 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-Pyran -4-jedna (12,4 procenta; obrázek 2a, tabulka 1). 3.2. Buněčná proliferace Potenciál in vitro buněčné proliferace BPME proti HUVEC je uveden na obrázku 2b. V experimentálních skupinách nebyla pozorována žádná významná inhibice růstu buněk ve srovnání s kontrolou s vehikulem. Touto studií bylo potvrzeno, že zvýšení koncentrace BPME ošetřeného HUVEC vedlo ke zvýšení buněčné proliferace a životaschopnosti po 48 hodinách (112 procent) ve srovnání s 24 hodinami (10}3 procenta) léčby. Kromě toho snímky HUVEC ošetřených BPME po 48 hodinách pomocí světelného mikroskopu potvrdily normální buňky s jednotným tvarem morfologie adherentních buněk, byl patrný zvýšený počet proliferujících (replikačních) buněk bez jakéhokoli poškození (obrázek 2c). 3.3. Analýza buněčné a jaderné morfologie, tvorby mikrotubulů a barvení JC-1 v HUVEC Obrázek 3 ukazuje morfologii vývoje mikrotubulů na snímcích fluorescenčního mikroskopu FL. H2O2-indukované oxidativně stresované HUVEC vykazovaly špatnou proliferaci a nepravidelnou morfologii adherentních buněk ve srovnání s kontrolními HUVEC. Normální buňky HUVEC ošetřené 0,2 ug/ml BPME vykazovaly proliferující buňky prostřednictvím replikace nebo neogeneze s morfologií mikrotubulů. Mezitím dávka 0,1 µg/ml buněk ošetřených BPME ukázala 100 procent adherentních buněk s ranými stádii mikrotubulů. Oxidačně stresované HUVEC ošetřené 0,2 ug/ml BPME identifikovaly proliferující nové buňky s morfologií mikrotubulů a snížené oxidační poškození buněk. Navíc 0,1 ug/ml BPME také zvýšilo normální morfologii vaskulárních buněk s proliferujícími buňkami.
Obrázek 4a ukazuje normální morfologii jaderné struktury s kulovitým tvarem v kontrolních a BPME (0.1 nebo 0.2 ug/ml) ošetřených HUVEC. Obrázek 4b ukazuje obrázky pro PI barvení normálních a HUVEC s oxidačním stresem indukovaným H2O2. HUVEC ošetřené H2O{{10}}ukazují jádra s nepravidelnými tvary, která vykazují kondenzaci a pyknózu po 30 min. Nicméně, 0,2 µg/ml ošetření BPME pro HUVEC pod oxidačním stresem vykazovalo kruhová jádra s normální morfologií. Ve srovnání s 0,2 µg/ml extraktu BPME mělo 0,1 µg/ml BPME menší ochranný účinek proti oxidativnímu stresu vyvolanému H2O2- v HUVEC.
Obrázek 2. Výsledky GC-MS chromatogramu methanolového extraktu ze slupek červené řepy (a), proliferace buněk in vitro (b) a snímky ze světelné mikroskopie pro morfologii buněk (c) v HUVEC, ošetřených zvyšující se koncentrací methanolového extraktu ze slupek červené řepy (BPME ) (jednotný tvar adherentních a proliferujících buněk označený červenou šipkou). Všechny hodnoty jsou průměry ± SD (n=6). * p Menší nebo rovno 0,05 ve srovnání s kontrolou vozidla.
Obrázek 3. Analýza tvorby mikrozkumavek na základě fluorescenční mikroskopie v kontrolním vehikulu, dávka 0.1 a 0.2 µg/ml methanolového extraktu ze slupek červené řepy (BPME) ošetřená normální a H2O{{6} } indukované oxidativně stresované HUVEC po 48 hodinách. Po 48 hodinách vykazovaly H2O2-indukované oxidativně stresované HUVEC změněnou morfologii ve srovnání s kontrolou s vehikulem. Objemy 0,1 a 0,2 µg/ml methanolového extraktu z červené řepy (BPME) ošetřených HUVECs vykazovaly normální morfologii s vaskulárními mikrotubuly s proliferujícími buňkami připomínajícími běžnou morfologii chování buněk hladkého svalstva.
