Příznivé účinky frakce celkového fenylethanoidového glykosidu izolovaného z Cistanche Deserticola na mikrostrukturu kostí u krys po ovariektomii

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang a Xueqin Ma

1 Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Čína

2 School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, 692 Shenli Street, Yinchuan 750004, Čína

3 Klíčová laboratoř modernizace etnické medicíny Hui, Ministerstvo školství, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Čína

Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je původní dílo řádně citováno.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktní

Tato studie byla navržena tak, aby odhadla antiosteoporotickou aktivitu celkové fenylethanoidní glykosidové frakce izolované zCistanchedeserticola(CDP) na krysách indukovanou ovariektomií (OVX), stejně jako související mechanismy. Po 3 měsících perorálního podávání byla obnovena snížená hustota kostních minerálů, sérový Ca a P u OVX potkanů ​​a zhoršená mikroarchitektura trabekulární kosti byla částečně zlepšena intervencí Cistanche deserticola (60, 120 a 240 mg/kg). markerů kostní resorpce bylo downregulováno a bioaktivní index tvorby kosti byl upregulován; mezitím se obsah MDA snížil a GSH se zvýšil léčbou CDP. Složením bylo identifikováno 8 fenylethanoidových glykosidových sloučeninCistanchedeserticola(CDP), přičemž celkový obsah byl kvantifikován jako 50,3 procent pomocí metody HPLC. mechanicky,Cistanchedeserticola(CDP)snížily hladiny TRAF6, RANKL a RANK, čímž potlačily RANKL/RANK/TRAF6-indukovanou aktivaci downstream signálních drah NF-κB a PI3K/AKT a nakonec zabránily aktivitám klíčových osteoklastogenních proteinů NFAT2 a c -Fos. Všechna výše uvedená data naznačovala, že CDP vykazoval příznivé účinky na kostní mikrostrukturu u krys po ovariektomii a tyto účinky mohou souviset se signálními cestami NF-KB a PI3K/AKT, které byly spuštěny vazbou RANKL, RANK a TRAF6.

Cistanche tubulosamá mnoho efektů, klikněte sem a dozvíte se více

1. Úvod

Postmenopauzální osteoporóza, kterou bude trpět 1 ze 3 žen starších 50 let, se stává hlavním zdravotním rizikem, které postihuje více než 200 milionů žen na celém světě [1]. V menopauze prudký pokles hladiny estrogenu obvykle vede k nadměrné kostní resorpci způsobené zesílenou osteoklastogenezí; pak byla narušena rovnováha mezi osteoblasty indukovanou tvorbou kosti a osteoklasty indukovanou kostní resorpcí a zrychlená kostní resorpce nakonec způsobila osteoporózu a dokonce zlomeninu kyčle nebo páteře [2]. Předpokládalo se, že diferenciace osteoklastů byla spuštěna, když byl receptorový aktivátor nukleárního faktoru kappa B (RANK) navázán na RANKL, ligand RANK. Kombinaci RANK a RANKL však nelze aktivovat, pokud se k ní nepřipojí faktor 6 spojený s receptorem proteinu tumor nekrotizujícího faktoru (TRAF6) [3] a následná stimulace downstream signálních drah včetně PI3K/AKT a NF-κB. A konečně, exprese nukleárního faktoru aktivovaných T buněk c2 (NFAT2) a c-Fos byly regulovány [4] za účelem modulace diferenciace osteoklastů a také kostní resorpce. Faktory a regulátory, které přímo nebo nepřímo souvisejí s aktivací a diferenciací osteoklastů, byly tedy považovány za klíčové cíle pro prevenci ztráty kostní hmoty.

Skutečně existují některá klinická a syntetická léčiva pro hormonální substituční terapii, jako je estradiolvalerát, která jsou účinná při léčbě postmenopauzální osteoporózy. Bohužel některé z nich zvýšily riziko závažných nádorových onemocnění včetně karcinomu prsu a endometria [5], což omezovalo jejich klinické použití. Proto je nutné volit jiné alternativy jak s účinností, tak s minimálními vedlejšími účinky. Tradiční čínská medicína (TCM), stejně jako izolované bioaktivní sloučeniny a frakce [6–9], se ukázaly jako účinné při různých onemocněních včetně postmenopauzální osteoporózy. Mezi těmito bioaktivními složkami a frakcemi byly fenylethanoidní glykosidy (PhG) s potenciální účinností považovány za slibné látky pro léčbu osteoporózy [10–12]. Struktury PhGs se skládají z aglykonu kyseliny skořicové, hydroxylfenylethylové skupiny, která je kombinována s -glukopyranózou, apózou, galaktózou, rhamnózou nebo xylózou prostřednictvím glykosidické vazby. Široce se vyskytují u léčivých druhů roduCistanche[13]. CistanchedeserticolaYC Ma je ​​oficiální TČM, která je zaznamenána v čínském lékopisu, a kromě toho, že je důležitou TČM [14], C deserticola je také tonizující bylina proti stárnutí s několika vedlejšími účinky, která byla vyvinuta jako léčivý likér a výživná tekutina schválená Státním potravinářským úřadem. a Správa léčiv. Na základě záznamu čínského lékopisu byla C. deserticola tradičně používána domorodci k léčbě problémů s nedostatkem ledvinových esencí, jako je svalová slabost a bederní slabost, a fenylethanoidní glykosidové sloučeniny včetně echinakosidu a akteosidu jsou hlavními bioaktivními složkami této byliny. Podle TCM teorie „kost ledviny řídí“ kostní systém řídí ledvinová esence [15] a problémy související s kostmi, jako je osteoporóza, mohou být odstraněny bylinami nebo sloučeninami, které mají aktivitu vyživující ledvinovou esenci. Proto jsme předpokládali, že celková frakce fenylethanoidových glykosidů izolovaná z C. deserticola, alespoň částečně, byla přínosná v léčbě osteoporózy. Současný experiment byl proto navržen tak, aby potvrdil naši hypotézu pomocí modelu krysy s odstraněnými vaječníky (OVX); kromě markerů kostní resorpce a tvorby, které je třeba odhadnout, byl ke zkoumání hlavních mechanismů antiosteoporotické bioaktivity využit také antioxidační index a také RANKL/RANK/TRAF6- indukované PI3K/AKT a NF-κB signální dráhy. .

