Beta-glukan zlepšil imunitní odpověď na vakcínu proti newcastleské chorobě a změnil expresi MRNA sleziny u kuřat

ABSTRAKTNÍ

Tato studie byla provedena za účelem zjištění účinku perorálního podávání b-glukanu (G70), produktu získaného z buněčné stěny kvasinek, na titry specifické inhibice hemaglutinace (HI) viru newcastleské choroby (NDV), proliferaci lymfocytů a úloha subpopulací T lymfocytů u kuřat léčených živou vakcínou proti NDV. Kromě toho byl zkoumán vliv b-glukanu na expresi genu ve slezině pomocí sekvenování transkriptomu. Výsledky odhalily, že suplementace b-glukanu zvýšila titr sérového NDV HI, zvýšila NDV stimulační index lymfocytů v periferní krvi a střevním traktu a podpořila diferenciaci T lymfocytů na CD4+ T buňky. Analýza sekvenování RNA (RNA-seq) ukázala, že G70 upreguloval mRNA exprese související s receptorem spojeným s G-proteinem a polypeptidem MHC třídy I a downreguloval mRNA exprese související s katelicidinem a betadefensinem. Imunomodulační účinek G70 může fungovat prostřednictvím mitogenem aktivované proteinkinázové signální dráhy. Abychom to shrnuli, G70 by mohl zvýšit imunologickou účinnost živé NDV vakcíny u kuřat a mohl by být aplikován jako potenciální adjuvantní kandidát v drůbežářském průmyslu.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Klíčová slova: vakcína proti newcastleské chorobě, beta-glukan, adjuvans, černé kuře, RNA-seq

ÚVOD

Polysacharidy buněčné stěny kvasinek jsou přímo riginovány z buněčné stěny Saccharomyces cerevisiae a jsou široce využívány jako stimulátory růstu, antimikrobiální látky nebo imunomodulátory u drůbeže ke zlepšení produkce a zdraví (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021). Dříve bylo prokázáno, že produkt s názvem PW220, který obsahuje polysacharidy buněčné stěny kvasinek, zesiluje imunitní odpověď vyvolanou virem newcastleské choroby (NDV) a mění mikrobiální komunitu slepého střeva kuřat při orálním podání (Bi et al., 2020 ). Polysacharidy buněčné stěny kvasinek jsou primárně tvořeny b-glukanem a mannan-oligosacharidy (Wang et al., 2018). V této studii byl b-glukan zkoumán pro svůj účinek na imunitní odpověď na vakcínu proti NDV u kuřat. Slezina je klíčový orgán pro zahájení imunitní reakce. Nedávná studie ukázala, že PW220, což je produkt buněčné stěny kvasinek, upreguloval expresi mRNA TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 a T-bet ve slezině kuřat ( Bi a kol., 2022). Je však třeba objasnit konkrétní mechanismus. Sekvenování RNA (RNA-seq) je jednou z vysoce výkonných technologií, které lze použít k testování kvantitativní genové exprese a poskytují analýzu různých profilů exprese na úrovni celého transkriptomu (Zhao et al., 2018). S výhodami vysoké citlivosti a nízkých nákladů byla RNA-seq široce používána ve studiích hospodářských zvířat a drůbeže (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). V této studii byl tedy hodnocen účinek podávání b-glukanu na titry inhibice hemaglutinace (HI) specifické pro NDV, proliferaci lymfocytů a subpopulace T-lymfocytů u kuřat orálně vakcinovaných vakcínou NDV. Dále byla transkriptomová analýza použita k vyhodnocení účinku b-glukanu na genovou expresi a základní signální transdukční dráhy ve slezině kuřat.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Zvířata

Jednodenní komerční kuřata s černou kostí (samci) byla získána od Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, Čína). Kuřata byla rozdělena do drátěných klecí umožňujících volný přístup ke krmivu a vodě. Během prvních 7 dnů byla pokojová teplota udržována na 33 °C až 35 °C Cand, poté postupně klesala o 1 °C každé 2 dny až do 27 °C. Všechna kuřata byla zpracována podle standardů stanovených organizací Southwest University Animal Care a Výbor pro používání (číslo etického certifikátu: IAC-2021-0057). Všichni experimentální ptáci byli na konci studie usmrceni CO2.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Vakcína

Živou vakcínu NDV (Strin La Sota) poskytla společnost Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Čína).

Reagencie 

Produkt buněčné stěny kvasinek (YP) G70 byl získán z buněčné stěny kvasinek (Saccharomyces cerevisiae), která obsahuje b-glukan (Větší nebo rovný 70 %) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Čína). Jak antigenní, tak pozitivní kontrolní séra pro měření NDV-specifických HI titrů byly zakoupeny od Qingdao Regen Diagnostics Development Center (Qingdao, Čína). Anti-chicken CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) a CD8- PE (L{{14 }}TH49T) u krys byly nabízeny společností Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Čína).