Obrázek 4. Analýza barvení propidium jodidem (PI) pro jadernou morfologii v kontrolním vehikulu, 0.1 a 0.2 µg/ml methanolového extraktu ze slupek červené řepy (BPME) ošetřené normální (3a) a H2O2-indukované oxidativně stresované (3b) HUVEC po 48 hodinách. Při barvení PI kontrola s vehikulem ukázala, že jádro se zdálo být normální bez známek smrštění, pyknózy nebo apoptotického jádra. V samotné H2O2 vykazovaly ošetřené buňky polarizovanou jadernou membránu po 48 hodinách. Léčba 0,2 ug/ml BPME normalizovala H2O2-indukovanou polarizaci jaderné membrány ve srovnání s 0,1 ug/ml BPME nebo quercetinem 10 uM.
Obrázek 5a ukazuje výsledky barvení JC-1 pro HUVEC, včetně kontrolních buněk a buněk ošetřených BPME; obrázek ilustruje zdravé buňky s aktivními mitochondriemi, jak je potvrzeno vychytáváním extramitochondriálního lipofilního kationtového JC-1 (zelená barva) a J-agregátů intramitochondriálně převedených červenou barvou do mitochondrií. Obrázek 5b ukazuje výsledky barvení JC-1 pro 0,2 ug/ml BPME podávaného HUVEC s oxidačním stresem indukovaným H2O2; výsledky potvrdily, že téměř 94 procent záporně nabitých mitochondrií přeměnilo lipofilní kationtové JC-1 (zelená barva) na červené J-agregáty ve srovnání s léčbou 0,1 µg/ml BPME (61,4 procenta) nebo H2O{{20}}indukovaný oxidační stres v HUVEC (2 procenta). Mitochondriální membránový potenciál (MMP) byl pozorován jako vyšší u buněk ošetřených BPME ve srovnání s referenčním lékem quercetinem. 3.4. Potenciál mitochondriální membrány za pomoci FACS (∆ψm; BD MitoScan) a analýza annexinu V/apoptózy v HUVEC Obrázek 6 ukazuje kapacitu potenciálu mitochondriální membrány v analýze BD MitoScan po léčbě 0,2 µg/ml BPME u normálních HUVEC a HUVEC s oxidačním stresem vyvolaným H2O2. Zjistili jsme, že 0,2 µg/ml léčby BPME zvýšilo MMP (∆ψm) na 92,7 procenta ± 3,7 procenta ve srovnání s buňkami HUVEC léčenými samotnou H2O2 (27,9 procent ± 7,2 procenta). Naproti tomu buňky ošetřené kvercetinem vykazovaly 41,4 procenta ± 1,6 procenta procenta zvýšené MMP (∆ψm) ve srovnání s buňkami HUVEC ošetřenými pouze BPME a H2O2 nebo H2O2.
Obrázek 5. Analýza mitochondriálního membránového potenciálu pomocí JC-1 barvení pro kontrolu vehikula, 0.1 a 0.2 µg/ml metanolového extraktu z červené řepy (BPME) ošetřeného normálním (a ) a H2O2-indukované oxidačně stresovanými (b) HUVEC po 48 hodinách. Fluorescenční snímky JC{{1{16}}}}}ukazující sloučené snímky červených a zelených signálů barviva, které odpovídají JC-1 v J-agregátech vs. monomerní formě. Našli jsme méně HUVEC ošetřených samotnými J-agregáty H2O2. V 0,2 µg/ml BPME ošetřených HUVECs vykazujících vysoké j-agregáty přímo reprezentující (vysoký MMP, ∆ψm) vysoký mitochondriální membránový potenciál ve srovnání s 0,1 µg/ml BPME nebo 10 µM kvercetinu.
