Bakteriální vezikuly blokují replikaci viru v makrofázích prostřednictvím osy TLR4-TRIF
Sep 27, 2023
Abstraktní
Gramnegativní bakterie přirozeně vylučují nano-velké vesikuly vnější membrány (OMV), které jsou důležitými zprostředkovateli komunikace a patogeneze. Příjem OMV hostitelskými buňkami aktivuje signalizaci TLR prostřednictvím transportovaných PAMP. Jako důležité rezidentní imunitní buňky jsou alveolární makrofágy umístěny na rozhraní vzduch-tkáň, kde tvoří první linii obrany proti vdechovaným mikroorganismům a částicím. Dosud je málo známo o souhře mezi alveolárními makrofágy a OMV z patogenních bakterií. Imunitní odpověď na OMV a základní mechanismy jsou stále nepolapitelné. Zde jsme zkoumali reakci primárních lidských makrofágů na bakteriální vezikuly (Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae) a pozorovali srovnatelnou aktivaci NF-κB napříč všemi testovanými vezikuly. Naproti tomu popisujeme rozdílnou signalizaci IFN typu I s prodlouženou fosforylací STAT1 a silnou indukcí Mx1, která blokuje replikaci viru chřipky A pouze pro OMV Klebsiella, E. coli a Salmonella. Antivirové účinky vyvolané OMV byly méně výrazné u Clear coli OMV bez endotoxinu a OMV ošetřené polymyxinem. LPS stimulace nemohla napodobit tento antivirový stav, zatímco TRIF knockout jej zrušil. Důležité je, že supernatant z makrofágů ošetřených OMV vyvolal antivirovou odpověď v alveolárních epiteliálních buňkách (AEC), což naznačuje mezibuněčnou komunikaci indukovanou OMV. Nakonec byly výsledky ověřeny na modelu infekce ex vivo s primární lidskou plicní tkání. Závěrem lze říci, že Klebsiella, E. coli a Salmonella OMV indukují antivirovou imunitu v makrofázích prostřednictvím TLR4-TRIF-signalizace ke snížení virové replikace v makrofázích, AEC a plicní tkáni. Tyto gramnegativní bakterie indukují antivirovou imunitu v plicích prostřednictvím OMV s potenciálně rozhodujícím a obrovským dopadem na výsledky bakteriální a virové koinfekce.
rostlina cistanche zvyšující imunitní systém
Klíčová slova
Extracelulární vezikuly, Vezikuly vnější membrány, Bakteriální a virová koinfekce, Pneumonie, Makrofágy, Alveolární epiteliální buňka, Antivirová vrozená imunita
Úvod
Vezikuly vnější membrány (OMV) jsou přirozeně uvolňovány gramnegativními bakteriemi, které měří až 300 nm v průměru. Gram-pozitivní bakterie jsou stejně schopné uvolňovat membránové vezikuly (MV). Tyto lipidové dvouvrstvé membránové struktury v důsledku své biogeneze obsahují kromě periplazmatického obsahu hlavní složky bakteriální (vnější) membrány, jako jsou lipidy, proteiny a v případě gramnegativních bakterií lipopolysacharidy (LPS) [1]. Kromě jejich role v bakteriální komunikaci byly OMV spojovány s patogenními účinky a transportem faktorů virulence, např. VacA z Helicobacter pylori, Shiga toxin z Shigella dysenteriae nebo ClyA z enterohemoragické Escherichia coli [2]. Ukázalo se, že tyto OMV manipulují s epiteliálními buňkami a imunitními reakcemi. Přítomnost bakteriálního endotoxinu na povrchu OMV spolu s dalšími transportovanými molekulárními vzory asociovanými s patogeny (PAMP) z nich činí silné stimulátory pro imunitní buňky, protože mohou být stále rozpoznány svými příslušnými receptory [3]. Zapojení Tolllike receptorů (TLR) a Nod-like receptorů ve vrozených imunitních buňkách může vyvolat uvolňování prozánětlivých a imunoregulačních cytokinů, včetně náboru neutrofilů nebo narušení těsných spojení ve vrstvách epiteliálních buněk [4]. Jedním z důležitých rezidentních imunitních buněk v plicích jsou alveolární makrofágy (AM), které sídlí na rozhraní vzduch-tkáň v alveolech. Prostřednictvím požití vdechovaných částic představují AM první linii obrany proti mikroorganismům a částicím fagocytózou a degradací. Při setkání s patogenem prezentují makrofágy antigeny buňkám adaptivní imunity a uvolňují prozánětlivé cytokiny. Mohou tak působit na alveolární epiteliální buňky typu I a II (AEC) a další imunitní buňky (Dodatečný soubor 1: Obr. S1A). AM mohou být aktivovány několika PAMP, aby se indukovala intracelulární signalizace a indukce odlišných vzorců genové exprese prostřednictvím různých imunitních receptorů [5, 6], což vede k signalizaci MyD88 nebo TRIF, které oba naopak indukují různé podskupiny genů (Další soubor 1 : Obr. S1B). Kromě toho plní další funkce v plicní homeostáze a patogenezi, což z nich činí centrální signální centrum a orchestrátor v plicní imunitě. Viry chřipky patří do čeledi Orthomyxoviridae a způsobují infekce horních a dolních cest dýchacích, od mírných až po těžké případy. Zatímco většina sezónních infekcí virem chřipky je spontánní, u některých pacientů se rozvine zápal plic a syndrom akutní respirační tísně, který podle odhadů způsobí až 650000 ročních úmrtí na celém světě [7]. Virus chřipky A (IAV) infikuje hlavně epiteliální buňky dýchacích cest a replikuje se v nich. Virová infekce vede k aktivaci a signalizaci receptoru rozpoznávání vzorů (PRR) prostřednictvím několika transkripčních faktorů, jmenovitě nukleárního faktoru kappa B (NF-κB) a interferonového regulačního faktoru (IRF)-3/7, které indukují typ I a III produkci interferonů (IFN). Tato výrazná odpověď IFN následně indukuje buněčný „antivirový stav“ auto- a parakrinním způsobem [8]. Kromě toho se při infekci vylučuje několik dalších cytokinů a chemokinů. Tato přísně regulovaná síť cytokinů obrany hostitele rekrutuje populace imunitních buněk do místa infekce a řídí vrozené a adaptivní imunitní reakce [9]. IAV však může také infikovat AM, což má za následek drasticky snížený počet AM během akutní infekce, kterou je třeba znovu obnovit, aby se infekce vyřešila. Aktivace vrozených imunitních buněk a sekrece prozánětlivých cytokinů vede k náboru dalších vrozených buněk, kontrolování infekce a inicializaci tkáňové opravy [10, 11]. Zde analyzujeme reakci makrofágů na bakteriální extracelulární vezikuly a jejich vliv na následnou infekci IAV.
Výhody doplňku cistanche-jak posílit imunitní systém
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
materiály a metody
Chemikálie a protilátky
Hamovo médium F12 bylo získáno od GE Healthcare Europe (Freiburg, Německo). RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, Penicilin/Streptomycin a FCS byly zakoupeny od Life Technologies (Darmstadt, Německo). PBS byl získán od Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Německo). Opti-MEM byl získán od Thermo Fisher Scientific (Frankfurt, Německo). Phorbol 12-myristát 13-acetát (PMA) byl dodán společností Sigma-Aldrich Chemie (Mnichov, Německo). LPS (Salmonella Minnesota R595, stupeň TLR) byl získán od Enzo Life Sciences (Lausen, Švýcarsko). Pam3CSK4 byl zakoupen od Invivogen (San Diego, USA). Inhibitor JAK Ruxolitinib byl získán od Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching, Německo). Polymyxin B byl zakoupen od Merck Millipore (Billerica, USA). Protilátky byly získány od Abcam (Cambridge, UK): Mx1 (ab95926), chřipkový nukleoprotein (9G8); Buněčná signalizace (Cambridge, Spojené království): fosfo-IRF-3 (Ser396)(4D4G), fosfo-TBK-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), fosfo- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), myší anti-králičí (L27A9), IRAK-1 (4359S), fosfo-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: kozí anti-myší (Alexa za 488); ProteinTech: anti-IRF-3 (66670-1) nebo Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Německo): -aktin (C4), anti-myší (mIgGκBPHRP, sc-516102). Všechny ostatní použité chemikálie byly analytické čistoty a byly získány z komerčních zdrojů.