2. Materiály a metoda

2.1. Rostlinné materiály a příprava.

Celkem 30 kg stonků zCistanchedeserticolaY.C. Ma byly sebrány z okresu Yongning v září 2015 se souřadnicemi 106.026597 a 38.262816, provincie Ningxia, Čína. Bylinu identifikoval Dr. Lin Dong (Department of Pharmacognosy, Ningxia Medical University) a odpovídající vzorek (#201509{{40}}1) byl zachován na katedře farmaceutické analýzy. Nejprve bylo extrahováno 30},0 kg práškové C. deserticola za použití refluxní metody se 70% ethanolem jako rozpouštědlem; poměr materiálu k rozpouštědlu byl nastaven na 1:10 a doba refluxu byla 2 hodiny na 3 časy. Poté byly všechny filtráty spojeny a kondenzovány za sníženého tlaku při teplotě 60 °C. Za druhé byly pro předběžnou separaci použity kolony s makroporézní pryskyřicí AB{14}} a různé poměry ethanolu ve vodě (0 procent, 20 procent, Pro eluci bylo použito 30 procent, 40 procent, 50 procent a 60 procent, každý 60 l). Za třetí, 40% a 50% eluenty byly spojeny a dále čištěny použitím opakovaných AB-8 kolon s makroporézní pryskyřicí s eluenty 0 procent, 20 procent, 30 procent, 40 procent a 50 procent ethanolu ve vodě a každý eluent byl 12 1. Nakonec byla shromážděna 40procentní frakce a kondenzována za sníženého tlaku za získání 150 g světle žluté sedimentové fenylethanoidové glykosidové frakce C. deserticola (CDP, výtěžek byl 0,5 procenta). Pro experimenty in vivo bylo k rozpuštění CDP použito 0,5 procenta rozpouštědla CMC-Na; orální podávání zvířatům bylo nastaveno jako 1 ml/100 g tělesné hmotnosti; pro in vitro Western blot analýzu byl CDP rozpuštěn v DMSO a poté zředěn DMEM, aby se získaly konečné koncentrace 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,001 mg/ml.

2.2. Chemikálie a rozpouštědla.

Estradiol valerát (EV) byl od Delpharm Lille SAS, Francie; alkalická fosfatáza (ALP), kostní gla-protein (BGP), tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza (TRAP) a deoxypyridinolinové (DPD) crosslink ELISA soupravy od Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Čína, 201605; reagenční sady malondialdehyd (MDA, 20181221), super oxid dismutáza (SOD, 20121218) a glutathion (GSH, 20181221) od Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, Čína; Soupravy ELISA zesíťovaného parathormonu (l-PTH, NEWASHE7UZ), kalcitoninu (2L9ISN7AIU) a receptoru alfa souvisejícího s estrogenem (ERR, Y3AY8QEWB3) od Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Čína; katepsin K ELISA reagenční souprava od BioVision, Amerika, 11300141; primární protilátky RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 kináza p8265 alpha , AKT 1 (AF05173234), -aktin (17AV0411) a sekundární protilátky kozího anti králičího IgG konjugovaného s křenovou peroxidázou od ZSGB-BIO, Čína, 136080; souprava pro stanovení celkového proteinu BCA a komerční souprava pro detekci tvorby oklastů a fetálního bovinního séra a Dulbeccovo modifikovaného Eagleova média (DMEM) od HyClone, Logan, UT, USA; polyvinylidenfluoridová (PVDF) membrána od Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penicilin a streptomycin od Gibco, Rockville, MD, USA. Všechny ostatní použité chemické látky byly třídy AR.

2.3. HPLC kvantifikace Cistanche Deserticola P.

K identifikaci a kvantifikaci složení CDP byl použit přístroj Agilent 1220 HPLC. Chromatografické podmínky byly následující: kolona C18 (TSK-GEL, 4 6 Id x 250 mm, 5 um); gradientová eluce obsahovala rozpouštědla A (acetonitril) a B (voda obsahující 0,5 procenta kyseliny octové) (0-10 min: 17-20 procent A; 10-30 min: 20-25 procent A; a 30-40 min: 25-30 procent A); detekční vlnová délka byla 333 nm; teplota okolí; průtoková rychlost byla 1,0 ml/min; objem nástřiku vzorku byl 5 μl. Bylo identifikováno osm sloučenin PhG, jmenovitě cistanosid F, echinakosid, 6'-acetylakteosid, cistanosid C, cistanosid A, akteosid, 2'-acetylakteosid a isoakteosid; za použití odpovídajících referenčních látek a metody externího standardu byly obsahy výše uvedených 8 PhG kvantifikovány pomocí HPLC analýzy (obrázek 1).