4. Diskuze
Při extracelulárním nebo intracelulárním stresu biologická dostupnost reaktivních forem kyslíku (ROS) předčí antioxidační obranu a oxidační stres narušuje redoxní signalizaci a kontrolu [31]. Rozvoj oxidačního stresu je spojen s patogenezemi chronických poruch, jako jsou neurodegenerativní onemocnění, diabetes a ateroskleróza. Oxidační stres například iniciuje endoteliální dysfunkci a podporuje systémový zánět a nábor makrofágů [32]. Aktivované imunitní buňky migrují do vaskulatury a uvolňují cytokiny a chemokiny spojené s vazokonstrikcí a remodelací krevních cév buněk hladkého svalstva a zánětem postihujícím buňky hladkého svalstva cév a cévní stěnu [33]. Zvýšený vaskulární oxidační stres končí poškozením cév, ztuhlostí buněk hladkého svalstva a strukturálními abnormalitami elastinu. Kromě toho byl vaskulární oxidační stres stimulován u jiných patologických stavů, jako je viscerální obezita nebo ateroskleróza, kvůli zvýšené aktivitě NADPH oxidázy (NOX-2) v perivaskulární tukové tkáni [34]. Cévní oxidační stres způsobuje zásadní epigenetické změny, ke kterým dochází během stárnutí, a končí procesem časného stárnutí [35]. Rozvoj produkce ROS a oxidačního stresu v biologickém systému do značné míry závisí na mitochondriální dysfunkci, kromě NOX-2, endoteliální xantinoxidázy, nevázané eNOS a lipoxygenázy [36]. Antioxidační vlastnosti dietních látek mohou neutralizovat tvorbu ROS prostřednictvím zvýšené antioxidační kapacity [26]. Extrakt z Ginkgo Biloba chrání před rozvojem aterosklerózy snížením tvorby ROS a aktivity lipoxygenázy u endoteliální dysfunkce indukované OxiLDL [37]. Kromě toho různé fenolické sloučeniny aflavonoidy zjedlé rostliny a zrna mají schopnost vychytávat ROS a peroxidaci lipidů [38]. Metanolický extrakt z červené řepy (Beta vulgaris) má antioxidační potenciál díky vysokému obsahu vlákniny, anthokyanů a flavonoidů, jako je vitexin a betanin [39]. V této studii byl BPME vybrán k identifikaci mitochondriálně závislého mechanistického přístupu k odhalení jeho účinku na potenciál mitochondriální membrány, zhášení LPO a inhibici hladin exprese mRNA souvisejících s vaskulárním zánětem. Test MTT potvrdil, že BPME významně zvýšil buněčnou proliferaci, což potvrdila zvýšená jaderná integrita při barvení PI s účinnou dávkou 0,2 µg/ml BPME oproti testovanému 0,1 µg/ml společnosti BPME. Identifikace účinné dávky s nízkou koncentrací a nejvyšší aktivitou může být považována za fyziologicky bezpečnou. Našli jsme fluorescenční mikroskopické barvení FL JC-1 a potenciál mitochondriální membrány byl obnoven jak v normálních, tak H2O{{10}}indukovaných externě stimulovaných oxidativně stresovaných HUVEC po 0,2 µg/ml BPME léčba. Mitochondriální dysfunkce mění oxidativní fosforylaci, která nedokáže přeměnit kyslíkové (O2·−) radikály na H2O2 a H2O pomocí glutathionperoxidázy. Kvůli nedostatečné detoxikaci ROS nebo nekontrolované produkci ROS je zvýšený mitochondriální oxidační stres spojen s aterosklerózou [40]. Extrakty z červené řepy účinně obnovily potenciál mitochondriální membrány, což úspěšně zvýšilo detoxikaci ROS a tvorbu H2O2. Analýza barvení annexinem V/PI potvrdila, že ošetření BPME udrželo procento životaschopných buněk a zvýšilo stadium buněčné proliferace jak u normálních HUVEC, tak u HUVEC s oxidačním stresem