Experimentální design

48 kuřat s černou kostí ve věku 5 dnů bylo náhodně rozděleno do 3 skupin (tabulka 1) a dostávala buď základní dietu (tabulka 2), nebo základní dietu s 0,1 % G7{{10} } (b-glukan, 0,7 g/kg) suplementace po dobu trvání tohoto výzkumu. Skupina H (G70 + vakcína) a C (vakcína) byly orálně imunizovány NDV vakcínou 14. a 28. den, v daném pořadí. Skupina S (Sailne) byla ošetřena stejným objemem fyziologického roztoku. Vzorky krve byly odebrány venepunkcí z křídla ve věku 5, 7, 14, 21, 28, 35 a 42 dnů pro testování HI titru. Sedm dní po posilovací vakcinaci bylo náhodně vybráno 8 kuřat v každém sloupci a utraceno zadušením pomocí CO2. Lymfocyty byly separovány jak z periferní krve, tak z jejuna za účelem provedení proliferace lymfocytů a analýzy průtokové cytometrie. V případě odběru z jejuna byl duodenální závěsný vaz výchozím bodem jejuna a z počátečního bodu jejuna byl odebrán řez o délce 5 cm. Slezina byla rychle zmražena v kapalném dusíku a poté uložena při -80 stupni pro RT-qPCR a sekvenční profilování.

Tabulka 1. Návrh experimentu

Tabulka 2. 1 Složení a obsah živin v experimentální bazální dietě brojlerů.

HI Studie

Test na NDV-specifické HI titry v séru byl proveden podle předchozího popisu (Ball et al., 2019). Stručně řečeno, sérum bylo naředěno fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) od 1:2 do 1:1 024 v mikrotitrační destičce se dnem V 96-. Poté bylo přidáno 25 ml ředění NDV na jamku a inkubováno při 37 stupních po dobu 30 minut. Poté bylo do každé jamky přidáno 25 ml 1% suspenze kohoutích erytrocytů a inkubováno při 37 stupních po dobu 30 minut. Všechny vzorky byly testovány dvakrát a na každé destičce byly zahrnuty pozitivní i negativní kontroly. HI titry byly založeny na největším ředění, které vedlo k úplné inhibici hemaglutinace. Průměrný HI titr a standardní chyba (SE) byly měřeny na skupinu.

Izolace lymfocytů z periferní krve

Lymfocyty byly izolovány a shromážděny z lymfocytů periferní krve pomocí soupravy Lymphocyte Separation Medium Kit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Čína). Poté byly lymfocyty uloženy v suspenzi s médiem RPMI 1640 (Solarbio, Peking, Čína) včetně 5% fetálního telecího séra a 25 mM HEPES (pH 7,0).

Izolace lymfocytů z jejuna

Proces přiřazení byl proveden v souladu s předchozím popisem as mírnými úpravami (Yuan et al., 2020). Stručně řečeno, použijte 70 mm buněčný filtr k rozdělení střeva na 4 ml studeného PBS. Poté byla suspenze vzorků buněk odstředěna při 4500 otáčkách za minutu po dobu 12 minut s odstraněním supernatantu. Poté resuspendujte střevní buňky na plné médium (Solarbio Co., Peking, Čína) sestávající z 5% fetálního bovinního séra (FBS) v RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, Čína). Nakonec souprava pro izolaci kuřecích lymfocytů (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) k oddělení lymfocytů. střevní tkáň byla rozdělena do 4 ml studeného PBS pomocí 70 mm buněčného filtru. Dále byla suspenze vzorků buněk centrifugována při 4500 ot./min po dobu 12 minut a supernatant byl odstraněn. Poté byly střevní buňky resuspendovány v RPMI 1640 (Solarbio Co.) obsahujícím 5% FBS (Sijiqing Co.). Nakonec byly lymfocyty separovány za použití soupravy pro izolaci kuřecích lymfocytů (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Proliferace lymfocytů 

Buňky byly nasazeny na 96-jamkové destičky (5£105 na jamku), stimulovány antigenem inaktivovaného NDV pro 4 hemaglutinační jednotky nebo stejný objem fyziologického roztoku. Každý vzorek byl testován ve 3 replikátech. Buňky a antigen byly inkubovány po dobu 44 hodin při 37 stupních v 5% CO2 a poté bylo do každé jamky přidáno 50 ml methylthiazolyltetrazolia (MTT) (2 mg/ml) a inkubováno další 4 hodiny. Vzorky byly centrifugovány při 1200 £ g po dobu 8 minut při vnitřní teplotě. Poté byl supernatant opatrně odstraněn a do každé jamky bylo přidáno 100 ml DMSO. Destičky byly třepány po dobu 8 minut, aby se krystaly plně rozpustily. Nakonec byla zaznamenána průměrná optická hustota (OD) při 570 nm. Stimulační index (SI) byl získán pomocí rovnice: hodnoty OD stimulovaných jamek/hodnoty OD nestimulovaných jamek (Cui et al., 2020).