2.4. Experimentální protokol na zvířatech.

Celkem 60 samic dospělých potkanů ​​Sprague-Dawley ve věku 3 měsíců bylo vybráno z centra testování na zvířatech lékařské univerzity Ningxia s průměrnou počáteční tělesnou hmotností asi 234 ± 25 g. Krysy byly umístěny ve standardním prostředí bez specifického patogenu, aby se aklimatizovaly po dobu 1 týdne. Poté byly všechny krysy anestetizovány (chloralhydrát, 100 mg/kg, ip), pouze falešná ovariektomie (SHAM), nebo byly odstraněny dva vaječníky a poté náhodně rozděleny do 5 podskupin: orálně léčeny vehikulem (0,5 procenta CMC- Na) byl stanoven jako modelová skupina (OVX), estradiolvalerát (1 mg/kg/den) jako pozitivní skupina (EV) a 60, 120 a 240 mg/kg/den CDP jako nízké (CDPL), střední (CDPM), respektive vysoké (CDPH) dávkové skupiny. Všem krysám bylo perorálně podáváno denně a léčba trvala 3 měsíce s dávkováním upravovaným každé 2 týdny, což záviselo na změně celkové tělesné hmotnosti. Poslední den pokusu na zvířatech byla pomocí metabolických klecí získána 24-hodinová moč; sérum bylo odebráno z femorální arterie anestetizovaných krys; pravá femora, holenní kost a všechny orgány byly vypreparovány a uloženy při -80 stupni C pro další analýzu. Pokusy na zvířatech, které jsme provedli, byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee of Ningxia Medical University.

2.5. Stanovení kostní minerální hustoty a mikro-CT analýza.

Nejprve byl použit dvouenergetický rentgenový absorpční přístroj (Lunar, USA) k odhadu celkové kostní minerální hustoty pravé stehenní kosti každého potkana; za druhé, stejný femur byl použit k odhadu 3D obrazu mikroarchitektury trabekulární kosti pomocí mikro-CT skenerového přístroje (GE, Amerika). Izotropní rozlišení bylo nastaveno na 14 μm pro získání ideálního 3D obrazu; oblast zájmu (ROI) byla vybrána nastavením stejných souřadnic v růstové ploténce femuru každého vzorku; a morfometrické parametry kosti včetně trabekulární separace (Tb. Sp), trabekulárního počtu (Tb. N), tloušťky trabekulární trabekulární trabekulární tloušťky (Tb. Th), obsahu kostních minerálů (BMC), tkáňové minerální hustoty (TMD) a obsahu tkáňových minerálů (TMC ) byly získány analýzou ROI.

2.6. Biochemický test séra a moči.

Aktivity sérového katepsinu K, TRAP, SOD a GSH, stejně jako obsah sérového PTH, kalcitoninu, ERR, MDA, BGP a DPD v moči, byly stanoveny pomocí odpovídajících reagenčních souprav podle pokynů výrobce a hladina alkalické fosfatázy (ALP) a obsah vápníku (Ca) a fosforu (P) v séru a moči byly odhadnuty pomocí automatického stroje (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Analýza Western Blot.

Osteoklasty byly indukovány použitím buněk RAW 264.7 s přidaným faktorem stimulujícím kolonie makrofágů (MCSF) a RANKL. Stručně, 1 x 107 buněk RAW 264.7 bylo kultivováno na 6-jamkové destičce v přítomnosti 30 ng/ml MCSF a 25 ng/ml RANKL. Po 6 dnech indukce byly zralé buňky osteoklastů identifikovány pomocí metody barvené TRAP s odpovídající soupravou a poté ošetřeny CDP (0.1, 0.01 a 0.001 mg/ml v uvedeném pořadí) po dobu 24 hodin; poté byly buňky lyžovány lyzačním pufrem obsahujícím 0,5 mmol fenylmethylsulfonylfluoridu, proteázy a inhibitorů fosfatázy. Lyzát byl poté separován pomocí 10% SDS-PAGE a přenesen na PVDF membránu, která byla sondována pomocí AKT1, NF-KB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos a -aktinu. (1:400) po blokování 5% odtučněným mlékem po dobu 2 hodin. Stejné membrány byly stripovány a znovu sondovány výše uvedenými 9 odpovídajícími protilátkami, v daném pořadí, a poté byly na konci detekovány softwarem Image Lab. Experimenty byly opakovány třikrát.

2.8. Statistická analýza.

Všechna data získaná z in vivo a in vitro experimentů, popsaná jako průměr ± SD, byla analyzována pomocí jednocestné ANOVA následované Dunnettovým testem (SPSS 22.0 software, SPSS, USA); p < 0="" 05="" bylo="" statisticky="">

Výsledek

3.1. Chemické složení Cistanche Deserticola P.

Pomocí metody HPLC bylo osmfenylethanoidní glykosidV této frakci byly nalezeny sloučeniny, jak ukazuje obrázek 1. Pomocí standardních odkazů a externí standardní metody byly sloučeniny a jejich obsah identifikovány a kvantifikovány následovně: (1) akteosid F (3,6 procenta), (2) echinakosid (8,8 procenta), (3) cistanosid A (5.{101} {9}} procent ), (4) akteosid (13,3 procenta), (5) isoakteosid (3,3 procenta), (6) akteosid C (3,6 procenta), (7) 2'-acetylakteosid (9,9 procenta) a (8 ) 6'-acetylakteosid (3,2 procenta). Celkový obsah těchto osmi složek byl kvantifikován jako 50,7 procenta.

3.2. Účinky Cistanche Deserticola P na hustotu kostních minerálů a mikroarchitekturu trabekuly.