vyvolaným H2O2. V této souvislosti Choo a kol. [41] potvrdili, že po vytvoření nadměrného ROS nebo exogenního H2O2 v ischemickém místě mohou transplantované mezenchymální kmenové buňky (MSC) narušit vlastní proliferaci a kapacitu více linií. V regenerativní medicíně jsou buňky hladkého svalstva cév hlavními regulátory kontraktilních tonus arterií prostřednictvím udržování arteriálního periferního odporu, regulátorů krevního tlaku, krevního partnera a opravy tepen [42]. Navíc věkem indukovaná fenotypová modulace EC je spojena se sníženou buněčnou kontraktilitou a zvýšenou buněčnou senescencí. Při nepřetržitém stresu nebo v důsledku snížené mechanosenzitivity je ve starých buňkách hladkého svalstva identifikována snížená adaptace signálů mikroprostředí [43]. Současné výsledky potvrdily, že léčba BPME udržovala životaschopnou buněčnou populaci, jak dokazuje kapacita angiogeneze. Identifikovaná proliferační kapacita BPME na HUVEC byla podpořena snížením exprese LPO a zvýšenou expresí antioxidačních genů. ROS a LPO jsou zpočátku generovány z mitochondriálního komplexu (I a III) a NOX-4 během buněčné proliferace nebo diferenciace [44]. Nadměrné ROS reagují a poškozují biomolekuly, zejména mění integritu genomové DNA, která je kritická pro buněčnou proliferaci a funkce [45]. Bylo však potvrzeno, že dietní příjem antioxidačních polyfenolů, jako je epigalokatechin a tokoferol, chrání buňky před oxidačním stresem a zvyšuje proliferační kapacitu [46]. V naší studii se hladiny exprese mRNA LPO snížily a bylo zjištěno, že NOS-3, Nrf-2 a eNOS se zvýšily dvojnásobně v HUVEC s oxidačním stresem indukovaným H2O2. eNOS je převládající izoforma NOS, zodpovědná za většinu NO·produktů v buňkách hladkého svalstva a vaskulárních tkáních. NO· rozšiřuje všechny typy cévních cév a chrání agregaci trombocytů a adhezi leukocytů u EC [47]. Dosud existuje mnoho protichůdných zpráv o kardiovaskulárních rizikových faktorech a endoteliální dysfunkce byla spojena se sníženou nebo zvýšenou expresí eNOS [48]. Zvýšená exprese eNOS pozorovaná při vaskulárním onemocnění, což je pravděpodobně důsledek nadměrné produkce H2O2. O2·−, produkt dismutace, může zvýšit expresi eNOS prostřednictvím transkripčních a posttranskripčních mechanismů [49]. Patogeneze vaskulárního onemocnění je provázena zrychlenou degradací NO· po reakci s O2·− a nakonec formou ONOO–, což vede k uncouplingu eNOS a dysfunkci enzymu NOX [50]. Oxidační stres byl potlačen antioxidačními enzymy a hladiny mRNA GSK-3 a GPX byly po léčbě BPME zvýšeny. BPME obsahuje více fytochemikálií, které jsou biologicky aktivní, včetně betalainů, flavonoidů, polyfenolů, terapeutických enzymů, kyseliny askorbové, kyseliny dehydroaskorbové (DHAA) a anorganického nitrátu (NO3), a ty se mohou podílet na upregulaci antioxidační kapacity v HUVEC. V této souvislosti Cha et al. (2014) [51] uvádí, že kyselina chlorogenová účinně chrání před poškozením DNA v lidských keratinocytech vyvolaným oxidačním stresem. Endotelin-1 (Edn{55}}), vazokonstriktor odvozený od endotelu, provádí migraci buněk hladkého svalstva a působí jako antiapoptotický faktor v buňkách se stresem vyvolaným oxidem dusnatým [52,53]. Procesy vaskulární remodelace, migrace, proliferace a akumulace extracelulární matrix byly stimulovány jak Edn{60}}, tak NO [54,55]. Pozorovali