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Analýza průtokovou cytometrií subpopulací T-lymfocytů

Suspenze lymfoidních buněk byly izolovány a dvakrát promyty PBS. Koncentrace buněk byla upravena na 106/ml a poté udržována na ledu. Každý vzorek byl obarven 2 ml potkaního anti-kuřecího CD3-APC, CD4- FITC a potkaního anti-kuřecího CD8-PE za podmínek nepropustných pro světlo po dobu 30 minut, poté 2 promytí PBS. Buňky byly testovány pomocí průtokové cytometrické analýzy na průtokovém cytometru (BD Bioscience, San Jose, CA).

Analýza RT-qPCR

Celková RNA byla odvozena ze sleziny pomocí činidla TRIzol (Takara, Shiga, Japonsko) podle pokynů výrobce a poté převedena na cDNA pomocí PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, Čína) na tepelném cykléru T100 (Bio-Rad, Hercules, CA). Kuřecí beta-aktin byl použit jako vnitřní kontrolní gen. RT-qPCR vybraných genů byla provedena na Multiple Real-Time PCR System (AB, Carlsbad, CA) s SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). K posouzení kvantitativní variace byla provedena relativní kvantitativní metoda (244CT) (Bi et al., 2022). Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 3.

Extrakce RNA

Každý ze 3 vzorků sleziny ze skupiny H (G70 +vakcína) a skupiny C (vakcína) byl použit pro RNA-seq s činidlem TRIzol (Takara). Poté byla RNA testována na kontaminaci a degradaci pomocí 1% agarózového gelu a čistota RNA byla analyzována pomocí spektrofotometru NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA). Koncentrace RNA byla stanovena pomocí Qubit RNA Assay Kit v Qubit 2.0 Fluorometr (Life Technologies, Carlsbad, CA). Integrita RNA byla měřena pomocí RNA Nano 6000 Assay Kit systému Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Výsledky ukázaly, že RNA byla kompletní a bez kontaminace DNA.

Analýza transkriptomu

Sekvenování transkriptomu, sestavení sekvencí a analýza dat poskytla společnost Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Peking, Čína). Hlavní postupy pro transkriptom byly uvedeny následovně: 1) Purifikace mRNA z celkové RNA byla provedena pomocí magnetických kuliček připojených k poly-T oligo. Fragmentace byla provedena s divalentními kationty v NEB Next First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) při vysoké teplotě. 2) První vlákno cDNA bylo syntetizováno pomocí náhodného hexamerového primeru a Moloneyho myšího leukemického viru (M-MuLV) Reverse. Syntéza druhého vlákna cDNA byla poté syntetizována pomocí DNA polymerázy I a RNázy H. 3) Zbývající převisy byly transformovány na tupé konce prostřednictvím aktivit exonukleázy/polymerázy. Struktura vlásenkové smyčky NEB Next Adapter byla poté ligována pro přípravu na hybridizaci po adenylaci 3' konce DNA fragmentů. 4) Bylo získáno přibližně 250 až 300 bp cDNA fragmentů a knihovna byla purifikována pomocí systému AMPure XP společnosti Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA). Poté byly aplikovány 3 ml NEBU SER Enzyme (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) s cDNA s vybranou velikostí, navázanou na adaptér při 37 °C po dobu 15 minut a následně 5 minut při 95 °C. PCR amplifikace byla provedena pomocí Phusion High-Fidelity DNA polymerázy. Nakonec byly produkty PCR purifikovány (systém AMPure XP) a kvalita knihovny byla odhadnuta pomocí systému Agilent Bioanalyzer 2100. Shlukování indexově kódovaných vzorků bylo provedeno na TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA). Poté bylo sekvenování provedeno na platformě Illumina Novaseq a byla generována 150 bp čtení párového konce. Soubory anotací referenčního genomu a genového modelu byly staženy z webu genomu (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ a ftp://ftp. ensembl.org/ pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Index referenčního genomu byl stanoven pomocí HISAT2 (v2.0.5) a párové konce čistého čtení byly porovnány s referenčním genomem. Počet čtení mapovaných ke každému genu a Fragmenty na kilobáze na milion (FPKM) pro každý gen na základě délky genu a počtu čtení mapovaných ke genu byly vypočteny pomocí Feature Counts v1.5.{{38} }p3. Diferenciální exprese mezi skupinou H (G70 + Vaccine) a skupinou C (Vaccine) byla odvozena pomocí balíčku DESeq2 R (1.16.1). Geny s P < 0,05 a |log2 (násobná změna)| > 1 byly definovány jako diferenciální expresní geny (DEG).

Tabulka 3. Sekvence primerů pro RT-qPCR.