Celková hustota kostních minerálů u potkanů ​​v různých podskupinách je znázorněna na obrázku 2. U potkanů ​​z modelové skupiny OVX byl pozorován klesající trend v obsahu kostní minerální hustoty, která se poté snížila o téměř 12.0 procent 12 týdnů operace ve srovnání s potkany ze skupiny SHAM (p < 0="" 001).="" všechny="" krysy="" ošetřené="" cdp="" vykazovaly="" významně="" zvýšenou="" hustotu="" kostního="" minerálu="" o="" 11,2="" procenta,="" 12,{9}}="" procent="" a="" 10,7="" procenta="" (p="">< 0="" 01),="" v="" tomto="" pořadí,="" ve="" srovnání="" s="" krysami="" modelu="" ovx="" skupina.="" dále,="" v="" souladu="" s="" údaji="" o="" celkové="" hustotě="" kostního="" minerálu,="" mikro-ct="" rekonstrukce,="" stejně="" jako="" histomorfometrické="" stanovení="" femuru="" ukázaly,="" že="" potkani="" ve="" skupině="" ovx="" vykazovali="" zjevné="" zhoršení="" trabekulární="" architektury,="" o="" čemž="" svědčí="" výrazně="" snížený="" počet="" a="" také="" plocha="" trabekuly="" jako="" výrazně="" zvýšené="" tb.="" sp="" ve="" srovnání="" s="" krysami="" ze="" skupiny="" sham.="" léčba="" pomocí="" cdp="" zabránila="" ovx-indukovanému="" zhoršení="" trabekulární="" architektury;="" jak="" ukazuje="" obrázek="" 3,="" bmc,="" tmc="" a="" tb.="" významně="" se="" zvýšily="" hodnoty="" n="" a="" plocha="" tb.="" sp="" byl="" výrazně="" snížen,="" zatímco="" hodnoty="" tmd="" a="" tb.="" zdálo="" se,="" že="" nebyly="" významně="" ovlivněny="" operací="" ovx="" a="" naším="" zásahem="">

3.3. Účinky Cistanche Deserticola P na biochemické parametry moči a séra.

Jak ukazuje obrázek 4, byly detekovány významné trendy poklesu hladiny P v moči a obsahu kalcitoninu v séru u potkanů ​​modelové skupiny OVX, což bylo téměř o 30 procent a 60 procent méně než u potkanů ​​SHAM (p < 0="" 001="" ),="" zatímco="" mezi="" skupinami="" ovx="" a="" sham="" nebyly="" pozorovány="" žádné="" zjevné="" rostoucí="" nebo="" klesající="" trendy="" v="" hladinách="" ca="" v="" moči="" a="" ca="" v="" séru,="" stejně="" jako="" v="" séru="" p="" a="" pth="" v="" séru.="" léčba="" pomocí="" cdp="" významně="" zabránila="" ztrátě="" sérového="" p="" a="" ca="" u="" ovx="" krys,="" o="" čemž="" svědčí="" hladiny="" sérového="" p="" a="" ca="" výrazně="" upregulované="" (p="">< 0="" 05)="" ve="" srovnání="" s="" krysami="" z="" modelové="" skupiny="" ovx.="" kromě="" toho="" byly="" pozorovány="" zvýšené,="" ale="" statisticky="" nevýznamné="" trendy="" kalcitoninu="" ve="" skupinách="" s="" nízkou="" i="" vysokou="" dávkou="" cdp="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou="">

3.4. Účinky Cistanche Deserticola P na tvorbu kosti a markery kostní resorpce.

Příznivé účinky CDP na index tvorby kosti, stejně jako inhibiční vlivy na markery kostní resorpce, jsou popsány na obrázku 5. Pokud jde o markery kostní formace, hladiny sérového BGP nebyly téměř ovlivněny operací po ovariektomii, která byla prokázána tím, že významné změny pozorované u všech léčených skupin, zatímco statisticky významné zlepšení sérové ​​ALP bylo dosaženo jak při nízkých (60 mg/kg), tak středních (120 mg/kg) dávkách intervenčních skupin CDP, když ve srovnání s krysami ze skupiny SHAM (p < 0="" 01).="" pokud="" jde="" o="" index="" kostní="" resorpce,="" hladiny="" sérového="" katepsinu="" k="" a="" dpd,="" stejně="" jako="" trap="" u="" potkanů="" ​​modelové="" skupiny="" ovx,="" byly="" významně="" zvýšeny="" o="" přibližně="" 75,0="" procent,="" 41,4="" procent="" a="" 21,0="" procent,="" v="" tomto="" pořadí,="" ve="" srovnání="" s="" potkany="" sham.="" a="" při="" léčbě="" cdp,="" zejména="" nízkou="" dávkou="" 60="" mg/kg,="" byly="" vlastnosti="" kathepsinu="" k="" a="" dpd="" a="" také="" trap="" v="" modelové="" skupině="" ovx="" výrazně="" inhibovány="" o="" 67,3="" procenta,="" 41,4="" procenta="" a="" 25,9="" procenta,="" v="" tomto="" pořadí.="" ve="" srovnání="" s="" krysami="" v="" modelové="" skupině="">

3.5. Účinky Cistanche Deserticola P na vagínu a dělohu a také na hmotnost celého těla.

