czJazyk
Domů / Znalost / Obsah

Znalost

Autofluorescence jako neinvazivní biomarker koncových produktů stárnutí a pokročilé glykace v Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

DISKUSE

Dříve se autofluorescence používala k monitorování lipofuscinu, pigmentu stáří, jako biomarkeru stárnutí4,13. I když jsme pozorovali červenouFluorescence svědčící pro lipofuscin, jak bylo vidět v předchozích studiích9, modráFluorescence byla detekována v dřívější fázi života, když byli červi vyšetřováni pomocí M165 FCFluorescenční stereomikroskop (Leica Microsystems, Tokio, Japonsko) (data neuvedena). Účelem této studie bylo prozkoumat, zda by modrá autofluorescence mohla sloužit jako citlivější marker pro sledování stárnutí jednotlivých červů.

anti- senescence cistanche function

Cistanche ForProti senescenci

Buy Cistanche

Výrobek proti stárnutí Cistanche připravený k odeslání


TheFluorescence měřená u jednotlivých červů se zvyšovala s věkem; tím méně červůFlvyšší, tím delší je jejich délka života. Tedy modráFluorescence může poskytnout alternativní biomarker pro sledování stárnutí. Nicméně Pincus a kol. oznámili, že červi, kteří následně zemřeli (do 24 hodin)Fluoresed v důsledku biosyntézy kynureninu; tito výzkumníci pojmenovali toto modré světlo"smrtFluorescence". Údajně smrtFluorescence reFlpůsobí emise glykosylovanou formou kyseliny anthranilové produkované kynureninovou cestou; autoFluorescující materiál je detekován ve střevních granulích podobných lysozomům31. Toto modré světlo by mohlo být stejným ukazatelem smrti jako Coburn et al. pozorován vC. elegansněkolik hodin před a po smrti, a to bylo údajně pozorováno jak u mladých červů vystavených smrtelnému zranění, tak u červů přirozeně umírajících stářím. Ve skutečnosti jsme zaznamenali, žedruh-1mutant, který postrádá kynureninázovou aktivitu, byl autofluorescenční méně než divoký typ. Naše výsledky však ukázaly, že část modréFluorescence je spojena spíše se stárnutím než se smrtí. Pozoruhodně, jak je znázorněno na Obr.3b, stárnoucí červi vykazovali zvýšenou modrouFluorescence i při vyloučení údajů získaných během 2 dnů před úmrtím. Kromě toho ještě červiFlse stárnutím umocnilo více, bez ohledu na stavkynu-1gen. SníženáFluorescence vkynu-1mutant by tedy měl být způsoben ztrátouzrychlení syntézy AGE kynureniny spíše než nedostatek smrtiFluorescence32.


Některé sloučeniny AGE jsouFluorescenční27. Usoudili jsme, že modráFluorescence může zahrnovat emise z těchto AGE, oddělené od těch, které lze připsat smrtiFluorescence. Když byly extrahované proteiny z červů inkubovány s cukry in vitro,Flintenzita uorescence a hladiny AGE se v průběhu času zvyšovaly. Červi kultivovaní na médiu obsahujícím ribózuFlvíce než kontrolní zvířata jsou pěstována v nepřítomnosti doplňkové ribózy, i kdyžkynu-1byl zmutován. Naproti tomu červi kultivovaní v přítomnosti rifampicinu, známého inhibitoru produkce AGEs, vykazovali snížené hladiny modréFluorescence. Fluorescenční mikroskopie skutečně ukázala, že 13-denní červi vyzařovali více modrého světla než 3-denní mladí dospělí. Imunobarvení pomocí anti-CML nebo anti-pentosidinových protilátek neprokázalo přítomnost difúzně se šířících AGE v distribučním vzoru podobném modréFluorescence. TheFluorescence by mohla pocházet z jiných hojnýchFluorescenční AGE, jako je vespertin A, LM-1 a argpyrimidin33,34.