Kvantitativní PCR v reálném čase Validace 

Dva up-regulované stupně a 4 down-regulované stupně ve srovnání skupiny H (G70 + vakcína) vs. skupina C (vakcína) byly vybrány pro potvrzení výsledků sekvenování transkriptomu pomocí RT-qPCR. RNA byla převedena na cDNA pomocí PrimeScript RT Master Mix (Takara) na tepelném cykléru T100 (Bio-Rad). Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 3. Jako vnitřní kontrolní gen byl použit kuřecí b-aktin. RT-qPCR vybraných genů byla provedena na Multiple real-time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) s SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). K posouzení odchylky v kvantifikaci byla použita relativní kvantitativní metoda (244CT). Všechny vzorky byly pro analýzu provedeny trojmo.

Statistická analýza

Jednocestná ANOVA s Duncanovým post hoc testem byla použita pro vícenásobná srovnání mezi skupinami pomocí softwaru SPSS (verze 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Údaje jsou vyjádřeny jako průměr § SE. Hodnota P < 0,05 byla považována za statisticky významnou.

VÝSLEDKY Vliv b-glukanu na titry sérových protilátek

Jak je znázorněno na obrázku 1, titry Hl specifické pro NDV se snížily ve všech skupinách před vakcinací a zvýšily se ve skupinách H (G70+vakcína) a C (vakcína) po imunizaci. Je zajímavé, že vyšší titry HI byly pozorovány ve skupině H (G70+Vakcína) při 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{{{101} 14}}5), 35 (P > 0,05) a 42 (P > 0,05) d věku než ve skupině C (vakcína).

Vliv b-glukanu na proliferaci lymfocytů

Účinek G70 na proliferaci lymfocytů periferní krve je znázorněn na obrázku 2A. SI v krevních lymfocytech byl zvýšen u ptáků suplementovaných G70 (G70 + vakcína) v 7. den (P < 0,05) po posilovací imunizaci ve srovnání se skupinou s vakcínou. Kromě toho byl SI v jejunálních lymfocytech významně zvýšen v 7 dnech (P < 0,05) po posilovací imunizaci ve srovnání se skupinou s vakcínou (obrázek 2B).

Vliv b-glukanu na poměr CD4 +/CD8 + T buněk v periferní krvi 

Obrázky 3A a 3B ukazují hradlování lymfocytů a CD3 + buněk a obrázky 3C až 3E ukazují poměr CD4 +/CD8 + T buněk v G70, vakcína, respektive fyziologický roztok. Jak ukazuje obrázek 3F, po posilovací imunizaci nebyl žádný významný rozdíl mezi skupinou s vakcínou a skupinou s fyziologickým roztokem (P > 0,05), zatímco podíl CD4 +/CD{{12} } T buňka byla zjevně vyšší ve skupině G70 (G70 + Vaccine) než ve skupině vakcíny (P < 0,05).

Obrázek 1. Účinek orálního podání b-glukanu na titry sérových protilátek proti NDV vakcíně. Údaje jsou vyjádřeny jako průměr § SE.

Související genová exprese

Jak je znázorněno na obrázku 4, významně se zvýšila mRNA exprese TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5) a TLR5 (P < 0.05) byl detekován ve slezině kuřat léčených G70 (G70 + vakcína) ve srovnání se skupinou s vakcínou. Nebyl nalezen žádný významný rozdíl v expresi mRNA IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) a TLR3 (P > 0,05) ve slezině mezi G70 (G70 + vakcína) a vakcínou skupiny.

Analýza dat sekvenování RNA 

Sekvenování RNA z 8 knihoven sleziny poskytlo 24,1 G nezpracovaných dat, jak je uvedeno v tabulce SI doplňkového materiálu. CN znamená skupinovou vakcínu a HN znamená skupinu G70 + vakcíny. Knihovna C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3, respektive H4, se skládá z 45,591,492, 47,424,782, 46,193,492, 54,403,376, 47,118,476, 45,44,899 a 45,44,899 38 původních přečtení. Po aptameru byly nejednoznačné sekvence a sekvence nízké kvality odstraněny a zůstalo 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566, 4290, 4290, 61, 0 Více než 96 % čistých čtení bylo mezi původními čteními a 8 knihoven bylo porovnáno pomocí HISAT2 pro sekvenování čtení proti referenční databázi sestávající z genomu Gallus. Dále byla čistá čtení mapována do této databáze ve více než 95 % případů. Specifické pro knihovny z Cl, C2, C3, C4, Hl, H2, H3 a H4 byly 40,921,384 (92,9 %), 41,302,100 (90,87 %), 40,771,075 (92,11 %), 426,904,305, 426,904,3 2 %), 40 213 444 (90,23 %), 40 922 895 (92,77 %) a 40 971 972 (93,06 %) čtení bylo přiřazeno jedinečně do referenční databáze.