Bakteriální kultivace a příprava OMV/MV
S kmenem Corby divokého typu L. pneumophila bylo zacházeno tak, jak bylo dříve popsáno [12]. K. pneumoniae (č. 700721/MGH78578), E.coli (č. 25922) a sérovar S. enterica Typhimurium (č. 14028) byly získány z American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). ClearColi™ BL21 byl od BioCat GmbH (Heidelberg, Německo). S. pneumoniae D39 Δcps laskavě poskytl Sven Hammerschmidt. Bakterie byly pěstovány na agarových plotnách přes noc (MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: Clear coli; plotny s krevním agarem: Sp) a poté použity k inokulaci tekutého média (LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp) . Bakterie byly pěstovány až do pozdní logaritmické fáze při 37 stupních za stálého třepání (MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Německo; kromě Sp). Bakteriální kultury byly poté třikrát odstředěny (4500 x g, 15 minut, 4 stupně; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). Zbývající bakterie byly odstraněny sterilní filtrací přes 0,22 um póry. Supernatant byl koncentrován pomocí 100 kDa molekulárních filtrů (Merck KGaA, Darmstadt, Německo) a vezikuly byly purifikovány buď ultracentrifugací nebo vylučovací chromatografií (SEC). Pro ultracentrifugaci byl supernatant ultracentrifugován při 100 000 x g, 3 h, 4 stupně. Po promytí získané pelety OMV/MV sterilním PBS byla ultracentrifugace opakována a peleta vezikul byla rozpuštěna ve sterilním PBS. Obsah proteinu byl stanoven soupravou pro stanovení proteinu Pierce BCA podle pokynů výrobce (Thermo Fisher Scientific) a pro stimulační experimenty byla použita stejná množství proteinu. Pro SEC byl supernatant koncentrován na 500 ul a nanesen na originální/70 nm Gen 2 kolony (IZON Science LTD, Lyon, Francie), které byly předem promyty 10 ml PBS podle protokolu výrobce. Vezikuly byly eluovány za použití sterilního PBS a byly odebrány frakce 500 ul. Vezikuly byly eluovány ve frakcích 7–12, což bylo stanoveno nano-průtokovou cytometrií (nFCM; NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK). Spojené frakce obsahující vezikuly byly zakoncentrovány na 200–400 µl pomocí filtrů s limitem molekulové hmotnosti (Merck KGaA). Koncentrace vezikul u všech přípravků byla stanovena pomocí nFCM a stejná množství vezikul byla použita pro stimulační experimenty. Příprava OMV/MV obou purifikačních metod byla zkontrolována na kontaminující bakterie nanesením a uložením v alikvotech při -20 stupni.
NFC
Pro nFCM byl Nano Analyzer (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK) vybavený laserem 488 nm kalibrován pomocí 200nm polystyrenových kuliček (NanoFCM Co.) s definovanou koncentrací 2,08×10^8 částic/ml a také se používá jako reference pro koncentraci částic. Kromě toho byly jako referenční standard pro kalibraci velikosti vezikul použity monodisperzní kuličky oxidu křemičitého (NanoFCM Co.) čtyř různých velikostí. Čerstvě filtrovaný (0,1 um) 1 x PBS byl analyzován jako signál pozadí a odečten od ostatních měření. Každý distribuční histogram nebo bodový graf byly odvozeny z dat shromážděných po dobu 1 minuty s tlakem vzorku 1 kPa. Vzorky OMV byly zředěny filtrovaným (0,1 µm) 1×PBS, což vedlo k počtu částic v optimálním rozsahu 2500–12,000 událostí. Koncentrace částic a distribuce velikosti byly vypočteny pomocí softwaru nFCM (NF Profession V1.08).
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM)
Měděné mřížky potažené uhlíkem (400 mesh) byly hydrofilizovány doutnavým výbojem (PELCO easiGlow, Ted Pella, USA). Pět ul vzorků bylo aplikováno na hydrofilizované mřížky a obarveny 2% (w/v) uranylacetátem po krátkém promývacím kroku dvakrát destilovanou vodou. Vzorky byly analyzovány transmisním elektronovým mikroskopem JEOL JEM-2100 za použití urychlovacího napětí 120 kV. Snímky byly pořízeny kamerou F214 FastScan CCD (TVIPS, Gauting, Německo).
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Buněčná kultura
Lidské buněčné linie (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) byly získány z American Type Culture Collection. Madin-Darby Canine Kidney II buňky (MDCK II) byly zakoupeny od ECACC-Sigma-Aldrich (Darmstadt, Německo). Buňky THP-1 Dual™ (Dual) a THP{9}} Dual™ TRIF-KO (TRIF-/-) byly získány od společnosti Invivogen Europe (Toulouse, Francie). Buňky byly kultivovány v Ham's F12, DMEM nebo RPMI-1640 doplněném 1 mM pyruvátem sodným, 2 mM glutaminem a také 10% tepelně inaktivovaným FCS za podmínek buněčné kultivace. Buňky THP-1 Dual™ byly kultivovány v RPMI-1640 doplněném 1% penicilinem/streptomycinem, 2 mM glutaminem, 10% teplem inaktivovaným FCS, 100 ug/ml Normocinu™ a 25 mM HEPES pufru. Buňky THP-1, Dual a TRIF−/− byly diferencovány v buňkách podobných makrofágům přidáním 20 nM PMA po dobu 24 hodin.
Klonování Mx1 do vektoru SparQ
Kódující sekvence Mx1 byla vytvořena z THP-1 cDNA pomocí Phusion PCR pomocí Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, USA) podle pokynů výrobce. HAtag byl přidán fúzí kódující sekvence HA k reverznímu primeru (smysl: 5'-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3′, antisense: 5'-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCAG{GACCGGGGG}ACCGTGGG} Fragment PCR stejně jako vektor SparQ (Addgene, Watertown, USA) byly štěpeny restrikčními enzymy BstbI a NotI (Thermo Fisher Scientific) a ligovány s T4 DNA ligázou (New England Biolabs) do vektoru SparQ.
Transfekce buněk HEK293T a produkce lentiviru
Buňky HEK293T byly transfekovány vektorem SparQ naředěným v Opti-MEM obsahujícím sekvenci pro Mx1 a sekvenci GFP, virovým balicím vektorem psPAX2 a obalovým plazmidem pVSV-G (Addgene) s Lipofectaminem 2000 (Thermo Fisher Scientific) podle protokolu výrobce. Byl produkován lentivirus a supernatant obsahující virus byl odebírán každý den po dobu 72 hodin. Supernatant byl filtrován pomocí 0,45 um filtru a byly transdukovány THP-1 buňky (viz níže). Prázdný vektor SparQ bez sekvence Mx1 byl použit pro transdukci buněk k vytvoření odpovídající kontrolní buněčné linie (VC=vektorová kontrola).
Transdukce buněk THP-1
Buňky THP-1 byly transdukovány lentivirem z filtrovaného supernatantu buněčné kultury HEK293T (viz výše). Pro zlepšení účinnosti transdukce byl přidán Polybrene (4 ug/ml, Sigma-Aldrich). Buňky byly inkubovány po dobu až šesti dnů. GFP-pozitivní buňky byly tříděny průtokovou cytometrií.
Izolace a diferenciace BDM
Lidské monocyty od zdravých dárců byly izolovány magnetickou CD14 pozitivní selekcí z mononukleárních buněk periferní krve a diferencovány na makrofágy odvozené z krve (BDM) v přítomnosti 1% lidského ABséra, jak bylo popsáno dříve [13].
OMV/MV stimulace makrofágů
Primární lidské makrofágy nebo diferencované THP{0}} buňky byly inkubovány s purifikovanými OMV/MV (1 µg/ml každý pro vezikuly purifikované ultracentrifugací a multiplicita vezikul (MOV) 1,000 pro SEC purifikované vezikuly) po dobu až 20 hodin v kompletním médiu. Další aplikace inhibitoru byla provedena 1 hodinu před ošetřením vezikul. Makrofágy stimulované Te byly použity buď pro izolaci proteinu nebo RNA nebo pro následné experimenty s infekcí. Získaný supernatant obsahující cytokiny byl použit pro analýzu ELISA nebo LDH nebo sterilně filtrován a použit pro stimulaci epiteliálních buněk.