Nesignifikantní rozdíly v počáteční celkové tělesné hmotnosti potkanů ​​byly pozorovány před léčbou v šesti skupinách (obrázek 6). Operace odstranění ovariektomie však vedla k významnému zvýšení konečné tělesné hmotnosti krys v modelové skupině OVX, což je téměř 36.0 procent, zatímco mokré hmotnosti dělohy a pochvy byly drasticky sníženy o téměř 9{{4 }}.0 procent a 60,0 procent, v tomto pořadí, ve srovnání s krysami SHAM (p < 0="" 001).="" ačkoli="" obsah="" err="" nevykazoval="" žádný="" významný="" rozdíl="" mezi="" skupinami="" ovx="" a="" sham,="" všechny="" léčebné="" skupiny="" včetně="" cdp="" a="" ev="" významně="" zvýšily="" hladinu="" err.="" navíc,="" když="" byly="" léčeny="" ev,="" výše="" uvedené="" přírůstky="" hmotnosti="" celého="" těla,="" stejně="" jako="" ztráta="" hmotnosti="" vagíny="" a="" dělohy="" u="" ovx="" potkanů,="" byly="" částečně="" zvráceny="" (p="">< 0="" 001),="" ale="" nebyly="" ovlivněny="" intervencí="">

3.6. Účinky Cistanche DeserticolaP na hladiny sérového MDA, SOD a GSH.

Mezi modelovými skupinami SHAM a OVX nebyl statisticky významný rozdíl ve vlastnostech sérových SOD a GSH; jak popisuje obrázek 7, mezi výše uvedenými skupinami lze pozorovat rostoucí trend v GSH. Kromě toho byla hladina sérového MDA prudce zvýšena o téměř 50 procent u krys modelové skupiny OVX ve srovnání s krysami SHAM. Aktivita SOD nebyla ovlivněna léčbou CDP, zatímco vlastnost GSH byla výrazně zlepšena intervencí CDP a CDP výrazně snížila hladinu MDA o 33,9 procenta a 42,4 procenta při dávkách 60 a 240 mg/kg, v daném pořadí ( p < 0="">

3.7. Účinky Cistanche deserticola P na hladiny proteinové exprese.

Naše data uvedená na obrázku 8 naznačují, že léčba CDP významně snížila hladiny proteinů TRAF6, RANK a RANKL ve srovnání s kontrolou. Signální dráhy downstream včetně NF-KB byly potlačeny a PI3K/AKT byl stimulován CDP intervencí, o čemž svědčí exprese downregulace NF-KB-p65, zatímco PI3K-p85 a AKT1 byly upregulovány. V důsledku toho byla exprese NFAT2 významně snížena a c-Fos byl zvýšen po léčbě CDP v koncentraci 0.001-0,1 mg/ml. Navrhovaný mechanismus je popsán na obrázku 9, kde CDP downreguloval hladiny RANKL a RANK, což vedlo ke snížení vazebných množství tohoto ligandu s jeho receptorem, a spojení RANKL s RANK bylo dále sníženo downregulací TRAF6, následovala suprese následných drah včetně dráhy NF-KB, zatímco signální dráha PI3K/AKT byla stimulována, což nakonec vedlo ke snížení exprese NFAT2 a zvýšení hladiny c-Fos.

4. Diskuze

Fenylethanoidové glykosidy jsou přirozeně se vyskytující ve vodě rozpustné složky, které se široce vyskytují v říši léčivých rostlin [11]. Sloučeniny fenylethanoidních glykosidů dosud přitahovaly stále více výzkumníků pro jejich evidentní roli při léčbě různých lidských onemocnění a abnormalit [13]. Z desítek přírodních léčivých bylin bylo identifikováno a izolováno množství antiosteoporotických bioaktivních frakcí a sloučenin, včetně polyfenolů a fenylethanoidních glykosidů [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola je dobře známá jako "ženšen pouště", což naznačuje bezpečnostní profil této jedlé TCM [18, 19]. C. deserticola jako obecná posilující bylina a přírodní zdravá potravina, která se již dlouho používá v asijských zemích, vykazovala prospěšnou funkci pro posílení síly ledvin. Bylo zjištěno, že TCM, tradičně používané k povzbuzení a udržení ledvinové esence, byly obvykle používány k léčbě osteoporózy, jak in vitro, tak in vivo publikovaná data prokázala antiosteoporotický účinek C. deserticola [20–23] a složek fenylethanoidních glykosidů včetně echinakosid a akteosid jsou hlavní bioaktivní složky, které existují v této jedlé léčivé rostlině; všechny naznačovaly, že nejen echinakosid a akteosid samotné, ale také další fenylethanoidní glykosidové složky obsažené v C. deserticola byly považovány za odpovědné za antiosteoporotické vlastnosti této byliny. V naší současné studii byla k izolaci a obohacení frakce fenylethanoidových glykosidů z C. deserticola použita příznivá bezpečnostní makroporézní pryskyřice a pomocí metody HPLC bylo použito osm hlavních složek fenylethanoidových glykosidů, konkrétně akteosid F, echinakosid, cistanosid A, akteosid, isoacteosid, akteosid C, 2'-acetylakteosid a 6'-acetylakteosid byly nalezeny v izolované frakci fenylethanoidových glykosidů a obsahy byly 3,6 procenta, 8,8 procenta, 5,0 procenta, 13,3 procenta, 3,3 procenta, 3,9 procenta, 3,9 procenta a 3,2 procenta. Bylo prokázáno, že echinakosid, jedna ze sloučenin s hlavní aktivitou zaznamenanou u C. deserticola [14], má antiosteoporotický účinek; nicméně dávka 270 mg/kg byla tak vysoká, že omezovala její další klinickou aplikaci [24]. V současných experimentech byla u OVX potkanů ​​použita celková frakce fenylethanoidových glykosidů s nižší dávkou 60-240 mg/kg tělesné hmotnosti/-den a obsah identifikovaných složek byl v této frakci téměř z 50 procent čistý při použití metodou HPLC.