Diferenciálně vyjádřené geny

Jak je uvedeno na obrázku 5A, bylo identifikováno celkem 198 odlišně exprimovaných genů, včetně 47 up-regulovaných genů a 151 down-regulovaných genů. Stupně byly podrobně popsány v tabulce S2 doplňkového materiálu. Obrázek 5B ukazuje, že DEG mají dobrou reprodukovatelnost ošetření.

Analýza klasifikace genové ontologie a kjótská encyklopedie obohacování genů a genomů

Geny, které jsou odlišně exprimovanými geny, byly klasifikovány do 3 hlavních funkčních kategorií na základě klasifikačního systému genové ontologie (GO): biologický proces, buněčná složka a molekulární funkce. Top 10 GO termínů ve 3 kategoriích je uvedeno na obrázku 6. Převládaly geny zapojené do „odpovědi na humorální imunitu“, „chemokinové reakce“, „reakce na antimikrobiální humorální“, „obranné reakce proti bakterii, ""imunitní odpověď na antimikrobiální humor zprostředkovanou antimikrobiálními peptidy", "obranná odpověď proti gramnegativní bakterii" a "obranná odpověď proti grampozitivní bakterii" v kategorii biologických procesů. Kromě toho, v kategorii molekulární funkce, pozoruhodný poměr genů souvisel s „vazbou chemokinového receptoru motivu CC (CCR) k chemokinovému receptoru“, „vazbou chemokinového receptoru“ a „vazbou lipopolysacharidů“. Kromě toho „komplex mitochondriálního dýchacího řetězce I“, „komplex NADH dehydrogenázy“ a „respirační řetězec“ byly nejdominantnější obohacené termíny v kategorii buněčných komponent. Analýza dráhy Kjótské encyklopedie genů a genomů byla také provedena na odlišně exprimovaných genech. Výsledky naznačují, že geny byly seskupeny hlavně do 7 drah, včetně "Neuroaktivní interakce ligand-receptor", "Gap junction", "mitogenem aktivovaná proteinkináza (MAPK) signalizační dráha", "ABC transportéry", "Biosyntéza aminokyselin," "Lékový metabolismus" a "Export bílkovin."

Obrázek 2. Účinek perorálního podávání b-glukanu na index stimulace lymfocytů (SI). (A) Lymfocyty periferní krve; (B) střevní lymfocyty. Údaje jsou vyjádřeny jako průměr § SE.

Obrázek 3. Vliv perorálního podání b-glukanu na poměr CD4+/CD8+ buněk v periferní krvi. (A) Brána na lymfocytech; (B) hradlo na CD3+ T buňkách; (C) frekvence CD3+CD4 +CD8 + T buněk ve skupině G70+vakcíny; (D) frekvence CD3+ CD4 + CD8 + T buněk ve skupině vakcín; (E) frekvence CD3+ CD4 + CD8 + T buněk ve skupině fyziologického roztoku; (F) sloupcový diagram představující poměr CD4+/CD{19}}. Údaje jsou vyjádřeny jako průměr § SE.

Obrázek 4. Účinek orálního podání b-glukanu na expresi mRNA v kuřecí slezině. Údaje jsou vyjádřeny jako průměr § SE.

Obrázek 5. Souhrn dat RNA-Seq. (A) Seznam odlišně exprimovaných genů, (B) shluková mapa DEG.

Ověření genů vyjádřených diferencovaně pomocí RT-qPCR

6 stupňů, které byly up- nebo down-regulované, byly potvrzeny kvantitativní PCR v reálném čase. Výsledek naznačoval, že data RT-qPCR byla obecně v souladu s daty RNA-seq obecně, což ukazuje na spolehlivý výsledek sekvenování (obrázek 7). Exprese mRNA genů asociovaných s dráhou MAPK Jak je znázorněno na obrázku 8, významně se snížila mRNA exprese FAS (P < 0.05) a CACNA2 (P < 0,05). detekovaný ve slezině kuřat ve skupině G70 (G70 + vakcína) ve srovnání se skupinou vakcíny. Navíc byla ve skupině G70 (G70 + vakcína) detekována numericky zvýšená exprese mRNA DUSP5 a DUSP4 a numericky snížená exprese mRNA p38, JNK a ERK ve srovnání se skupinou vakcíny (P > 0,05) .