Chcete-li poskytnout žloutek pro oocysty,C. eleganshermafroditi konzumují vlastní střevní biomasu, což má za následek střevní atrofii a ektopické usazování žloutku v pozdějším věku. Vitellogeniny (žloutkové proteiny) byly přítomny ve dvojnásobně vyšších hladinách u starých červů (ve srovnání s mladšími zvířaty), jak bylo uvedeno dříve35a vykázal šestkrát většíFluorescence po glykaci in vitro. Tyto údaje naznačují, že samotné vitelogeniny by generovaly 12-násobně víceFluorescence u starších červů ve srovnání s teoreticky mladými dospělými. Western blotting ukázal, že hlavní pruhy reagující s anti-CML protilátkou byly žloutkové proteiny. Toto zjištění se shoduje s předchozími zprávami Nakamury et al., kteří detekovali silnou glykaci vitelogeninu36a Golegaonkar et al., kteří detekovali sníženou glykaci u vitellogeninu-2, vitellogeninu-6 a elongačního faktoru 1 alfa u háďátek léčených rifampicinem30. Vitellogeniny údajně působí jako antioxidanty a přispívají k dlouhověkosti včelích královen37. vC. elegans, vitellogeniny hrají zásadní roli v odolnosti vůči stresu 38. Protože antioxidanty mohou být samy snadno oxidovány, akumulace glykovaného vitelogeninu může narušit ochranu před oxidačním poškozením, což má za následek inverzní vztah mezi očekávanou délkou života a intenzitou modréFluorescence pozorovaná v této studii. Nicméně Sorda a spol. nedávno oznámili, že délka života nesouvisí s odolností proti oxidativnímu stresu zprostředkovanou YP115/YP88 (vitellogenin-6)39. Tito výzkumníci navrhli, že akumulace vitellogeninu YP170, odvozeného z vitellogeninů 1–5, způsobuje střevní atrofii a zkracuje životnost, zatímco akumulace YP115/YP88 může zpomalit střevní atrofii a prodloužit životnost. Glykace vitellogeninu-6 a výsledná dysfunkce proto může přispívat ke stárnutí. I když faktory prodlouženíFluorescovaly třikrát intenzivněji po glykaci in vitro, množství těchto proteinů bylo podobné mezi mladými a starými červy. Proto může být příspěvek tohoto faktoru ke zvýšené autofluorescenci menší než příspěvek vitelogeninů.

anti- senescence cistanche function


Cistanchebyl obecně používán jako modelstudiesenescence a anti-senescence intervence. Navrhli jsme použití červa jako modelu pro zkoumání účinků na dlouhověkostbakterií mléčného kvašení8. Vzhledem k demonstraci (v této studii) ta modráfluorescence u hlístic je možným indikátorem akumulace AGE, navrhujeme toCistanche hermafroditi mohou sloužit jako model pro zkoumání užitečnosti intervencí proti stárnutí, které působí prostřednictvím potlačení produkce AGEs. Na rozdíl od toho je nepravděpodobné, že by autofluorescence byla biomarkerem stárnutí u samců červů, protože vitelogeniny musí být vzácné.

anti- senescence cistanche function

Obr. 5 Modrá fluorescence mutantů kynu-1, které by neměly vydávat fluorescenci smrti. AIntenzita fluorescence (ex 340/em 430) 7-denní a 13-denníkynu-1mutanti (n = 37 každý); starší červi stále vydávali víceFluorescence než u mladších červů, navzdorykynu-1mutace. Nicméně, žádné znameníFifiRozdíl mezi převýšením byl detekován v hodnotách autofluorescence Mann–WhitneyU test.b 7-den starý červ s ribózou vyzařoval více modréFluorescence navzdorydruh-1mutace. ModrýFluorescenceC. eleganspěstované s ribózou (n = 24) nebo sorbitol (n = 18) byl porovnán s kontrolními červy bez cukrů (n = 20). Hodnoty autofluorescence byly porovnány pomocí neparametrické oceli–Dwassova metoda (**p < 0.01). c Křivky přežitíC. eleganspěstované s ribózou (n = 62) nebo sorbitol (n = 84) byly porovnány s kontrolními červy bez cukrů (n = 64). Červi byli v den 0 3 dny staří. Přežití hlístic vypočítal Kaplan–Meierova metoda a rozdíly v přežití byly testovány na významnost pomocí log-rank testu (**p < 0.01).