jsme zvýšenou expresi Edn-1 po léčbě BPME v HUVEC s oxidačním stresem. Po oxidativním stresu nebo akumulaci LPO je časným stadiem vaskulárního zánětu adheze leukocytů k buňkám endoteliálního hladkého svalstva, což je významné pro kritické události ischemie a aterosklerózy [56]. Je zprostředkována výrazy VCAM a ICAM; byl stimulován mnoha chemokiny a chemotaxními činidly, jako jsou exprese NF-κB, IL-1 a TNF- [57]. Inhibice aktivace IL-1 následované expresí adhezivní molekuly bylo dosaženo pomocí dietní fenolické sloučeniny kyseliny ellagové [58]. Léčba BPME na externě stimulované HUVEC s oxidačním stresem významně snížila prozánětlivé faktory specifické pro vaskulární buňky, jako jsou VCAM, ICAM, NF-κB, IL-1 a hladiny exprese TNF. V této souvislosti Crespo et al. [59] uvedli, že kempferol a kvercetin inhibovaly prozánětlivé geny, jako jsou exprese VCAM, ICAM, NF-κB a IL{78}}. Celkově inhibice oxidativního stresu a potenciálu genové exprese BPME souvisejícího s vaskulárním zánětem podpořila expresi vaskulárních buněčných růstových faktorů a potenciálně napomohla proliferaci a růstu vaskulárních buněk.
5. Závěry
Současná zjištění potvrzují, že zvýšená exprese antioxidačních genů byla spojena se zhášením oxidačního stresu, což napomáhá překonat poškození proliferace a angiogeneze HUVEC. Černý česnek obsahující hydroxymethylfurfural potlačuje zánětlivý účinek TNF-indukované adheze monocytových buněk k HUVEC a dále potlačuje tvorbu ROS, expresi VCAM-1 a aktivaci NF-κB [60]. Navíc He a spol. [61] potvrdili, že hydroxymethylfurfural má potenciál chránit EC před hypoxií. Bylo také zjištěno, že slupka červené řepy obsahuje flavonoidy, furan a antioxidační složky, jako je 5-hydroxymethylfurfural, methylpyruvát, furfural a 2,3-dihydro-3,5- dihydroxy-6-methyl-4H-Pyran-4-on; tyto složky jsou zodpovědné za zvýšenou antioxidační kapacitu a potlačení prozánětlivých adhezních molekul buněk hladkého svalstva cév. Slupka červené řepy se používá jako stimulant pro antioxidační zásoby k uhašení vnějšího stimulu nebo vnitřního patologického stimulu peroxidačního buněčného stresu. Naše zjištění prokázala, že složky červené řepy pomáhají snižovat metabolický stres a zánět v HUVEC, což může být přínosné pro proliferaci cévních buněk a angiogenezi.
Příspěvky autora:
Konceptualizace, LNA-H. a S.-BP; metodika, LNA-H. a S.-BP; software, GS; validace, LNA-H. a S.-BP; formální analýza, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) a GS; výzkum, LNA-H., S.-BP a AMA-D.; zdroje, LNA-H.; data curation, S.-BP a LNA-H.; psaní — příprava původního návrhu, LNA-H. a S.-BP; psaní – recenze a úpravy, LNA-H., AMS, GS a AAA (Amna Abdullah Alotiby); vizualizace, S.-BP a AAA (Ali A Alshatwi); dohled, LNA-H., a S.-BP; administrace projektu, LNA-H.; akvizice financování, LNA-H. Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ní. Financování: Autoři děkují Deanship of Scientific Research na Univerzitě krále Sauda za financování této práce prostřednictvím výzkumné skupiny č. RG-1442-432. Prohlášení institucionální revizní rady: Neuplatňuje se. Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se. Prohlášení o dostupnosti dat : Údaje uvedené v této studii jsou k dispozici na vyžádání od příslušného autora. Střet zájmů: U této studie neexistuje žádný střet zájmů.