DISKUSE

Živá vakcína proti ND je široce naočkována na kuřecích farmách, a přesto stále dochází k sporadickým propuknutím newcastleské choroby v imunizovaných hejnech drůbeže (Zhang et al., 2022). Optimální vakcíny jsou definovány tak, aby stimulovaly buněčnou a slizniční imunitu a také účinnou humorální imunitu (Shan et al., 2019). Proto se stále více pozornosti věnovalo adjuvanciím, které by mohly vyvolat slizniční i buněčné imunitní reakce (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). Ve srovnání s injekční cestou je perorální podání jednodušším přístupem, který snižuje náklady a vyvolává méně stresu u brojlerových kuřat (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008). Výsledky této studie ukázaly, že dieta doplněná b-glukanem výrazně zvýšila hladinu NDV-specifických HI titrů v séru kuřat, což je v souladu s předchozími zprávami (Horst et al., 2019). NDV-specifická protilátka je nezbytná pro rozvoj humorální imunitní odpovědi k ochraně kuřat před infekcí NDV (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020). B lymfocyty produkují protilátky a T lymfocyty expandují v reakci na mitogen (Bohácová et al., 2021). V této studii byl index stimulace kuřecích lymfocytů periferní krve vůči NDV skupiny G70 zjevně vyšší než index vakcinační skupiny, což ukazuje, že bylo aktivováno více T lymfocytů. Převládajícími subpopulacemi T lymfocytů jsou CD4 + a CD8 + T buňky (Cui et al., 2020). CD4 + T buňky produkují hlavně cytokiny a podporují zrání B buněk, zatímco CD8 + T buňky jsou spojeny se zabíjením cílových buněk (Zhang et al., 2021b). V tomto výzkumu se poměr CD4 +/CD8 + T buněk detekovaných ve skupině G70 jasně zvyšoval, což naznačuje, že G70 by mohl aktivovat více CD4 + T buněk z periferní krve. Kromě toho jsme pozorovali významně vyšší index stimulace střevních lymfocytů ve skupině G70 než ve skupině s vakcínou, což potvrdilo, že b-glukan může stimulovat také střevní lymfocyty. Naše předchozí experimenty potvrdily, že extrakt buněčné stěny kvasinek PW220 významně zvýšil střevně specifické sIgA a IgA+ buňky (Bi et al., 2020). To znamená, že jak b-glukan G70, tak PW220 jsou účinné při podpoře imunity střevní sliznice.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Zlepšení imunity zvířat podáváním b-glukanu bylo popsáno již dříve. Guo a kol. (2003) potvrdili, že podávání b-glukanu zlepšilo index bursa a NDV-specifických protilátek u kuřat. Levine a kol. (2018) navrhli, že suplementace b-glukanem může up-regulovat střevní MHC Ⅱ a zvýšit počet CD45 + buněk ke zmírnění poškození střev.