METODY

HlísticeCistanche Bristol kmen N2 a jeho odvozené mutantní kmeny laskavě poskytlo Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota. Mutace použité v této studii byly CB1370daf{0}} (e1370)a CB1003kynu-1 (e1003). Hlístice byly udržovány a množeny na NGM podle standardní techniky 40. Vajíčka červů byla získána z dospělých červů po vystavení roztoku chlornanu sodného/hydroxidu sodného, ​​jak bylo popsáno dříve 41. Suspenze vajíček byla inkubována přes noc při 25 stupních, aby se umožnilo vylíhnutí, a suspenze červů ve stádiu L1- bylo odstředěno při 156 ×g po dobu 1 min. Supernatant byl odstraněn a zbývající larvy byly přeneseny na čerstvé bezpeptonové modifikované NGM (mNGM) plotny pokrytéE-colikmen OP50 (OP50). Kmeny byly pěstovány na mNGM agarových plotnách při 25 stupních s výjimkoudaf-2kmen, který byl pěstován při 20 stupních až do fáze L4. Všechny testy byly zahájeny s mladými dospělými červy, kteří začali snášet vajíčka při 25 stupních. Pro háďátka nebylo vyžadováno žádné etické schválení.Bakteriální kmenyOP50 byl používán jako mezinárodně zavedená potrava háďátek. Pro kultivaci OP50 byl použit tryptonový sojový agar (Nissui Pharmaceutical, Tokio, Japonsko). Bakterie (100 mg vlhké hmotnosti) byly suspendovány v 0,5 ml pufru M9; alikvot 50-µL bakteriální suspenze byl poté nanesen na mNGM na destičky o průměru 5 5- cm, pokud není uvedeno jinak.


anti- senescence cistanche function

Vícerozměrná analýza autofluorescence

Populace 100 dospělých, každá byla obnovena ve věku 3 a 17 dnů,třikrát promyty, koncentrovány ve 3 ul M9 pufru a skladovány zmrazenéna–80 stupňů do použití. Před extrakcí se 3 µl lyzačního pufru (skládající se z50 mM Tris-HCl pufr (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 % dodecylsulfát sodný(SDS), 1 procento Triton X-100, 1 mM fenylmethylsulfonylflfluorid (PMSF) a
Do každé zkumavky byly distribuovány 2 procenta 2-merkaptoethanolu) a 4 ul 15procentního SDS. Vzorky pak byly podrobenyFIcykly zmrazování a rozmrazování pro uvolnění bílkovin. Fotoluminiscenční spektra byla shromážděna pomocí afluorescencespektrofotometr (Hitachi FL{{0}}) se softwarem pro interpretaci dat (FL Solutions ver. 2.0). Fluorescenční vlastnosti suspenzí háďátek byly

analyzováno pomocí excitační-emisní matice (EEM)Fluorescenční spektroskopie. Vícerozměrná analýza (buzení jednou vlnovou délkou s vícenásobnýmemise vlnové délky a synchronní skenováníFluorometrie) poskytly EEM grafy sestávající z excitace s jedním skenem a synchronnífluorescencebyla nakreslena spektra každé série.



Fluorescenční spektra stárnoucích červů

Červi (3–13 dní staré) byly získány z růstového média obsahujícího 2'-deoxy-5-Fluorouridin (Tokyo Chemical Industry, Tokio, Japan). Tentosloučenina blokuje embryonální vývoj potomstva, čímž zabraňuje kontaminaci potomstvem. Byli shromážděni jednotliví stárnoucí červitrubky, vypranéPětkrát, koncentrovány ve 3 ul M9 pufru a skladovány zmrazené při–80 stupňů do použití. Před extrakcí 100 µl lyzačního pufru(skládající se z 50 mM Tris-HCl pufru (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM dithiothreitolu (DTT), 1 mM PMSF a 1 ul koktejlu inhibitoru proteázy (Sigma, St. Louis, MO, USA)) každá trubka. Vzorky byly poté rozemlety pomocí mini akumulátorové brusky (Funakoshi, Tokio, Japonsko), aby se uvolnily
protein. Obsah proteinu byl kvantitativně měřen pomocí Pierce™ 660 nm Protein Assay Reagent (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, USA) a přístroj NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific). Thefluorescencespektrum bylo stanoveno pro každý 30-µL vzorek (obsahující 1,5μg celkového proteinu) za použití multimódové mřížky

model čtečky mikrodestiček SH-9000Lab se softwarem pro zpracování dat SF6(Corona Electric, Ibaraki, Japonsko). Každé měření bylo provedeno třikrát.