Bylo dobře známo, že OVX může způsobit osteoporózu, a krysa OVX byla považována za klasický a vhodný model pro simulaci postmenopauzální osteoporózy u člověka. Současně byl po operaci ovariektomie pozorován významný pokles kostní minerální denzity, trabekulární kostní mikroarchitektury, vlhké hmotnosti dělohy a pochvy a hladiny estrogenu, stejně jako zjevné zvýšení kostní resorpce a tělesné hmotnosti, z nichž část v důsledku ztráty estrogenu [25]. Naše dosavadní údaje jasně prokázaly, že OVX skutečně vyvolal postmenopauzální osteoporózu a je vždy doprovázen prudkým poklesem kvality kostí, kostní mikroarchitektury a vlhké hmotnosti dělohy a pochvy. Vzhledem k tomu, že EV je obecná hormonální substituční látka, která se používá v klinické praxi, byla použita jako pozitivní kontrola v našem experimentu in vivo a při zvýšení tělesné hmotnosti a atrofické hmotnosti dělohy, jakož i zhoršené minerální hustoty kostí a mikroarchitektury trabekulární kosti. , byly očekávaně zvráceny doplňováním EV. Na rozdíl od pozitivní kontroly nebyly snížené hmotnosti vagíny a dělohy, stejně jako přírůstek hmotnosti celého těla krys v modelové skupině OVX, ovlivněny léčbou CDP, což znamená, že CDP může zvýšit tvorbu kosti bez vyvolání vedlejších účinků. na těle a organických tkáních dělohy. Ačkoli hladiny ERR byly významně upregulovány léčbou CDP, nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky na organické tkáně dělohy a pochvy jako u fytoestrogenového účinku. Kromě toho léčba CDP významně posílila kvalitu kosti u OVX potkanů, která byla zhoršena chirurgickým zákrokem ovariektomie.

Kromě toho byly hladiny P a Ca v moči a séru OVX potkanů ​​také použity k vyjádření antiosteoporotického účinku a koncentrace Ca a anorganického P byly obvykle závislé na hladinách kalcitoninu a PTH [26]. V této studii, ačkoli nebyly získány žádné významné klesající nebo rostoucí trendy v hladině vylučování Ca, P v séru, Ca v séru a PTH u potkanů ​​modelové skupiny OVX v moči, významné hladiny P a kalcitoninu v moči (p < {="" {1}})="" byly="" pozorovány.="" v="" souladu="" s="" publikovanými="" údaji,="" že="" nedostatek="" estrogenu="" způsobený="" operací="" ovariektomie="" vždy="" vedl="" ke="" snížené="" hladině="" kalcitoninu="" v="" krvi,="" tento="" snížený="" sérový="" kalcitonin="" nakonec="" vedl="" ke="" zvýšené="" hladině="" pth,="" kde="" byl="" ca="" považován="" za="" hlavní="" regulátor="" sekrece="" pth.="" protože="" koncentrace="" pth="" v="" této="" studii="" nevykazovala="" žádný="" významný="" rozdíl="" mezi="" skupinami="" ovx="" a="" sham,="" hladina="" ca="" v="" séru="" a="" moči="" také="" nevykazovala="" žádné="" zjevné="" změny="" mezi="" výše="" uvedenými="" dvěma="" skupinami.="" byla="" však="" získána="" signifikantně="" klesající="" tendence="" hladiny="" kalcitoninu="" mezi="" skupinami="" ovx="" a="" sham="" a="" následně="" byl="" obsah="" p="" v="" moči="" ovx="" silně="" snížen.="" domnívali="" jsme="" se,="" že="" výše="" uvedená="" data="" mohou="" vysvětlit="" protichůdný="" jev,="" proč="" vylučování="" hladiny="" ca="" v="" moči="" u="" ovx="" potkanů="" ​​nevykazovalo="" žádnou="" zjevnou="" změnu="" ve="" srovnání="" s="" potkany="" sham,="" a="" tento="" jev="" může="" také="" souviset="" se="" zvýšenou="" rychlostí="" kostního="" obratu="" [27].="" .="" po="" léčbě="" cdp="" byly="" hladiny="" p="" a="" ca="" v="" séru="" výrazně="" zvýšeny="" a="" obsah="" p="" v="" moči="" byl="" snížen="" u="" ovx="" potkanů,="" což="" odráželo,="" že="" cdp="" mohl="" nejen="" zabránit="" vylučování="" minerálních="" prvků="" z="" kostí,="" ale="" také="" zvýšit="" obsah="" séra="" těchto="" potkanů.="" prvků,="" čímž="" se="" nepřímo="" potlačuje="" úbytek="" kostní="">

Kromě toho byly markery tvorby a resorpce kosti, stejně jako antioxidační enzymy včetně SOD a GSH, také použity k vysvětlení základních antiosteoporotických mechanismů CDP. Podobně jako u publikovaných údajů vykazovala hladina ALP u potkanů ​​modelové skupiny OVX statisticky nevýznamný rostoucí trend, který ukazuje na zrychlenou rychlost kostního obratu u postmenopauzální osteoporózy [10]. Avšak po léčbě CDP (60, 120 a 240 mg/kg/den) byla vlastnost ALP významně zvýšena. Bylo dobře známo, že OVX způsobil prudký pokles hladin estrogenu, což obvykle vede k překročení kostní resorpce a oxidativnímu stresu [28], o čemž svědčí hladiny TRAP, katepsinu K a DPD a také MDA, které jsou výrazně upregulovány u potkanů Modelová skupina OVX. Tato zhoršení však byla částečně zlepšena intervencí CDP. Kromě toho léčba OVX potkanů ​​pomocí CDP (60 a 240 mg/kg) prokázala významné zvýšení aktivity GSH (p < 0="" 05).="" výše="" uvedené="" výsledky="" naznačují,="" že="" cdp="" vykazuje="" terapeutický="" účinek="" na="" osteoporózu="" vyvolanou="" ovx="" a="" tyto="" účinky="" byly="" jak="" zvýšením="" tvorby="" kosti,="" tak="" potlačením="" kostní="" resorpce,="" jakož="" i="" zlepšením="" kostního="" antioxidačního="">