Li a kol. (2005) odhalili, že dietní b-glukan by mohl zvýšit hladinu exprese mRNA IL-8 a TGF-b ve střevním traktu prasat. Mechanismus imunomodulačního účinku b-glukanu není jasný. Kim a kol. (2010) ukázali, že b-glukan podporoval zrání dendritických buněk zvýšením exprese CD40, CD80 a CD86. Kromě toho Lee a Kim (2014) a Su et al. (2020) uvedli, že b-glukan aktivoval receptory pro rozpoznávání vzorů, jako je Dectin-1 receptor, Toll-like receptor a CR3 (Baert et al., 2015). Slezina je kritickým orgánem pro iniciaci imunitní reakce a hraje zásadní roli ve vrozené i získané imunitě (Bronte a Pittet, 2013). Existuje však jen malý výzkum založený na analýze RNA-seq exprese mRNA ve slezině po perorálním podání kvasinkových polysacharidů. V této studii analýza dráhy Kjótské encyklopedie genů a genomů navrhla, že tyto geny byly primárně seskupeny do 2 drah, včetně „interakce neuroaktivní ligand-receptor“ a „signální dráhy MAPK“. Receptory pro rozpoznávání vzorů zacílené na b-glukan byly obohaceny na povrchu imunitních buněk (Goodridge et al., 2009). Po rozpoznání b-glukanu byly těmito receptory stimulovány tyrosinkináza a nukleární faktor kappaB (NF-kappaB), což vedlo k indukci sekrece prozánětlivých cytokinů a aktivaci imunitních odpovědí (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu a kol., 2016; Bode a kol., 2019). MAPK, jako rodina serin-threoninových proteinkináz, hraje zásadní roli při zánětu a produkci cytokinů u kuřat. Byun a kol. (2016) prokázali, že b-glukan zvýšil produkci interferonu-ga interleukinu-2 a spustil významně vyšší hladiny fosforylace MAPK p38 v peritoneálním makrofágu. Wang a kol. (2014) uvedli, že b-glukan zmírňuje zánětlivé reakce v buňkách THP-1 inhibicí aktivace p38 MAPK. V této studii bylo v signální dráze MAPK identifikováno 13 stupňů včetně DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB a EGFR, což by mohlo naznačovat, že imunitní odpověď b-glukanu sleziny prostřednictvím MAPK u kuřat. MAPK je konzervovaná třída Ser/Thr kináz v buňkách, které se podílejí hlavně na buněčných odpovědích, jako je imunitní odpověď, apoptóza a proliferace. Rodina MAPK zahrnuje alespoň 3 podrodiny: c-Jun N-terminální kinázu (JNK), p38 MAPK a extracelulární signálem regulovanou kinázu (ERK) (Hong et al., 2020; Zhang et al., 2021a). DUSP4 a DUSP5 jsou fosfatázy s duální specifičností, které specificky inhibují aktivitu členů rodiny MAPK, jako jsou p38, JNK a ERK, a hrají důležitou regulační roli v prevenci zánětlivé nadměrné reakce a podpoře regrese zánětu v těle (Imasato et al. ., 2002; Talreja et al., 2021). Kromě toho bylo hlášeno, že malá nekódující RNA s názvem gga-miR-200a-3p potlačuje expresi prozánětlivých faktorů, a tak reguluje autoimunitní odpověď hostitele negativní regulací dráhy MAPK a jeho downstream signálních molekul (Pham et al., 2017). V této studii analýza RT-qPCR ukázala, že exprese mRNA P38, JNK a ERK se snížila a exprese mRNA DUSP4 a DUSP5 se zvýšila u kuřat krmených b-glukanem (G70). Tyto výsledky naznačují, že účinek b-glukanu (G70) zvyšující imunitu na vakcínu proti newcastleské chorobě může souviset s negativní zpětnou vazbou regulace prozánětlivých faktorů zprostředkovaných prostřednictvím MAPK. Kromě toho je FAS základní látkou, která zprostředkovává apoptózu a je životně důležitá pro imunitní homeostázu (Krueger et al., 2003; Guegan a Legembre, 2018). Mezitím je CACNA2 napěťově závislá podjednotka vápníkového kanálu, která má propagační účinek na buněčnou proliferaci, migraci a invazi (Sun et al., 2020). V této studii byly FAS a CACNA2 významně sníženy u kuřat suplementovaných b-glukanem (G70), což ukazuje, že b-glukan (G70) má účinky na posílení imunity hlavně inhibicí apoptózy imunitních buněk a vyrovnáváním autoimunity. Tato zjištění poskytují teoretický odkaz pro použití b-glukanu (G70) jako posilovače imunity v klinických podmínkách. Mechanismus imunitní reakce zesilující b-glukan prostřednictvím negativního zpětného účinku dráhy MAPK však potřebuje další důkaz. Je zajímavé poznamenat, že geny kódující katelicidin obsahující CATH3, CATH1, CATH2 a geny kódující b-defensin včetně AvBD6, AvBD7, AvBD1 a AvBD4 byly výrazně down-regulovány ve srovnání H (Vakcína skupiny G{104}}) vs. kontrola (skupinová vakcína). Host obranné peptidy (HDP) jsou efektorové molekuly, které hrají klíčovou roli ve vrozeném imunitním systému (Cuperus et al., 2013). Tyto peptidy byly objeveny u různých druhů zvířat od savců po ptáky. U kuřat jsou 4 katelicidiny, skládající se z CATH1, CATH2, CATH3 a CATHB1, které účinně zabíjejí různé bakterie (Hamad et al., 2017). Ptačí beta-defensiny (AvBD), alternativně nazývané gallinacean, jsou malé kationtové peptidy se 3 cysteinovými disulfidovými vazbami mezi jejich cysteinovými zbytky a hrají důležitou roli ve vrozeném imunitním systému (Yoshimura, 2015). Snížení exprese katelicidinů a beta-defensinu bylo pravděpodobně vysvětleno zpětnovazební regulací, kdy bakteriální a parabakteriální populace byly redukovány polysacharidy buněčné stěny kvasinek (Bi et al., 2020). Podobné výsledky byly odhaleny v jiných studiích. Shao a kol. (2016) prokázali, že suplementace kvasinkového b-glukanu u brojlerů potlačila infekci Salmonella a snížila expresi HDP pomocí kvantitativní analýzy PCR v reálném čase. V této studii produkt G70 složený převážně z b-glukanu zvýšil hladinu NDV-specifických protilátek v séru, zvýšil index NDV stimulace lymfocytů periferní krve a střevních lymfocytů a podpořil diferenciaci T lymfocytů periferní krve na CD{{ 123}} T buňky. Navíc analýza RNA-seq ukázala, že G70 upreguloval mRNA exprese související se serotoninovým receptorem spojeným s G-proteinem a polypeptidem MHC třídy I a downreguloval mRNA exprese související s katelicidinem a beta-defensinem. S ohledem na zvýšený účinek G70 na vakcínu ND u kuřat lze dále studovat účinek G70 na jiné vakcíny pro drůbež, jako je vakcína proti ptačí chřipce.

Obrázek 6. Analýza KEGG dráhy.

Obrázek 7. Potvrzení RT-qPCR vybraných kandidátů DEG. Údaje jsou vyjádřeny jako průměr § SE.