image

Měření autofluorescence jednotlivých živých červů (metoda wrap-drop)

Náhodně vybraní červi se promyli pufrem M9 a potéjednotliví červi byli umístěni do 1.0 µL pufru M9 na přilnavosti Saran Wrapfilm (Asahi Kasei, Tokio, Japonsko) natažený přes 384-černou desku studny(STEM, Tokio, Japonsko). Na každé jamce byly vytvořeny malé prohlubně pomocí areplikátor (Watson, Kobe, Japonsko). Tato modifikace měla po měření bezpečně obnovit červy, aby bylo možné vysledovat věkově závislou změnu autofluorescence každého červa. PřilnavostFIlm byl vybrán, protože autofluoreskuje méně než jiné komerčně dostupnéFIlms.

Prázdná data (pouze vyrovnávací paměť M9) však byla kontrolována třikrátkaždá studna s ohledem nakolísáníze studny do studny. Minimální detekční limity a kvantifikovatelné limity byly stanoveny na základě slepých dat pro každý den asμ (průměr prázdného místa)Plus3.29σ (směrodatná odchylka) aμPlus√2 × 10σ, resp. Autofluorescence v těle každého červa

byla zachycena multimódovou čtečkou mikrodestiček s mřížkou. Poměření byl každý červ jednotlivě udržován na 4.0-cmprůměr destičky pokrytá OP50 (2 mg/10μL M9 buffer) při 25 stupních . Každýtest byl proveden na minimálně 20 červech a dvakrát opakován.


Měření délky života

Červi byli udržováni na mNGM destičkách pokrytých OP50 při 25 stupních až do stáří 13 dnů. Po vyhodnocení podlefluorescencetestu, každý byl 30 červůpřesunuta na samostatné nové mNGM destičky pokryté OP50. Destičky byly inkubovány při 25 stupních a každých 24 hodin byli hodnoceni živí a mrtví červi. Červ byl považován za mrtvého, když nereagoval na jemný dotek sběrače červů.

anti- senescence cistanche function


AGE po glykaci in vitro

Extrakce proteinu byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve. K umělé glykaci se použili třídenní červi. Vzorky proteinů (2 mg/ml)byly inkubovány s 500 mM glukózou, 100 mM ribózou nebo 500 mM fruktózou(FIkonečná koncentrace). Všechny vzorky byly inkubovány při 37 stupních po dobu 0–4 týdny. Alikvoty (50μL) byly rozděleny do jamek polystyrenové destičky
(Sumitomo bakelit, Tokio, Japonsko) a inkubovány po dobu 2 hodin při 37 stupních. Poodstranění roztoku vzorku, destička byla promyta PBS-T(fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS), 0,05 procent Tween 20); 250μL 3% odstředěného mlékaDo každé jamky se přidalo a destička se inkubovala 2 hodiny při 37 °C. Každýjamka pak byla promyta PBS-T a 100 ulμL anti-AGE (anti-CML)
monoklonální protilátka (klon č. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japonsko; 75 ng/ml) byl rozdělen do každé jamky; destička pak byla inkubována v místnostiteplotu po dobu 1 hodiny. Po promytí PBS-T, 100μL peroxidasou konjugovanékozí anti-myší IgG protilátka (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, USA; 1:150,000) byla rozdělena do každé jamky a
destička byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí PBS-T, 100μL pracovního roztoku (barvicí roztok tetramethylbenzidinu (TMB): roztok peroxidu).= 1:1; ELISA POD substrát TMB kit, populární,Nacalai Tesque, Kyoto, Japonsko) se nadávkoval do každé jamky a destička se udržovala při pokojové teplotě ve tmě až do zchlazení.

přidání 100μL 1 mol/l kyseliny sírové na jamku. Absorbance každého z nichjamka při 450 nm (sub: 650 nm), poté byla okamžitě měřena pomocí čtečky mikrodestiček. ELISA byla provedena třikrát pro každou z testovacích podmínek.