Purifikace viru a titrace viru
Purifikace viru a titrace viru byly provedeny v buňkách MDCK II, jak bylo popsáno dříve [14]. Virový titr byl stanoven testem plaků, jak bylo popsáno dříve [15]. Stručně, konfluentní buňky MDCK II byly infikovány sériově zředěným virem nebo tkáňovým supernatantem (v kultivačním médiu MDCK II bez FCS). Virus se nechal adsorbovat na buňky po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Deset, inokulum bylo nahrazeno čerstvým médiem (doplněným 1 ug/ml TPCK ošetřeným trypsinem (pro IAV) a 1% Avicel® PH-101 (Sigma-Aldrich)). Buňky MDCK II byly obarveny krystalovou violetí nebo buňky infikované virem byly obarveny primární protilátkou (1:2,000) (myší nukleoprotein proti chřipce A, MCA400, Bio-Rad, Německo) a sekundární protilátkou ( 1:4,000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Německo) pro stanovení plaku. Plaky byly manuálně spočítány a vyjádřeny jako plakotvorné jednotky (pfu) na ml.
cistanche přínosy pro muže-posílení imunitního systému
Virová infekce
Po 20 hodinách předběžné stimulace bakteriálními vezikuly nebo supernatantem obsahujícím cytokiny byly buňky infikovány IAV nebo virem vezikulární stomatitidy (VSV). Makrofágy byly infikovány H1N1 (A/WSN/33) nebo VSV, zatímco epiteliální buňky byly infikovány H1N1 (A/Hamburg/2009/PDM), obojí v čerstvém médiu bez FCS. Po 1 hodině inokulace byl volný virus odstraněn a médium bylo nahrazeno médiem obsahujícím TPCK-trypsin pro IAV nebo prázdným médiem pro VSV. Buňky byly inkubovány po dobu až 48 hodin, aby se umožnila multicyklická replikace.
Příprava lidského PCLS
Plicní tkáň byla získána od pacientů, kteří podstoupili resekci laloku kvůli rakovině plic na lékařské fakultě v Hannoveru (MHH, Hannover, Německo). Pro experimenty byla použita pouze tkáň z makroskopicky a mikroskopicky prostých částí plic. Lidské precizně řezané plicní řezy (PCLS) byly připraveny tak, jak bylo popsáno dříve [16]. Dva řezy tkáně na jamku byly kultivovány na 24-jamkové destičce za ponořených podmínek (DMEM/F12 doplněné 1% penicilinem/streptomycinem) při 37 stupních, 5% CO2 přes noc.
IAV infekce PCLS
PCLS byly stimulovány 1 ug/ml OMV purifikovaných z L. pneumophila nebo K. pneumoniae zředěných v DMEM/F12 doplněném 1% penicilinem/streptomycinem při 37 stupních, 5% CO2 po dobu 20 hodin. Médium bylo odstraněno a PCLS byly naočkovány 25,000 pfu/jamku v 250 ul chřipkového viru A/California/04/2009 (H1N1pdm). PCLS byly inkubovány při 35 stupních a každých 15 minut během inokulace kolébány, aby se umožnila homogenní virová infekce. Poté bylo inokulum odstraněno a nahrazeno DMEM/F12 doplněným 1% penicilinem/streptomycinem. Po inkubaci po dobu 48 hodin byl shromážděn supernatant pro detekci viru, uvolňování LDH a kvantifikaci cytokinů. Vzorky pro měření cytokinů byly doplněny koktejlem 0,2% inhibitoru proteázy (P1860, Sigma-Aldrich, Mnichov, Německo) a skladovány při 80 stupních až do analýzy. PCLS byly zmraženy a skladovány při 80 stupních až do purifikace RNA, jak bylo popsáno dříve [17].
LDH
Test uvolňování LDH byl proveden podle pokynů výrobce s použitím soupravy Pierce™ LDH Cytotoxicity Assay Kit získané od Roche (Mannheim, Německo) nebo Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH) (Roche, Merck). Absorbance byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček infinite F200Pro (Tecan, Männedorf, Švýcarsko).
ELISA
Cytokiny CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 a IL-1 byly kvantifikovány z bezbuněčného supernatantu pomocí komerčně dostupných souprav ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Německo) podle pokynů výrobce instrukce.
Test QUANTI-blue™
Pro stanovení reportérové aktivity SEAP v supernatantu buněčné kultury z THP{0}} Dual™ a odpovídajících TRIF-/- buněk byl proveden test QUANTI-Blue™ podle protokolu výrobce. Stručně řečeno, supernatant buněčné kultury byl odebrán po stimulaci buněk pomocí OMV. Nejprve se roztok QUANTI-Blue™ a supernatant buněčné kultury nanesly do 96-jamkové destičky s tukovým dnem. Po inkubaci při 37 stupních po dobu 150 minut byla stanovena optická hustota při 630 nm ve čtečce mikrodestiček infinite F200Pro.
Test QUANTI‑luc™
Pro stanovení reportérové aktivity luciferázy Lucia v supernatantu buněčné kultury z THP{{0}}} Dual™ a odpovídajících TRIF-/- buněk byl proveden test QUANTI-Luc™ podle protokolu výrobce. Stručně řečeno, supernatant buněčné kultury byl nanesen na destičku s bílým 96-jamkovým dnem s tukovým dnem (BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Německo). Byl přidán testovací roztok QUANTI-Luc™ a okamžitě bylo provedeno měření luminiscence s dobou odečítání 0,1 s ve čtečce mikrodestiček infinite F200Pro.
Západní skvrna
Pro stanovení proteinové exprese nebo fosforylace byl proveden Western Blot, jak bylo popsáno dříve [18].
Příprava RNA a real-time PCR
Pro analýzu genové exprese byla izolace RNA provedena extrakcí fenol-chloroform a reverzně transkribována, jak bylo popsáno dříve [12]. Kvantitativní PCR v reálném čase byla poté provedena na ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) s Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) a specifickými páry primerů. Použitím metody 2−ΔΔCT [19] byla vypočtena x-násobná indukce a výsledky byly normalizovány na odpovídající kontrolní buňky. 18S: fwd: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, rev: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: fwd: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC′CCAACT′ rev:CAGCTTG{17} rev {20}}′ IFI44: fwd: 5′-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3′, rev: 5′-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3′ IFIT1: fwd: 5′}-ATGCAGCAG5{CATGA{CATGA{101} ´ -tctgggacactccattctatagcg -3 ′ Ifna1: FWD: 5'-ACAGGACCTTGATGCTC -3 ', Rev: 5'-TCTGCTGGATCAGCTCATGG -3}}}}}}}}}}}} {44 { } ' , rev: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: vpřed: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, rev: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTC{54}}′ fCAAGGdG:′GGAGD′′GATG2}:′ TCA{{ 58}}′, rev: 5′-CACCATTTCTCCAGGGGCAT-3′ Mx1: fwd: 5′-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3′, rev: 5′}CCTTGGAATGGTGG8CTGGAT'{wd -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, rev: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, rev: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, rev: 5′CATCTT}{GATCAC8T
Imunofluorescence
Buňky THP{{0}} byly na krycích sklíčkách diferencovány přidáním 20 nM PMA a inkubovány s OMV/MV po dobu 20 hodin. Buňky byly následně infikovány H1N1 (A/WSN/33; multiplicita infekce (MOI) 0,1) po dobu 4 hodin. Po 15 minutách fixace 3% paraformaldehydem byla sklíčka promyta třikrát PBS a permeabilizována 0,2% tritonem X-100 v TBS (10 minut, pokojová teplota). Po blokování (1% BSA v TBS/0,2% triton X-100) byly buňky inkubovány s -NP protilátkou (1:250, v blokovacím roztoku). Sekundární protilátka (1:1000) spolu s DAPI (1:2000) byla inkubována po dobu 1 hodiny ve tmě. Nasazená krycí sklíčka byla analyzována na fluorescenčním mikroskopu (AxioVision, Zeiss, Jena, Německo).
Etické prohlášení
Experimenty s řezy lidské plicní tkáně byly schváleny etickou komisí Hannoverské lékařské fakulty (MHH, Hannover, Německo) a jsou v souladu s Etickým kodexem Světové lékařské asociace (číslo 2701–2015). Všichni pacienti nebo jejich blízcí dali písemný informovaný souhlas s použitím plicní tkáně pro výzkum. Všichni dárci krve dali informovaný písemný souhlas (číslo etického schválení: 161/17).