Obrázek 8. Relativní exprese mRNA ve slezině. Celková RNA byla extrahována ze sleziny. Kuřecí b-aktin sloužil jako vnitřní kontrolní gen. Údaje jsou vyjádřeny jako průměr § SE.

REFERENCE

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt a E. Cox. 2015. Typově specifické rozdíly v rozpoznávání a signalizaci b-glukanu u prasečích vrozených imunitních buněk. Dev. Comp. Immunol. 48:192–203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere a K. Ganapathy. 2019. Srovnávací ochranná imunita poskytovaná živými vakcínami viru newcastleské choroby nebo ptačího metapneumoviru při současném podávání s klasickými a variantními kmeny viru infekční bronchitidy u jednodenních brojlerových kuřat. Vakcína. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He a J. Ni. 2020. Produkt buněčné stěny kvasinek zvýšil střevní IgA odpověď a změnil druhy mikroflóry slepého střeva po orální vakcinaci u kuřat. Pulard. Sci. 99:6576–6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li a L. Cao. 2022. Buněčnou stěnou kvasinek upregulované imunitní reakce zprostředkované buňkami na vakcínu proti viru newcastleské choroby. Pulard. Sci. 101:101712–101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd a PH Krammer. 2019. Vazba dektinu-1 na annexiny na apoptotických buňkách indukuje periferní imunitní toleranci prostřednictvím NADPH oxidázy-2. Buňka. Rep. 29:4435–4446.

Boháčová, P., J. Kossl, M. Hájková, B. Heřmánková, V. Holan a E. Javorková. 2021. Rozdíl mezi mitogenem stimulovanými B a T buňkami v nespecifické vazbě protilátek konjugovaných s R-fykoerythrinem. J. Immunol. Metody. 493:113013–113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo a JR McGhee. 2003. Terapeutická manipulace imunitního systému: posílení vrozené a adaptivní slizniční imunity. Curr. Pharm. Design. 9:1965–1972.

Bronte, V. a MJ Pittet. 2013. Slezina v lokální a systémové regulaci imunity. Imunita. 39:806–818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung a E. Byun. 2016. Gama-ozářený b-glukan indukuje imunomodulační a protirakovinnou aktivitu prostřednictvím MAPK a NF-kB drah. J. Sci. Jídlo. Agr. 96:695–702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou a X. Li. 2014. Účinky perorální tekutiny epimedium polysacharid-propolis flavon na slizniční imunitu u kuřat. Int. J. Biol. Macromol. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu a S. Hu. 2020. Posílené imunitní reakce se sérovou proteomickou analýzou vakcíny proti slintavce a kulhavce v séru emulgované v rostlinném oleji jako adjuvans. Vakcíny. 8:180–197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk a HP Haagsman. 2013. Obranné peptidy ptačího hostitele. Dev. Comp. Immunol. 41:352–369.

Goodridge, HS, AJ Wolf a DM Underhill. 2009. Rozpoznání beta-glukanu vrozeným imunitním systémem. Immunol. Zj 230:38–50.

Guegan, J. a P. Legembre. 2018. Neapoptotické funkce Fas/CD95 v imunitní odpovědi. FEBS J 285:809-827.

Guo, Y., RA Ali a MA Qureshi. 2003. Vliv beta-glukanu na imunitní reakce u brojlerových kuřat. Immunopharm. Immunol. 25:461–472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong a RA Dalloul. 2017. Srovnávací exprese obranných peptidů hostitele u krůt. Pulard. Sci. 96:2083–2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin a MS Diarra. 2021. Imunostimulační potenciál ovoce a jeho extraktů u drůbeže. Přední. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj a YH Hong. 2020. Kuřecí ptačí b-defensin 8 moduluje imunitní odpověď prostřednictvím mitogenem aktivovaných proteinkinázových signálních drah v buněčné linii kuřecích makrofágů. Pulard. Sci. 99:4174–4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick a C. Hofacre. 2019. Účinky beta- 1,3-glukanu (AletaTM) na vakcinační odpověď u brojlerových kuřat. Pulard. Sci. 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira a J. Li. 2002. Inhibice p38 MAPK glukokortikoidy prostřednictvím indukce MAPK fosfatázy-1 zesiluje expresi Toll-like receptoru 2 indukovanou vlivem netypovatelného Haemophilus. J. Biol. Chem. 277:47444–47450.

Kankkunen, P., L. Teiril€a, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff a S. Matikainen. 2010. (1,3)-beta-glukany aktivují dektin-1 i zánět NLRP3 v lidských makrofázích. J. Immunol. 184:6335–6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim a S. Han. 2010. Aktivace dendritických buněk glukanem izolovaným z umbilicaria esculenta. Imunní. Netw. 10:188–197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann a PH Krammer. 2003. Role CD95 v regulaci apoptózy periferních T-buněk. Immunol. Zj 193:58–69.