Aktivace RANK jeho ligandem RANKL stimulovala expresi NFAT2 a c-Fos prostřednictvím PI3K/AKT a NF-κB signalizace [29]. Ukázalo se, že NF-KB je nezbytný pro osteoklastogenezi, protože narušení NF-KB by mohlo vést ke zhoršené diferenciaci osteoklastů s osteoporotickým fenotypem a NF-KB upreguloval c-Fos a downreguloval expresi NFAT2 během osteoklastogeneze indukované RANKL/RANK/TRAF. Pro odhad příznivého vlivu CDP na osteoklastogenezi zprostředkovanou NFAT2 a c-Fos byly analyzovány hladiny exprese RANKL a RANK. Očekávaně CDP významně inhibovala NFAT2 a stimulovala hladiny c-Fos snížením exprese RANKL a RANK. Mezitím samotná RANK postrádala vlastnost vnitřní kinázy, pokud nebyla spojena s TRAF6, aby spustila downstream signalizaci [3]. CDP také downreguloval expresi TRAF6, což vedlo k významnému snížení vazebných množství RANKL a RANK. Předpokládaný antiosteoporotický mechanismus CDP na OVX potkanech pokrýval výše uvedené signální dráhy a regulátory byly popsány na obrázku 9. Stručně řečeno, CDP snížila hladiny TRAF6, RANKL a RANK, čímž potlačila následné signální dráhy včetně PI3K/AKT a NF-KB, které jsou spouštěny RANKL/RANK a nakonec snížily expresi a aktivity klíčových osteoklastogenních proteinů NFAT2 a c-Fos. Mnohočetná vodítka dat tedy naznačovala příznivý účinek CDP na kostní metabolismus OVX potkanů ​​hlavně prostřednictvím RANKL/RANK/TRAF6- zprostředkovaných PI3K/AKT a NF-KB drah.

5. Závěr

Stručně řečeno, celkové fenylethanoidové glykosidy, izolované z C. deserticola, vykazovaly významné příznivé účinky na postmenopauzální osteoporózu OVX potkanů ​​a terapeutický potenciál při potlačování úbytku kostní hmoty spočíval především ve stimulaci tvorby kosti a inhibici kostní resorpce, jakož i ve zlepšení kostního antioxidantu. Systém; mechanismy mohou souviset s RANKL/RANK/TRAF{0}}indukovanou aktivací NF-κB a inaktivací PI3K/AKT, stejně jako se stimulací c-Fos a supresí NFAT2, a nakonec byla inhibována diferenciace osteoklastů.

Zkratky

AKT: Proteinkináza B

ALP: Alkalická fosfatáza

BGP: Kostní protein GLA

BMC: Obsah minerálních látek v kostech

CDP: Fenylethanoidní glykosidová frakce C. deserticola

CK: Cathepsin K

CT: Kalcitonin

DPD: deoxypyridinolin

ERR: Estrogen-příbuzný receptor alfa

EV: Estradiol valerát

GSH: Glutathion l-PTH: intaktní parathormon

MCSF: Faktor stimulující kolonie makrofágů

MDA: Malondialdehyd

NFAT2: Nukleární faktor aktivovaných T buněk c2

NF-KB: Nukleární faktor-kapa B

OPG: Osteoprotegerin

OVX: Ovariektomizováno

PhGs: fenylethanoidní glykosidy

PI3K: Fosfoinositid 3-kináza

Hodnost: Aktivátor receptoru jaderného faktoru kappa B

RANKL: Aktivátor receptoru jaderného faktoru kappa

ROI ligandu B: Oblast zájmu

SOD: Superoxiddismutáza

Tb. N: Trabekulární číslo

Tb.Sp: Trabekulární separace

Tb.Th: Trabekulární tloušťka

TCM: Tradiční čínská medicína

TMC: Obsah tkáňových minerálů

TMD: Hustota tkáňových minerálů

TNF: Tumor necrosis factor

TRAF6: Faktor 6 spojený s receptorem nádorového nekrotického faktoru

TRAP: Kyselá fosfatáza odolná vůči tartrátům.

Dostupnost dat

Údaje použité k podpoře zjištění této studie jsou na vyžádání k dispozici od odpovídajícího autora.

Střet zájmů

Autoři nebyli ve střetu zájmů.

Příspěvky autorů

XM navrhl a dohlížel na experimenty; SD a LY provedli většinu experimentů a vypracovali rukopis; BZ a JL provedli analýzu Western blot a účastnili se pokusů na zvířatech; YD analyzoval data; QT a PY revidovaly rukopis. Všichni autoři rukopis recenzovali. Lingling Yang a Shuqin Ding přispěli stejnou měrou k rukopisu.

Poděkování

Tato práce byla podpořena granty od Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), National Natural Science Foundation of China (č. 81560684), Key Research and Development Program of Ningxia (2018BHF2001), Ningxia Key Research and Invention Program of Science and Technology Cooperation of the East and the West (č. 2017BY084 a 2017BY079) a West Light Foundation Čínské akademie věd – Young Scientists of West 2017.