Obr. 1 Charakterizace bakteriálních vezikul a reakce v lidských makrofázích. A Separace bakteriálních extracelulárních vezikulů od volných proteinů pomocí vylučovací chromatografie z různých bakteriálních supernatantů (Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal) a Streptococcus pneumoniae (Sp) ). Koncentrace vezikul v každé frakci byla stanovena nano-průtokovou cytometrií (nFCM) a proteiny byly kvantifikovány pomocí BCA. B Distribuce velikosti vezikul purifikovaných OMV/MV byly stanoveny pomocí NFC. C TEM obrazy purifikovaných OMV/MV. Měřítko=50 nm. D–G BDM byly stimulovány pomocí OMV/MV (každý 1 µg/ml) z různých bakterií nebo byly ponechány neošetřené pro kontrolu po dobu až 48 hodin. Uvolňování D CXCL8 bylo stanoveno pomocí ELISA a je uvedeno v ng/ml. Exprese IL1B (E) a IL12B (F) byla stanovena pomocí qPCR, výsledky jsou normalizovány na RPS18 a jsou znázorněny vzhledem k neošetřeným kontrolním buňkám. G Po 1 hodině inkubace s bakteriálními vezikuly byla pomocí Western Blot stanovena exprese a fosforylace IRAK-1, p38 a TBK-1. Jsou ukázány reprezentativní výsledky čtyř biologicky nezávislých replikací. Sloupce představují průměrné hodnoty + SEM ze tří (B) až čtyř (D–F) nezávislých experimentů. Statistika: 2-way ANOVA (DF); *str<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4
Statistika
Data jsou uvedena jako průměrné hodnoty + SEM pro alespoň tři biologicky nezávislé experimenty. Byl použit Prism 6.{6}}7 (GraphPad, La Jolla, USA). Jedno- nebo dvoucestné testy ANOVA byly provedeny pro nepárové vzorky. P-hodnoty Menší nebo rovné 0,05 byly považovány za statisticky významné. Pokud není uvedeno jinak, byly provedeny testy vs. odpovídající kontrola (*).
Dostupnost dat a materiálů
Všechna data vygenerovaná nebo analyzovaná během této studie jsou zahrnuta v tomto článku a jeho doplňkovém souboru.
Výsledek
Prozánětlivá aktivace makrofágů pomocí OMV/MV
Testovat vrozenou imunitní odpověď lidských primárních krevních makrofágů (BDM) na OMV/MV z různých bakterií, vezikuly z Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica sérovar Typhimurium (Sal ) a Streptococcus pneumoniae (Sp) byly izolovány pomocí vylučovací chromatografie (SEC). Frakce byly analyzovány na počet vezikul pomocí nano-průtokové cytometrie (nFCM) a na přítomnost proteinů pomocí BCA (obr. 1A). Vezikuly z frakcí 7–12 byly spojeny a použity pro experimenty. OMV/MV měly srovnatelný profil distribuce velikosti (obr. 1B), nelišily se průměrnou velikostí (doplňkový soubor 1: obr. S2A), byly koncentrovány stejně (doplňkový soubor 1: obr. S2B) a byly vizualizovány transmisním elektronem mikroskopie (TEM; obr. 1C). BDM byly stimulovány pomocí OMV/MV po dobu až 48 hodin, což odpovídá stejným koncentracím vezikul různých bakterií (Další soubor 1: Obr. S2C). Inkubace BDM s vezikulami nebyla cytotoxická (Dodatečný soubor 1: Obr. S2D). OMV/MV široce indukovaly expresi a uvolňování CXCL8 z makrofágů (Další soubor 1: Obr. S3A a 1D), zatímco indukce mRNA IL1B a IL12B byla závislá na čase a druhu (obr. 1E+F). Uvolňování IL-1 bylo závislé na druhu, ze kterého byly bakteriální vezikuly izolovány (Dodatečný soubor 1: Obr. S3B). Ačkoli fosforylace p38 byla srovnatelná u BDM po 1 hodině inkubace vezikul, pouze OMV z degradace IRAK vyvolané gramnegativními bakteriemi-1 a fosforylace TBK-1, ale nikoli MV z grampozitivních (obr. 1G a doplňkový soubor 1: S4A-D).
Obr. 2 Bakteriální extracelulární vezikuly aktivují odpověď na interferon typu I u BDM. BDM byly stimulovány pomocí OMV/MV (1 ug/ml každý) z různých bakterií nebo byly ponechány neošetřené jako kontrola. Fosforylace a exprese IRF-3 byly stanoveny po 1 hodině OMV/MV inkubace pomocí Western Blot. Je ukázán reprezentativní výsledek tří biologicky nezávislých replikací. Exprese IFNA1 (B), IFNB (C), IFIT1 (E) a IFI44 (F) byla měřena pomocí qPCR, výsledky jsou normalizovány na RPS18 a jsou znázorněny vzhledem k neošetřeným kontrolním buňkám. D Fosforylace STAT1 byla stanovena pomocí Western Blot po 2 hodinách OMV/MV stimulace. Je ukázán reprezentativní výsledek čtyř biologicky nezávislých replikací. G Fosforylace STAT1 a exprese Mx1 byly stanoveny pomocí Western Blot po 20 hodinách stimulace bakteriálních vezikul. Jsou znázorněny reprezentativní výsledky čtyř biologicky nezávislých replikací. Sloupce představují průměrné hodnoty + SEM ze čtyř nezávislých experimentů. Statistika: 2-way ANOVA; *str<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4
Kromě aktivace NF-κB a AP-1 a jejich downstream cílů může PRR signalizace vést k aktivaci IRF. Byla tedy stanovena fosforylace IRF-3. Kp/Ec/SalOMV zvýšily fosforylaci IRF-3 v BDM (obr. 2A), což má za následek expresi IFN I (obr. 2B+C), downstream fosforylaci STAT1 (obr. 2D a další soubor 1: S4E) a indukci interferonem stimulovaných genů (ISG; IFIT1, IFI44 a Mx1; obr. 2E-G). Protože fosforylační události jsou typicky krátkodobé a je známo, že hrají kritickou roli při zapínání a vypínání imunitních signalizačních kaskád, byla fosforylace STAT1 také zkoumána 20 hodin po přidání Kp/Ec/SalOMV (obr. 2G a další soubor 1: S4F+G). Experimenty ukázaly, že OMV nejen aktivují prozánětlivou signalizaci v makrofázích, ale je také indukována antivirová signalizace.
Preinkubace OMV mění replikaci IAV v makrofázích
Mx1 je dobře známý antivirový faktor inhibující replikaci IAV [20], který byl exprimován při Kp/Ec/SalOMV léčbě makrofágů. Proto jsme předpokládali, že předléčení OMV mění replikaci viru. Experimenty s infekcí IAV byly nastaveny v buňkách THP-1, které exprimují podobné hladiny Mx1 po ošetření Kp/Ec/SalOMV na hladinách mRNA a proteinů (Dodatečný soubor 1: Obr. S5A+B) a indukují fosforylaci STAT1 , zatímco celkový protein STAT1 zůstává stabilní (Další soubor 1: Obr. S5C), s kmenem H1N1 (A/WSN/33), který infikuje a replikuje se v makrofázích [21]. Předstimulace buněk THP-1 pomocí LpOMV/SpMV zvýšila replikaci IAV 24 hodin po infekci (pi) ve srovnání s infikovanou kontrolou (–-), zatímco předléčení Mx1-indukovalo OMV (Kp /Ec/Sal) zablokoval replikaci IAV (obr. 3A). Zatímco předběžná léčba agonistou TLR2/1 Pam3CSK4 mohla napodobit účinek pozorovaný u LpOMV/SpMV, o nichž je známo, že oba signalizují prostřednictvím TLR2/1 [12, 22, 23], rozpustný LPS jako agonista TLR4 nereprodukoval Kp/Ec /SalOMV efekt (Dodatečný soubor 1: Obr. S5D). Rozdíly v zátěži IAV po předléčení lze také pozorovat imunofluorescenčním barvením proti virovému nukleoproteinu (NP) (obr. 3B). Předběžná léčba Kp/Ec/SalOMV blokovala replikaci IAV a NP-pozitivní oblast byla významně snížena (obr. 3C). To nebylo možné pozorovat po předběžném ošetření LpOMV/SpMV. Aby se zjistilo, zda je indukce Mx1 dostatečná pro pozorovanou blokovanou replikaci IAV, byla Mx1 stabilně nadměrně exprimována (pohlaví) v THP-1 makrofázích, aby napodobila předstimulaci OMV (Dodatečný soubor 1: Obr. S5E). IAV infekce buněk Mx1oex vedla ke snížení imunofluorescenční NP-pozitivní oblasti 4 h pi (obr. 3D) a ke snížení replikace viru 6 h pi ve srovnání s kontrolou prázdného vektoru (VC) (obr. 3E), i když k menší rozsahu ve srovnání s prestimulací OMV (obr. 3A). Závěrem lze říci, že Kp/Ec/SalOMV aktivoval makrofágy klasickým prozánětlivým způsobem a indukoval antivirové geny, což mělo za následek aktivaci IFN-/ receptoru (IFNAR), downstream fosforylaci STAT1 a expresi Mx1, což může přímo interferovat s replikací IAV ( Obr. 4A). Pro potvrzení důležitosti signalizace JAK/STAT pro pozorovanou indukci antivirové odpovědi byl před stimulací vezikul aplikován inhibitor JAK (JAKi). Inhibice JAK nezměnila expresi CXCL8 indukovanou Kp/SalOMV (obr. 4B), ale významně snížila Mx1 na mRNA (obr. 4C) a hladinu proteinu i po infekci IAV (obr. 4D a další soubor 1: S6A). V souladu s tím JAKi zvrátila blokádu virové replikace indukovanou OMV (obr. 4E).