Western blotting pro stárnoucí červy

Vzorky byly ošetřeny 4× Bolt™ LDS Vzorek Buffer (Thermo Fisher ScientiFific) a 10× Šroub™ Činidlo redukující vzorky (Thermo Fisher ScientiFific) a každý vzorek obsahující 1.5μg celkového proteinu bylo měřeno na Bolt™ 4–12% Bis-Tris Plus Gel (Thermo Fisher ScientiFifiC). Poté byly proteiny přeneseny z gelu na polyvinylidenFluroridovou membránou (ATTO, Tokio, Japonsko) a blokován 5% odstředěným mlékem v PBS- 0.1% Tween 20 po dobu 1 hodiny. Membrána byla inkubována přes noc při 4 stupních s anti-AGE (anti-CML) monoklonální protilátkou (klon č. 6D12 v 1:1000), promyta PBS-T a poté inkubována při pokojové teplotě po dobu 1 h s peroxidázou konjugovanou kozí anti-myší IgG protilátkou (1:25,000). Po promytí PBS-T byla membrána inkubována s detekčním činidlem ECL prime Western blotting (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Anglie) a skenována pomocí systému ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) nebo ImageQuant. LAS 500 (GE Healthcare UK). Membrány pak byly promyty PBS-T, inkubovány s Western BLoT stripping Buffer (Takara, Shiga, Japonsko) po dobu 30 minut při teplotě místnosti a znovu promyty PBS-T. Membrána byla znovu sondována anti-vitellogeninovými protilátkami YP115 a YP170 (každá 1:10 000) při 4 stupních přes noc42, promyty PBS-T a inkubovány s kozí anti-krysí IgG protilátkou konjugovanou s peroxidázou (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, USA) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Pro kontroly nanášení byly membrány znovu sondovány pomocí anti-aktinové protilátky (klon č. C4; Merck KGaA, Darmstadt, Německo) a anti-myší protilátky konjugované s peroxidázou (GE Healthcare UK). Hustoty pásů vitellogeninu (YP170 a YP115) a CML v každé dráze byly normalizovány proti hustotám aktinových pásů v příslušné dráze. Hustoty pásů byly analyzovány pomocí softwaru ImageQuant TL (GE Healthcare). Každý test byl proveden dvakrát.


Účinky ribózy a rifampicinu na AGEs in vivo

Třídenní červi byli kultivováni na mNGM obsahujícím 400 mM ribózynebo 400 mM sorbitolu, aby odpovídala osmolaritě vysoké ribózy; potrava pro červy byla poskytnuta jako tepelně (100 stupňů, 10 minut) usmrcená OP50, aby se zabránilo bakteriím fermentovat cukr. Aby se zabránilo kontaminaci potomstvem, přenášeli se červi na čerstvé misky denně po dobu 4 dnů, dokud se úplně neztratili.

hotovosnášení vajec (ve stáří 7 dnů). Pro posouzení vlivu ribózy jsme provedli testy přežití a měřili autofluorescenci. Byl to červpovažováno za mrtvé, když nereagovalo na jemný dotek sběrače červů. Červi, kteří uhynuli v důsledku přilnutí ke stěně destičky, nebyli do analýzy zahrnuti a byli cenzurováni. V samostatném experimentuMGM obsahující 50 uM (finálekoncentrace) rifampicin (rozpuštěný vDMSO). Každý test byl opakován dvakrát.