Reference

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane a BL Riggs, "Perspektiva. Kolik žen má osteoporózu?", Journal of Bone and Mineral Research, sv. 7, č. 9, s. 1005–1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham a SL Kates, „1-letá úmrtnost pacientů léčených v rámci programu zlomenin kyčle pro starší osoby“, Geriatric Orthopedic Surgery & Rehabilitation, sv. 1, č. 1, s. 6–14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew a EL Yong, "TRAF6 zprostředkovává potlačení osteoklastogeneze a prevenci úbytku kostní hmoty vyvolané ovariektomií novým prenylflavonoidem," Journal of Bone and Mineral Research, sv. 32, č. 4, str. 846–860, 2017.

[4] JH Kim a N. Kim, "Regulace NFATc1 v diferenciaci osteoklastů," Journal of Bone Metabolism, sv. 21, č. 4, s. 233–241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu et al., "Antiosteoporotic activity and constituents of Podocarpium podocarpus," Phytomedicine, sv. 22, č. 1, s. 94–102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon a kol., "Kyselina protokatechuová zmírňuje ztrátu trabekulární kosti u myší po ovariektomii", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, sv. 2018, ID článku 7280342, 11 stran, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby a kol., "Rutin izolovaný z Chrozophora tinctoria zvyšuje proliferaci kostních buněk a markery osifikace," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, sv. 2018, ID článku 5106469, 10 stran, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon a T. Tong-un, „extrakt z listů Morindacitrifolia L. chrání před mozkovou ischemií a osteoporózou v experimentálním modelu in vivo menopauzy, "Oxidative Medicine and Cellular Longevity, sv. 2018, ID článku 1039364, 13 stran, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura a W. Thukham-mee, "Antiosteoporotický účinek kombinovaného extraktu z Morus alba a Polygonum odoratum," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, sv. 2014, ID článku 579305, 9 stran, 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao a X. Ma, „Syringin zabraňuje ztrátě kostní hmoty u myší po ovariektomii prostřednictvím TRAF6 zprostředkované inhibice NF-κB a stimulace PI3K/AKT "Fytomedicína, sv. 42, s. 43–50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin a SJ Wang, "Echinacoside, aktivní složka Herba Cistanche, potlačuje epileptiformní aktivitu v hipokampálních CA3 pyramidálních neuronech," The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, sv. 22, č. 3, s. 249–255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao a X. Ma, "Terapeutický účinek cistanosidu A na kostní metabolismus ovariektomizovaných myší," Molecules, sv. 22, č. 2, str. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan a MI Georgiev, "Verbascoside – přehled jeho výskytu, (bio)syntézy a farmakologického významu," Biotechnology Advances, sv. 32, č. 6, s. 1065–1076, 2014.

[14] Redakční výbor Čínského lékopisu, Pharmacopeia Čínské lidové republiky, China Medical Science and Technology Press, Peking, Čína, 10. vydání, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li a kol., "Účinky tradičního čínského bylinného přípravku na osteoblasty a osteoklasty," Maturitas, sv. 61, č.p. 4, s. 334–339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong a Q. Zhao, „Cynomorium songaricum zabraňuje kostní resorpci u krys po ovariektomii prostřednictvím RANKL/RANK/TRAF6 zprostředkované suprese PI3K/AKT a NF-κB dráhy," Life Sciences, sv. 209, s. 140–148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang a kol., "Kaempferitrin zabraňuje úbytku kostní hmoty u krys po ovariektomii," Phytomedicine, sv. 22, č. 13, s. 1159–1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang a YW Cheng, „Posouzení bezpečnosti výrobku zdravé výživy Cistanche tubulosa Memoregain®: genotoxicita a 28-denní test toxicity po opakovaných dávkách“, Food and Chemical Toxicology , sv. 118, s. 581–588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng a F. Chen, "Systematický průzkum antioxidační aktivity 30 čínských léčivých rostlin pomocí testu antioxidační síly redukujícího železo," Food Chemistry, sv. 97, č.p. 4, s. 705–711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu a kol., "Cistanche deserticola polysacharid zeslabuje osteoklastogenezi a kostní resorpci prostřednictvím inhibice signalizace RANKL a produkce reaktivních forem kyslíku," Journal of Cellular Physiology, sv. 233, č.p. 12, s. 9674–9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang a W. Liang, "Vodný extrakt Cistanches Herba ovlivňující sérový BGP a TRAP a kostní dřeň Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA a TIEG1 Hladiny exprese mRNA u osteoporózy," Molecular Biology Reports, sv. 40, č. 2, s. 757–763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su a kol., "Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostí v osteoblastech," Journal of Pharmacy and Pharmacology, sv. 64, č.p. 6, s. 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong a Z. Huang, "Účinek vodného extraktu Cistanches Herba na ztrátu kostní hmoty u krys po ovariektomii," International Journal of Molecular Sciences, sv. 12, č. 8, s. 5060–5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang, et al., "Antiosteoporotic activity of echinacoside in ovariektomized rats," Phytomedicine, sv. 20, č. 6, s. 549–557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian a LL Xu, "Antiosteoporotická aktivita icariinu u krys po ovariektomii," Phytomedicine, sv. 16, č. 4, s. 320–326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed a M. Marzouk, "Možný antiosteoporotický mechanismus extraktu Cicer arietinum u krys po ovariektomii," International Journal of Clinical and Experimental Pathology, sv. 8, č. 4, s. 3477–3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, "Biochemical markers of bone turnover," Clinica Chimica Acta, sv. 313, č.p. 1-2, str. 95–105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy, et al., "Ovariektomie indukuje oxidační stres a narušuje kostní antioxidační systém u dospělých potkanů," Clinica Chimica Acta, sv. 360, č.p. 1-2, str. 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet a DL Lacey, "Osteoklastová diferenciace a aktivace," Nature, sv. 423, č.p. 6937, s. 337–342, 2003.