Reference
1. Abdolmaleki, Z.; Arab, H.-A.; Amanpour, S.; Muhammadnejad, S. Antiangiogenní účinky etanolového extraktu Artemisia sieberi ve srovnání s jeho účinnou látkou, artemisininem. Rev. Bras. Farmacogn. 2016, 26, 326–333. [CrossRef]
2. Yoo, SY; Kwon, SM Angiogeneze a její terapeutické možnosti. Mediat. Inflflamm. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angiogeneze u nádorových, cévních, revmatoidních a jiných onemocnění. Nat. Med. 1995, 1, 27–31. [CrossRef]
4. Hoeben, A.; Landuyt, B.; Highley, MS; Wildiers, H.; Van Oosterom, AT; De Bruijn, EA Vaskulární endoteliální růstový faktor a angiogeneze. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549–580. [CrossRef]
5. Ferrara, N.; Alitalo, K. Klinické aplikace angiogenních růstových faktorů a jejich inhibitorů. Nat. Med. 1999, 5, 1359–1364. [CrossRef]
6. kuchyně, HF; Webster, NR Fyziologie endotelu. Br. J. Anaesth. 2004, 93, 105–113. [CrossRef]
7. Onat, D.; Brillon, D.; Colombo, PC; Schmidt, AM Lidské vaskulární endoteliální buňky: Modelový systém pro studium vaskulárního zánětu u diabetu a aterosklerózy. Curr. Diabetes rep. 2011, 11, 193–202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Zánět při ateroskleróze: Od vaskulární biologie k objevu biomarkerů a predikci rizika. Clin. Chem. 2008, 54, 24–38. [CrossRef]
9. Esper, RJ; Nordby, RA; Vilariño, JO; Paragano, A.; Cacharrón, JL; Machado, RA Endoteliální dysfunkce: Komplexní hodnocení. Cardiovasc. Diabetol. 2006, 5, 4. [CrossRef]
10. Baudin, B.; Bruneel, A.; Bosselut, N.; Vaubourdolle, M. Protokol pro izolaci a kultivaci endoteliálních buněk lidské pupečníkové žíly. Nat. Protoc. 2007, 2, 481–485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Angiogeneze inhibována pitím čaje. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Antioxidační a prooxidační vlastnosti kyseliny askorbové a kyseliny gallové. Food Chem. 2002, 79, 307-313. [CrossRef]
13. Dhalaria, R.; Verma, R.; Kumar, D.; Puri, S.; Tapwal, A.; Kumar, V.; Nepovímová, E.; Kuca, K. Bioaktivní sloučeniny jedlého ovoce s jejich vlastnostmi proti stárnutí: Komplexní přehled k prodloužení lidského života. Antioxidanty 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Nutriční, bioaktivní a fyzikálně-chemické vlastnosti různých přípravků z červené řepy. Food Addict. 2017, 6. [CrossRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. O vývoji chování při páření u stromů: Predace nebo počasí? Dopoledne. Nat. 1992, 139, 6. [CrossRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, VMF Betanin jako multipath oxidační stres a modulátor zánětu: Pigment z červené řepy s ochrannými účinky na patogenezi kardiovaskulárních onemocnění. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2020, 1–16. [CrossRef]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Pozoruhodná zelenina: Jeho obsah dusičnanů a fytochemikálií lze upravit v nových formulacích, aby prospíval zdraví a podporoval terapii kardiovaskulárních onemocnění. Antioxidanty 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Saad, HH; Soliman, MM; El-Raey, MA; Shehata, SM; Barakat, A.; Yasir, A.; Sobeh, M. HPLC-ESI-MS/MS analýza listů řepy (Beta vulgaris) a jejích prospěšných vlastností u krys s diabetem 1. typu. Biomed. Pharmacother. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singh, B.; Nathan, BS Chemické složení, funkční vlastnosti a zpracování červené řepy - přehled. Int. J. Sci. Ing. Res. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. Nutriční a funkční potenciál Beta vulgaris cicla a rubra. Fitoterapie 2013, 89, 188–199. [CrossRef]