Obr. 3 Mx1-indukující OMV blokují replikaci viru chřipky A v THP-1 buňkách. Replikace viru chřipky A v diferencovaných buňkách THP-1. Buňky byly buď předem ošetřeny OMV/MV (1 ug/ml každý), nebo byly ponechány neošetřené pro kontrolu (–). Po 20 hodinách předběžného ošetření byly buňky infikovány A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) po dobu 24 a 48 hodin. Replikace IAV byla stanovena pomocí qPCR proti IAV-NP normalizované na 18S. Jsou uvedeny průměrné hodnoty ± SEM ze tří až pěti nezávislých experimentů. B Diferencované THP-1 buňky byly předem ošetřeny OMV/MV (1 ug/ml každý) nebo ponechány neošetřené pro kontrolu (–). Po 20 hodinách preinkubace byly buňky infikovány A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,1) po dobu 4 hodin. Po fixaci byly buňky obarveny protilátkou proti chřipce NP (žlutá) a DAPI (modrá). Je ukázán reprezentativní výsledek ze čtyř biologických nezávislých experimentů. C Kvantifikace NP pozitivní (NP+) oblasti z (B). Sloupce představují průměrné hodnoty čtyř nezávislých experimentů + SEM. D THP-1 buňky stabilně nadměrně exprimující Mx1 (Mx1oex) a prázdné vektorové kontrolní (VC) buňky byly infikovány chřipkovým virem A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,1) po dobu 4 hodin. Po fixaci a imunofluorescenčním barvení s -chřipkovým NP byla kvantifikována oblast NP+ a je znázorněna vzhledem k buňkám VC. Sloupce ukazují průměrné hodnoty čtyř nezávislých experimentů + SEM. E Mx1oex a VC buňky byly infikovány A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,001) po dobu 6 hodin. Virová replikace byla stanovena plakovým testem a výsledky jsou znázorněny jako plakotvorné jednotky (pfu) na ml. Sloupce představují průměrné hodnoty + SEM ze čtyř nezávislých experimentů. Statistika: 2-cesta ANOVA (A), 1-cesta ANOVA (C), nepárový t-test (D+E); *str<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5
Antivirová odpověď na OMV je závislá na TLR4-TRIF
K identifikaci zúčastněných PRR se aplikovali komerční imunitní agonisté samostatně nebo v kombinaci s LPS k napodobení OMV. U KpOMV však nebyla pozorována žádná zrcadlená indukce Mx1 (Dodatečný soubor 1: Obr. S7), což naznačuje rozdílnou a prodlouženou aktivaci makrofágů pomocí OMV kvůli jejich složení ligandu nebo prostorové prezentaci PRR. Zapojené imunitní receptory byly dále hodnoceny reportérovými buňkami THP-1 na NF-KB- a IRF-signalizaci (obr. 5A). Po ošetření KpOMV buňky THP-1 vykazovaly významně zvýšenou expresi proteinu Mx1 (obr. 5B a další soubor 1: S6B), který byl ztracen v buňkách THP-1 s deficitem TRIF (TRIF−/−) ( Obr. 5B a doplňkový soubor 1: S6B). Totéž bylo pozorováno u reportéru IRF (obr. 5C), zatímco aktivace reportéru NF-κB a indukce CXCL8 byly po stimulaci vysoké u buněk THP-1 i TRIF−/− (obr. 5D+E). STAT-dependentní IFIT1, IFI44 a Mx1 genová exprese byla indukována po stimulaci KpOMV v THP-1 reportérových buňkách (obr. 5E), zatímco u stejně stimulovaných TRIF−/− buněk byla významně snížena (obr. 5E). Další infekce IAV po předstimulaci vedla ke snížení replikace viru, zatímco delece TRIF zachránila replikaci IAV (obr. 5F). Aby se zjistilo, zda KpOMV vyvolávají obecnou antivirovou odpověď v makrofázích, byly buňky infikovány virem vezikulární stomatitidy (VSV), který se replikoval v kontrolních buňkách, ale byl blokován v buňkách předem ošetřených KpOMV a mohl být také zachráněn delecí TRIF (obr. 5G). Protože rozpoznání LPS prostřednictvím TLR4 je nezbytné pro endocytózu a aktivaci TRIF, LPS na povrchu OMV byl neutralizován lipopeptidovým antibiotikem Polymyxin B (PB), což vedlo k 50% snížení indukce Mx1 (obr. 6A+B a další soubor 1 : S6C), ale žádný významný rozdíl v transkripci CXCL8 závislé na NF-KB (obr. 6C). Virová replikace byla obnovena na bazální úroveň po prestimulaci KpOMV+PB (obr. 6D). Protože inhibice rozpoznání LPS pomocí PB byla nedostatečná pro úplné blokování Mx1, byly OMV z Clear coli bez endotoxinu (Cc) izolovány a použity pro předstimulaci. Cc exprimuje změněný lipid A a nemůže indukovat aktivovaný komplex TLR4/MD2 [24]. CcCOMV neindukovaly Mx1 (obr. 6A+B a další soubor 1: S6C) a nesnižovaly replikaci IAV v makrofázích (obr. 6D). Je dobře známo, že izolace extracelulárních vezikul pomocí diferenciální ultracentrifugace vede ke společné izolaci kontaminujících látek (např. proteinů nebo bakteriálních buněčných přídavků) spolu s vezikulami. V souladu s pokyny MISEV2018 [25] byly klíčové experimenty opakovány s OMV izolovanými kombinací ultrafiltrace (UF) a vylučovací chromatografie (SEC). Stimulace reportérových buněk THP-1 pomocí UF-SEC purifikovaných KpOMV vedla k indukci Mx1 (Dodatečný soubor 1: Obr. S8A) a IRF reportéru (Obr. S8B), zatímco byl ztracen v TRIF−/− makrofázích ( Doplňkový soubor 1: Obr. S8A+B). Replikace IAV byla blokována v buňkách předem ošetřených KpOMV a zachráněna po deleci TRIF (Dodatečný soubor 1: Obr. S8C). NF-KB reportérová aktivita byla indukována KpOMV bez ohledu na TRIF status buněk (Dodatečný soubor 1: Obr. S8D).