anti- senescence cistanche function

Obr. 6 Autofluorescence vitellogeninu (Vit) a elongačního faktoru (EF). ASpektrofotometrie (ex 325/em 350–600) vitellogeninu aelongační faktor před a po glykaci in vitro ribózou po dobu 14 dnů: gly-Vit a gly-EF jsou glykovaný vitellogenin a glykátová elongacefaktor, resp. RiboFLFLavin (žebro) je znázorněn jako zástupceLFLuorescenční sloučenina. Pro srovnání je uveden extrakt z 17-denních červů (divokého typu N2) (C. elegans). b In vitro glykace vitellogeninu a elongačního faktoru ribózou přinesla zvýšení autofluorescence
přesčas.c Western blot analýza AGE a vitellogeninů ve vzorcích extrahovaných z populací červů (divokého typu N2) různého stáří. Bloty byly odvozeny ze stejného gelu a byly zpracovány s každou protilátkou v daném pořadí.d Kvantifikacevitellogeninů a AGE ze zápblotování pomocí denzitometrie. Experimenty byly opakovány dvakrát a jsou ukázána data z reprezentativního experimentu. Čára i tečkovaná čára v červené barvě ukazují násobné změny AGE, zatímco ty v černé barvě označují množství vitellogeninů. Plné kroužky a křížky jsou pro data pásem odpovídajících YP170 a YP115, resp.


Identifikace starých proteinů specifických pro červy

Hmotnostní spektrometrická analýza extraktů z 3- a 17-denních háďátekbyla provedena na hmotnostním spektrometru AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF (Newark, NJ, USA) s Protein Pilot verze 4.0. Obě matrice bylyštěpené trypsinem a smíchané s matricovým roztokem (7 mg/l - kyselina kyano-4-hydroxyskořicová v kyselině trifluoroctové (TFA) 0,1 procenta (v/v), 70 procent
(obj./obj.) acetonitril (ACN)). Thechlapíkrychlost použitá pro separaci byla 300 ml/min,a separace bylo dosaženo použitím lineárního gradientu dvou mobilních fází ({{0}},1 procenta (obj./obj.) TFA ve 2 procentech ACN (rozpouštědlo A) a 0,1 procenta (obj./obj.) TFA v 80 procent ACN(rozpouštědlo B)) v následujících poměrech: A/B= 100/0–50/50 (60 min), A/B= 50/50–0/100 (20 min), A/B= 0/100 (10 min). K získání peptidové hmoty byl použit hmotnostní systém MALDI-TOFotisk prstu. Párování peptidů avyhledávání proteinů bylo provedeno v databázi Swiss-Prot verze 57.0.


Extrahované proteiny byly rozpuštěny v 50 mM hydrogenuhličitanu amonném(AmBic) k získání koncentrací proteinu mezi 0,1 a 1 µg/µL. Aby se maximalizovala rozpustnost proteinů, vypočítaný objem vodyK výtěžku byl přidán Rapigest (Waters Corporation, Milford, MA, USA).FIkonečné koncentrace 0.1–0,2 procenta Rapigestu ve vzorcích před trávením. Vzorky
byly zahřívány na 40 stupňů za třepání po dobu 10 minut; obsah pak bylcentrifugována a výsledná peleta byla suspendována v AmBic obsahujícím 10 mM DTT. Vzorky byly zahřívány na 80 stupňů po dobu 15 minut a peletovány při teplotě místnosti. Alikvotní podíl 200 mM jodacetamidu (IAM) v 50 mMKe každému vzorku byl přidán AmBicfináleIAM koncentrace

20 mM (v přítomnosti 2x molárního přebytku DTT); směs pak bylainkubovány ve tmě při teplotě místnosti po dobu 30 minut, aby se umožnilo pokračování alkylační reakce. Trypsin v 50 mM AmBic byl smíchán s každým roztokem v poměru 1:50 (trypsin: koncentrace proteinu). Vzorky byly štěpeny po dobu alespoň 4 hodin nebo přes noc při 37 stupních za třepání. Následujícícentrifugací, byly přidány TFA a ACN, aby se získalofinálekoncentrace 0.5–1.0 procenta TFA a 2 procenta ACN podle objemu. Vzorky byly třepány po dobu 2 hodin při 60 stupních. Po odstředění při 22 200 ×g po dobu 5 minut byl supernatantpipetován do lahvičky autosampleru. Proteiny byly předem štěpeny trypsinemk analýze kapalinovou chromatografií s reverzní fází za použití systému Ultimate3000RSnanoLC (Thermo Fisher Scientific) spojeného se systémem ESI-Q-TOF (Impact II Bruker Daltonics). Kvasinková alkoholdehydrogenáza(ADH1_YEAST) protein byl přidán do vzorků jako vnitřní standard;přídavek byl proveden pro poskytnutí množství přibližně 50 fmolstandardně na sloupu.