Obr. 4 Inhibice signalizace JAK zachraňuje replikaci viru chřipky A v makrofázích. OMV aktivuje TRIF-IRF-signalizaci v makrofázích, což zase indukuje IFN-expresi a uvolňování s následnou IFNAR-signalizací. IFNAR signalizuje přes JAK/STAT a indukuje expresi ISG, z nichž jeden je Mx1. To vede k zablokování replikace IAV. Buňky B–E THP-1 byly preinkubovány po dobu 1 hodiny s 10uM inhibitorem JAK (JAKi) před přidáním OMV (1 µg/ml; Kp/Sal) po dobu 2{{22 }} h. Exprese B–C CXCL8 (B) a Mx1 (C) byla stanovena pomocí qPCR a výsledky jsou normalizovány na RPS18 a znázorněny vzhledem k neléčené kontrole. Sloupce ukazují průměrné hodnoty tří až čtyř nezávislých experimentů + SEM. Buňky předem ošetřené D+E OMV byly navíc infikovány IAV (MOI 0,001). D Western blot ukazuje expresi proteinu Mx1 0–3 hodiny po infekci (pi). E Virová replikace byla stanovena plakovým testem 24 hodin po infekci. Sloupce ukazují průměrné hodnoty čtyř nezávislých experimentů + SEM. Statistika: 1-way ANOVA (B+C+E); *str<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4
Obr. 5 OMV indukují antivirovou signalizaci v makrofázích prostřednictvím TRIF. THP-1 duální reportérové buňky indukují expresi secernované embryonální alkalické fosfatázy (SEAP) po aktivaci dráhy NF-KB a expresi a sekreci luciferázy Lucia po aktivaci dráhy IRF. Navíc byly diferencovány TRIF (šedé sloupce) a následně stimulovány −/− buňkami, které mají stabilní knockout molekuly adaptéru TRIF. (BF) THP-1 reportérové buňky (=Dual; černé pruhy) a TRIF−/− buňky KpOMV (1 µg/ml) po dobu 20 h nebo ponechány neošetřené pro kontrolu. Po uvedené době se shromáždil supernatant, RNA a/nebo proteiny. B Reprezentativní Western Blot obraz exprese proteinu Mx1. Aktivita reportéru C+D Lucia (C) a aktivita reportéru SEAP (D) byla stanovena v supernatantu buněčné kultury. Ke stanovení aktivity obou reportérů byl použit stejný supernatant. E Relativní exprese mRNA pro cílové geny závislé na STAT a NF-KB (shora dolů: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) byla stanovena pomocí qPCR a výsledky jsou normalizovány na RPS18 a znázorněny vzhledem k nestimulované duální kontrole. Změny skládání byly transformovány log2. Buňky byly dále infikovány A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) po dobu 24 hodin (F) nebo VSV (MOI 0,1) po dobu 12 hodin (G). Replikace viru byla stanovena plakovým testem. Sloupce ukazují průměrné hodnoty čtyř (C–F) až pěti (G) nezávislých experimentů + SEM. Statistika: 2-way ANOVA (C–G); *str<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5
Obr. 6 OMV-indukovaná exprese Mx1 je ztracena po inhibici LPS. Buňky THP-1 byly inkubovány po dobu 20 h s OMV (1 µg/ml; Kp nebo Clear coli (Cc)) samostatně nebo v kombinaci s 20 µg/ml Polymyxin B (PB) nebo byly ponechány neošetřené pro kontrolu. Exprese proteinu Mx1 byla stanovena pomocí Western Blot. Je ukázán reprezentativní výsledek tří biologicky nezávislých experimentů. Exprese Mx1 B a CXCL8 C byly stanoveny pomocí qPCR. Sloupce ukazují průměrné hodnoty čtyř nezávislých experimentů + SEM. Buňky D THP-1 byly inkubovány po dobu 20 hodin s OMV (1 ug/ml; Kp nebo Cc) samotnými nebo v kombinaci s 20 ug/ml PB nebo byly ponechány neošetřené pro kontrolu a poté navíc infikovány A/WSN/33 (H1N1) (MOI 0,001). Replikace viru byla stanovena plakovým testem 24 hodin po infekci. Sloupce ukazují průměrné hodnoty čtyř nezávislých experimentů + SEM. Statistika: 1-způsob ANOVA B–D; *str<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4
Účinek OMV inhibující replikaci IAV je přenosný na AEC
Protože makrofágy nejsou hlavním buněčným typem pro replikaci IAV v plicích a protože IFN I působí také parakrinně, byla testována přenositelnost efektu replikace IAV na AEC, protože tyto buňky na rozdíl od makrofágů přímo nereagují na OMV/MV ( Doplňkový soubor 1: Obr. S9). Supernatant (SN) z makrofágů ošetřených KpOMV indukoval Mx1 v buňkách A549, na rozdíl od LpOMV-SN (obr. 7A), zatímco CXCL8 byl indukován po obou (obr. 7B). KpOMVSN redukoval virovou replikaci (obr. 7C), což bylo v souladu s makrofágovými experimenty a vzorem indukce Mx1. Aby se potvrdila závislost pozorovaného účinku omezujícího IAV na signalizaci JAK/STAT, byl KpOMV-SN kombinován s JAKi, čímž se blokovala indukce Mx1 po léčbě KpOMV-SN (obr. 7A) a obnovila se replikace IAV (obr. 7C). Pro napodobení komplexní regulace imunitních procesů v plicích byla vytvořena ex vivo infekce IAV lidských precizně řezaných plicních řezů (PCLS). Lp/KpOMV nebyly cytotoxické pro PCLS (obr. 8A) a kombinace předstimulace OMV a infekce IAV vedla k indukci Mx1 (obr. 8B) a uvolnění CXCL10 (obr. 8C). KpOMV, ale ne LpOMV významně snížily replikaci IAV v PCLS (obr. 8D). Pozorované účinky byly odstraněny infekcí UV inaktivovanou IAV (obr. 8A–C). Naše zjištění vedou k modelu zánětu plic, kde AM reagují na OMV z gramnegativních bakterií indukcí IFN I, indukují antivirové reakce autokrinním způsobem u AM a parakrinním způsobem u AEC in vitro a v ex vivo modelu PCLS (obr. 8E).
Obr. 7 Účinek OMV inhibující replikaci viru chřipky A je přenosný na AEC. Buňky THP-1 byly inkubovány s LpOMV nebo KpOMV po dobu 20 hodin nebo byly ponechány neošetřené pro kontrolu. Supernatant (SN) byl sterilně filtrován a použit pro předstimulaci buněk A549 po dobu 20 h samostatně nebo v kombinaci s 10 uM JAKi. Exprese A+B Mx1 (A) a CXCL8 B byly stanoveny pomocí qPCR v časovém bodě infekce (0 h pi). Sloupce ukazují průměrné hodnoty čtyř nezávislých experimentů + SEM normalizované na neošetřené kontrolní buňky. C Předem ošetřené buňky A549 byly navíc infikovány virem chřipky A/Hamburg/5/2009(H1N1pdm) (MOI 0,01) po dobu 24 hodin. Replikace viru byla stanovena plakovým testem. Sloupce jsou průměrné hodnoty ze čtyř nezávislých experimentů + SEM. Statistika: 1-way ANOVA; **str<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4
Diskuse
Zjistili jsme, že vezikuly z různých bakterií indukují rozdílnou signalizaci v makrofázích, která je schopna omezit replikaci IAV při následné infekci. V souladu s literaturou byly izolované OMV z Lp, Kp, Ec a Sal a MV z Sp srovnatelné velikosti [26–28]. Makrofágy inkubované s bakteriálními vezikuly nevykazovaly cytotoxicitu [29, 30], ale vyvolaly prozánětlivou odpověď. Všechny vezikuly spouštěly fosforylaci p38 a uvolňování CXCL8 a IL-1 z primárních lidských makrofágů, zatímco byly rozdíly v indukci IFN I a jejich downstream signalizaci. My a jiní jsme již ukázali, že signál LpOMVs prostřednictvím TLR2 [12, 22] a také SpMV indukoval zřetelný aktivační vzorec v makrofázích [31]. LpOMVs/SpMVs aktivovaly prozánětlivé cílové geny NF-KB, jak je popsáno pro původní bakterie [12, 22, 31]. Rozpoznání Kp/Ec/SalOMV vyvolalo kromě cílových genů NF-KB také indukci fosforylace IRF-3 s následnou expresí IFNB a dlouhotrvající fosforylaci STAT1 spolu s indukcí ISG, což argumentovalo pro aktivní Signalizace IFNAR-JAK/STAT. OMV nesou LPS na svém povrchu, ale prozánětlivou kapacitu OMV nelze napodobit s čistým LPS. My a další jsme pozorovali, že makrofágy jsou citlivější na OMV ve srovnání se stejným množstvím čistého LPS [32, 33]. OMV obsahují množství imunitních agonistů, které jsou potřebné pro indukci robustní imunitní odpovědi [32]. Komerční agonisté TLR a RIG-I samotné nebo v kombinaci s LPS nemohly napodobit účinek. Již dříve bylo prokázáno, že lipozomy s LPS indukovaly delší aktivaci TRIF-IRF-3 v makrofázích ve srovnání s volným LPS [34]. Pomocí TRIF−/− makrofágů jsme ukázali závislost ISG indukce na této adaptorové molekule. Navíc CcOMV nebo OMV bez endotoxinu v kombinaci s LPS maskováním PB byly dostatečné ke zrušení reakce makrofágů. To ukazuje na rozpoznání OMV prostřednictvím TLR4 s následnou endocytózou a TRIF-signalizací. V souladu s tím byly Kp/Ec/SalOMV schopny vyvolat prozánětlivou aktivaci makrofágů prostřednictvím TLR4 vedoucí k signalizaci MyD88 a expresi genu závislé na NF-KB, stejně jako k signalizaci TRIF s odpovědí IFN I. To je v souladu s literaturou, která ukazuje, že TLR4 a TRIF společně jsou vyžadovány pro imunogenicitu OMV Neisseria meningitidis u myší [35]. Protože IFN typu I jsou hlavními regulátory antivirových odpovědí, předpokládali jsme, že rozpoznání Kp/Ec/SalOMV ovlivňuje replikaci IAV. Prokázali jsme, že makrofágy účinně blokovaly replikaci IAV a VSV po předléčení OMV aktivujícím TRIF, zatímco TRIF–/– zachránila replikaci viru. Abychom přesně určili účinek na signalizaci IFNAR, inhibice JAK1/2 kombinovaná s OMV úspěšně blokovala STAT1-závislou indukci Mx1 a zachránila virovou replikaci v makrofázích. Kombinace KpOMV s PB nebo aplikace CcOMV bez endotoxinu nesnížila replikaci IAV v makrofázích, protože nebyly schopny indukovat antivirové geny. Vzhledem k tomu, že extracelulární vezikulové preparáty získané ultracentrifugací obsahují vedle vezikul volné proteinové a bakteriální buněčné vazby, byly OMV preparáty navíc generovány kombinací ultrafiltrace a velikostně vylučovací chromatografie [25].
Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová
Získané čisté preparáty vezikul byly stejně schopné indukovat TRIF-IRF signalizaci s downstream Mx1 indukcí a blokovaly virovou replikaci, což argumentuje přímým efektem vezikul. Ačkoli ATM jsou první linií obrany v plicích, většina infekcí a replikace IAV v lidských plicích probíhá v AEC [36]. Proto byly AEC stimulovány pomocí OMV, ale nereagovaly na stimulaci jako makrofágy. Pouze bronchiální epiteliální buněčná linie BEAS2B reagovala expresí CXCL8, ale postrádala indukci Mx1. Protože jsme mohli ukázat antivirovou genovou expresi závislou na TLR4 a TRIF v makrofázích, předpokládáme, že čtyři testované epiteliální buněčné linie neexprimují TLR4 v podobném rozsahu jako makrofágy a že se jim nepodařilo endocytovat OMV po aktivaci TLR4. To je v souladu s literaturou, která ukazuje, že izolované lidské AEC nereagují na LPS jako párové AM [37]. Protože jsme spojili antivirový stav po preinkubaci OMV s IFN I, použili jsme supernatant makrofágů stimulovaných OMV k předběžné stimulaci AEC. Kondicionované médium makrofágů stimulovaných KpOMV, na rozdíl od přímé stimulace vezikul, indukovalo expresi Mx1 v těchto buňkách a snižovalo replikaci IAV v následných infekčních experimentech. Supernatant z makrofágů ošetřených LpOMV indukoval CXCL8 v epiteliálních buňkách, ale nezpůsobil žádnou indukci Mx1 a změny ve virové replikaci. Aby se účinek pozorovaný u kondicionovaného média připsal IFN I, byl supernatant kombinován s inhibitorem JAK1/2, blokujícím indukci Mx1, a neměl žádný účinek na replikaci viru. Vzhledem k tomu, že souhra různých typů buněk v lidských plicích je složitější a nemůže být plně napodobena kondicionovaným médiem, rozšířili jsme náš přístup na životaschopné úseky lidské distální plicní tkáně, která byla široce používána pro studie interakcí hostitel-patogen, včetně virové chřipky a bakteriální infekce [38–41]. Na rozdíl od použitých in vitro modelů si ex vivo lidská plicní tkáň zachovává trojrozměrnou architekturu plic a umožňuje fyziologickou souhru mezi rezidentními buněčnými typy v plicích, ale postrádá možnost přílivu dalších rekrutovaných imunitních buněk. Konsekutivní infekce KpOMV stimulovaného PCLS pomocí IAV snížila virovou zátěž ve srovnání s předem neošetřenými kontrolami. Protože všechny AEC testované in vitro nereagovaly na přímou stimulaci bakteriálních vezikul, předpokládáme, že v tomto ex vivo modelu jsou AM převládajícím typem odpovídajících buněk. Protože pro následnou infekci byl vybrán chřipkový izolát, který výhradně infikuje a replikuje se v AEC, lze předpokládat, že se jedná o parakrinní antivirový účinek pocházející z AM a přenášený na AEC. Na základě zde získaných dat navrhujeme následující model (obr. 8E): OMV z gramnegativních bakterií mohou aktivovat lidské makrofágy klasickým prozánětlivým způsobem a po úspěšné endocytóze je antivirově aktivovat prostřednictvím TLR4 a TRIF. vezikuly. Uvolňování IFN I může zase učinit makrofágy a/nebo AEC antivirovými prostřednictvím IFNAR a JAK/STAT signalizace. Následná infekce těchto buněk způsobí snížení virové zátěže zprostředkované Mx{31}}. Protože jsme neměli přístup k primárním lidským AM, experimenty byly provedeny s použitím lidských BDM jako modelu. Vzhledem k různému vývojovému původu a primingu těchto makrofágů je možné, že AM by vykazovaly slabší prozánětlivou odpověď na rozdíl od BDM. Bakteriální vezikuly se již používají ve strategiích očkování proti různým patogenům vyvolávajícím pneumonii (přehled v [42]). OMV tedy nepředstavují pouze nástroj pro potenciální systémové vakcinační strategie proti jejich hostitelským bakteriím, ale mohly by být také použity lokálně k boji proti virovým infekcím aktivací rezidentních vrozených imunitních buněk. Budoucí studie in vivo jsou potřebné k testování, zda jsou tato zjištění in vitro použitelná i na jiné virové patogeny. Kromě toho je třeba poznamenat, že možná se vyskytující endotoxická reakce musí být kriticky monitorována, aby se zabránilo přehnaným imunitním reakcím in vivo. Indukce IFN typu I musí být přísně kontrolována, protože u zdravých jedinců bylo prokázáno, že inhalace agonisty TLR7 byla zpočátku dobře tolerována po první dávce, ale vedla ke zvýšené odpovědi TNF a IFN I a symptomům podobným chřipce po druhé dávce [43]. Pro boj s nepříznivými účinky mohou být zapotřebí geneticky modifikované verze OMV, které navozují vyváženou imunitní odpověď a dosahují dobré použitelnosti. Souhrnně zde představujeme model toho, jak OMV mohou indukovat antivirovou signalizaci v lidských makrofázích a jak to lze použít k prevenci replikace IAV.
Obr. 8 KpOMV snižuje replikaci viru chřipky A v lidských přesně řezaných plicních řezech. Lidské PCLS byly inkubovány s 1 ug/ml OMV (Lp/Kp) po dobu 20 hodin a poté navíc infikovány chřipkou A/California/04/2009 (H1N1pdm) po dobu 48 hodin. UV inaktivace viru sloužila jako kontrola. Cytotoxicita byla stanovena kvantifikací uvolněného LDH z PCLS a je znázorněna v % ve srovnání s celkovou lýzou. Exprese B Mx1 byla kvantifikována pomocí qPCR a je prezentována vzhledem k RPS18 a neošetřeným kontrolním PCLS. Uvolňování C CXCL10 bylo stanoveno pomocí ELISA a je uvedeno v ng/ml. D Virová replikace byla stanovena plakovým testem a je znázorněna v pfu/ml. Sloupce ukazují průměrné hodnoty tří až pěti biologických replikátů + SEM. E Navrhovaný model pro indukci antivirové imunity OMV v plicích. Statistika: 1-way ANOVA (AC), Friedman-test (D); *str<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5
Reference
1. Kulp A, Kuehn MJ. Biologické funkce a biogeneze secernovaných bakteriálních vezikul vnější membrány. Annu Rev Microbiol. 2010;64:163–84.
2. Ellis TN, Kuehn MJ. Virulence a imunomodulační role vezikul vnější membrány bakterií. Microbiol Mol Biol Rev. 2010;74(1):81–94.
3. Giordano NP, Cian MB, Dalebroux ZD. Sekrece lipidů vnější membránou a vrozená imunitní odpověď na gramnegativní bakterie. Infect Immun. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.
4. Mancini F, a kol. OMV vakcíny a role agonistů TLR v imunitní odpovědi. Int J Mol Sci. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.
5. Hu G, Christman JW. Úvodník: alveolární makrofágy při zánětu a řešení plic. Front Immunol. 2019;10:2275.
6. Grassin-Delyle S, a kol. Role toll-like receptorů v produkci cytokinů lidskými plicními makrofágy. J Innate Immun. 2020;12(1):63–73.
7. Přehled o chřipce (sezónní). 2018; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(sezónní)
8. Crotta S, a kol. Interferony typu I a typu III řídí redundantní amplifikační smyčky k indukci transkripčního podpisu v epitelu dýchacích cest infikovaných chřipkou. PLoS Pathog. 2013; 9(11): e1003773.
9. Bals R, Hiemstra PS. Vrozená imunita v plicích: jak epiteliální buňky bojují proti respiračním patogenům. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.
10. Helft J, et al. Křížově prezentující CD103+ dendritické buňky jsou chráněny před infekcí virem chřipky. J Clin Invest. 2012;122(11):4037–47.
11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. Deplece alveolárních makrofágů během chřipkové infekce usnadňuje bakteriální superinfekce. J Immunol. 2013;191(3):1250–9.
12. Jung AL, et al. Vezikuly vnější membrány pocházející z Legionella pneumophila podporují replikaci bakterií v makrofázích. PLoS Pathog. 2016;12(4): e1005592.
13. Lindhauer NS, a kol. Antibakteriální aktivita defensinu Tribolium castaneum v in vitro modelu infekce Streptococcus pneumoniae. Virulence. 2019;10(1):902–9.
14. Danov O, a kol. Cigaretový kouř ovlivňuje populace dendritických buněk, funkci epiteliální bariéry a imunitní odpověď na virovou infekci H1N1. Přední Med. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.
15. Matrosovich M, et al. Nové překryvné médium s nízkou viskozitou pro testy virových plaků. Virol J. 2006;3:63. 16. Neuhaus V, a kol. Hodnocení cytotoxických a imunomodulačních účinků látek v lidských přesně řezaných plicních řezech. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, a kol. Izolace RNA z precizně řezaných plicních řezů (PCLS) z různých druhů. Poznámky BMC Res. 2017;10(1):121.
18. Schulz C, a kol. Makrofágy odvozené od THP-1-učiní plicní epiteliální buňky hypo-responzivními na Legionella pneumophila – studie systémové biologie. Sci Rep. 2017;7(1):11988.
19. Livák KJ, Schmittgen TD. Analýza dat relativní genové exprese pomocí kvantitativní PCR v reálném čase a metody 2(-Delta Delta C(T)). Metody. 2001;25(4):402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.
20. Haller O, a kol. Mx GTPases: antivirové stroje s vrozenou imunitou podobné dynaminu. Trends Microbiol. 2015;23(3):154–63. 21. Anastasia M, et al. C-konec proteinu NS1 viru chřipky A/WSN/1933(H1N1) moduluje antivirové reakce u infikovaných lidských makrofágů a myší. J Gen Virol. 2015;96(8):2086–91.
22. Jager J, et al. Fúze vezikul vnější membrány Legionella pneumophila s eukaryotickými membránovými systémy je mechanismem, který dodává patogenní faktory do membrán hostitelských buněk. Cell Microbiol. 2015;17(5):607–20.
23. Lammers AJ, et al. Úloha TLR2 v reakci hostitele na pneumokokovou pneumonii v nepřítomnosti sleziny. BMC Infect Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.
24. Mamat U a kol. Produkce bílkovin bez endotoxinů – technologie ClearColi™. Metody Nat. 2013;10:916.
25. Théry C, a kol. Minimální informace pro studie extracelulárních vezikul 2018 (MISEV2018): stanovisko Mezinárodní společnosti pro extracelulární vezikuly a aktualizace pokynů MISEV2014. J Extracell vesicles. 2018;7(1):1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. Produkce vezikul vnější membrány usnadňuje remodelaci lps a údržbu vnější membrány u salmonel během přechodů prostředí. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.
27. Jasim R, et al. Lipidomická analýza vezikul vnější membrány z párových klinických izolátů klebsiella pneumoniae citlivých a rezistentních na polymyxin. Int J Mol Sci. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.
28. Olaya-Abril A, et al. Charakterizace vezikul pocházejících z ochranné extracelulární membrány produkovaných Streptococcus pneumoniae. J Proteomika. 2014;106:46–60.
29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Probiomimetika-nové mikročástice napodobující laktobacily vykazují protizánětlivé a bariérové ochranné účinky na gastrointestinálních modelech. Malý. 2020;16(40): e2003158.
30. Mehanny M, a kol. Vezikuly streptokokové extracelulární membrány jsou rychle internalizovány imunitními buňkami a mění jejich uvolňování cytokinů. Front Immunol. 2020;11:80.
31. Volgers C, a kol. Imunomodulační úloha pro membránové vezikuly uvolňované THP-1 makrofágy a respiračními patogeny během makrofágové infekce. BMC Microbiol. 2017;17(1):216.
32. Ellis TN, Leiman SA, Kuehn MJ. Přirozeně produkované vezikuly vnější membrány z Pseudomonas aeruginosa vyvolávají silnou vrozenou imunitní odpověď prostřednictvím kombinovaného snímání jak lipopolysacharidových, tak proteinových složek. Infect Immun. 2010;78(9):3822–31.
33. Alaniz RC, a kol. Membránové vezikuly jsou imunogenní faksimile Salmonella typhimurium, které silně aktivují dendritické buňky, aktivují reakce B a T buněk a stimulují ochrannou imunitu in vivo. J Immunol. 2007;179(11):7692–701.
34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. Liposomální lipopolysacharid iniciuje TRIF-dependentní signální dráhu nezávislou na CD14. PLoS ONE. 2013;8(4): e60078.
35. Fransen F, a kol. Diferenciální účinek TLR2 a TLR4 na imunitní odpověď po imunizaci vakcínou proti Neisseria meningitidis nebo Bordetella pertussis. PLoS ONE. 2010; 5(12): e15692.
36. Travanty E, a kol. Diferenciální citlivost primárních buněk lidských plic k virům chřipky H1N1. J Virol. 2015;89(23):11935–44.
37. Mubarak RA a kol. Srovnání prozánětlivých a protizánětlivých reakcí u párových lidských primárních epiteliálních buněk dýchacích cest a alveolárních makrofágů. Respir Res. 2018;19(1):126.
38. Wu W, a kol. Vrozená imunitní odpověď na infekci virem chřipky H3N2 a H1N1 v modelu kultury lidských plicních orgánů. Virologie. 2010;396(2):178–88.
39. Wu W, a kol. Virus chřipky A(H1N1)pdm09 potlačuje vrozené antivirové reakce v lidských plicích iniciované RIG-I. PLoS ONE. 2012;7(11): e49856.
40. Delgado-Ortega M, et al. Vrozená imunitní odpověď na virus prasečí chřipky subtypu H3N2 v buňkách průdušnice novorozenců prasat, alveolárních makrofázích a přesně řezaných řezech plic. Vet Res. 2014;45:42.
41. Kolbe U, a kol. Časná indukce cytokinů po infekci pseudomonas aeruginosa v myších přesně řezaných plicních řezech závisí na snímání bakteriální životaschopnosti. Front Immunol. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020,598636.
42. Jung AL, a kol. Klinická úloha hostitele a extracelulárních vezikul pocházejících z bakterií u pneumonie. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.
43. Delaney S, a kol. Snášenlivost u člověka po inhalačním dávkování selektivního agonisty TLR7, AZD8848. BMJ Open Respir Res. 2016;3(1): e000113.