Autoflfluorescence po in vitro glykaci

Vitellogenin v roztoku PBS ({{0}},053 uM) byl zakoupen od Biosense Laboratories AS (Bergen, NORSKO). Roztok elongačního faktoru (1,17 uM) byl zakoupen od Abnova Corporation (Taipei City, Taiwan). Tyto roztoky byly glykovány 0,1 mM ribózou po dobu 23 dnů při 37 stupních. RiboFLFLavin byl zakoupen od Sigma (Tokio, Japonsko) a rozpuštěn v PBS při 0,1 mM. Každý roztok byl měřen fluorescenční spektrofotometrií za stejných podmínek.

Imunofluorescencemladými a starými červyVěkem synchronizované CB1003 krmené OP50 byly inkubovány při 25 stupních. Třídenní a 13-denní dospělí byli permeabilizováni pomocí Bouin's protokol fixace hadičky43.


anti- senescence cistanche function

Obr. 7 Fluorescenční snímky 3-denních a 13-denních kynu-1 mutantů. a–cTřídenní červi ad–f 13-denní červi s nezpracovanými obrázky ve sloupci 1. Chcete-li vyloučit možné účinky smrtiFluorescence, která začíná 2 dny před červy' zánik, mutantkynu-1byl použit. Autofluorescence je vidět na obrázcích ve sloupcích 2 a 3. Fotografie ve sloupci 3 byly zvětšeny z vyznačených (obdélníčků) oblastí obrázků ve sloupci 2. Starší červi (13-denní) autofluorescenčnísigniFifinepatrně vyšší než mladí červi (3-denní). Každá stupnice ukazuje 50μm. g Kvantifikacez modréfluorescencepomocí softwaru ImageJ a ImageQuant TL. Každý sloupec představuje průměrné hodnotyFlintenzita uorescence na 1 mm2 devíti červů. ** označuje statisticky signiFifinení rozdíl mezi 3-denními a 13-denními červy při ap hodnota < 0.01. Chybové úsečky představují SE.

Vzorky bylypevnýv Bouinu's fixační prostředeks metanolem/ -merkaptoethanolpři pokojové teplotě po dobu 30 min. K popraskání kutikuly se do ní umístili červiisopropanol a skladovány při–80 stupňů po dobu 10 minut, poté inkubujte při pokojové teplotě dalších 30 minut. Thefixační prostředekroztok byl odstraněn anahrazen roztokem BTB (25 mM borátový pufr, 0,5 procenta Triton X-100, 2 procenta
-merkaptoethanol) při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny; inkubace v BTB bylaopakovat celkem třikrát. Červi pak byli přeneseni z BTB do BT (25 mM borátový pufr, 0,5 procenta Triton X-100), inkubováni v roztoku pufru protilátky (1× PBS, 0,5 procenta Triton X-100, 0,1 mM EDTA, {{10}},1 procenta bovinního sérového albuminu (BSA), 0,05 procenta azidu sodného, ​​pH 7,2) při pokojové teplotě po dobu

1 h a blokovány roztokem pufru protilátky obsahujícím 10 procent kozího séra(Cosmo Bio, Tokio, Japonsko) při 4 stupních přes noc. Primární protilátky se skládaly z myší monoklonální anti-AGE (anti-CML) protilátky (klon č. 6D12; 1:125) a anti-pentosidinové protilátky (klon č. PEN-12, Trans Genic; 1:5 0). Sekundární protilátka sestávala z Alexa Fluor 555- konjugované kozí anti-myší protilátky (Abcam, Cambridge, Anglie; 1:100). Všechna ředění protilátek byla provedena za použití protilátkového pufru obsahujícího 0,5 procenta BSA. Vzorky byly upevněny na podložní sklíčka pomocí VECTASHIELD upevňovacího média proti vyblednutí (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).



Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční snímky 3- nebo 13-denních dospělých červů, upevněné na podložní sklíčka, jak je popsáno výše, byly zaznamenány pomocí obrácenéhofluorescencemikroskop (BZ-X700; Keyence) s čočkou 10× objektivu (CFI Plan Fluor DL10×/0,30). AutoFLFLzčervenání červůfluorescenceod AlexyFluor 555 byly sledovány pomocí BZ-X DAPI (excitační vlnová délka (Ex), 360 ± 20 nm; emisní vlnová délka (Em), 460 ± 25 nm) a TRITC (Ex, 545 ±12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)filtry, resp. Obrazy sekcí bylyzachycený režimem Sekce s jednorozměrným typem štěrbiny s ašířka 32 a rozteč zásobníku Z 0.7μm pro 40-μvzorky o tloušťce m. Abychom kvantifikovali modroufluorescence,fluorescenceintenzity měřené pomocí Image
Software Quant TL (GE Healthcare) byl normalizován na hodnoty hustoty na 1 mm2 červa'projekční plocha. Velikost těla byla určena pomocí softwaru Adobe Photoshop Elements a ImageJ vyvinutého National Institutes of Health. V tomto systému je to oblast červa's projekcebyl odhadnut automaticky a použit jako index tělesné velikosti.



Statistická analýza

Korelace očekávané délky života byla vypočtena pomocí Spearmana's koeficient pořadové korelace. Hladiny autofluorescence po in vitro glykaci byly porovnány pomocí dvoufaktorové faktorové ANOVA a Scheffe's F test. TheHodnoty ELISA po in vitro glykaci byly porovnány pomocí jednofaktorové ANOVA a Dunnettova testu pro vícenásobná srovnání. Přežití háďátekvypočítal Kaplan–Meierova metoda a rozdíly v přežití byly testovány na významnost pomocí log-rank testu. Hodnoty autofluorescence po léčbě rifampicinem a stárnutídaf-2akynu-1mutanty byly porovnány pro každý pomocí Student's t test, opakovaná měření dvoufaktorová ANOVA a Mann–WhitneyU test. Hodnoty autofluorescence po ošetření ribózou pro N2 nebokynu-1mutanty byly porovnány pomocí neparametrické oceli–Dwassova metoda. Hustoty z autofluorescenční mikroskopie byly porovnány pomocí Student's t-test. Tam, kde byla pozorována významnost, byla data klasifikovánaFified jako *p < 0.05 and **p < 0.01. All statistické analýzy byly provedeny pomocí Microsoft Excel doplněného odoplňkový softwarePlusStatcel 3 (OMS, Tokio, Japonsko) a JSTAT pro Windows(Nankodo, Tokio, Japonsko).


Shrnutí hlášení

Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici v Nature ResearchSouhrn přehledů propojený s tímto článkem.


DOSTUPNOST DAT

Soubory dat vytvořené během aktuální studie jsou k dispozici u korespondenceing autora na rozumnou žádost.



REFERENCE

1. Brenner, S. GenetikaCaenorhabditis elegans. Genetika 77, 71–94 (1974).
2. Riddle, DL, Blumenthal, T., Meyer, BJ, Priess, JR (eds.).C. elegans II. (StudenýJaro Přístav Laboratoř Press, Studené Pružinové Přístav, 1997).
3. Herndon, LA a kol. Stochastické a genetické faktory ovlivňují tkáňově specifický pokles stárnutíC. elegans. Příroda 419, 808–814 (2002).
4. Klass, MR Stárnutí u háďátekCaenorhabditis elegans: hlavní biologické a environmentální faktory ovlivňující délku života.Mech. Aging Dev. 6, 413–429 (1977).
5. Son, HG, Altintas, O., Kim, EJE, Kwon, S. & Lee, SV Věkově závislé změny a biomarkery stárnutí vCaenorhabditis elegans. Stárnoucí buňka 18, e12853 (2019).
6. Yoshino, J., Mills, KF, Yoon, MJ & Imai, S. Mononukleotid nikotinamidu, klíčový NAD(Plus) střední, léčí patofyziologii dietou a věkem indukovaného diabetu u myší.Cell Metab. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel, MS, Lapierre, LR & Mack, HID Vznikající témata vC. elegansvýzkum stárnutí: regulace transkripce, reakce na stres a epigenetika.Mech. Age ing Dev. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda, T., Yasui, C., Hoshino, K., Arikawa, K. & Nishikawa, Y. InFLFLvliv bakterií mléčného kvašení na dlouhověkostCaenorhabditis elegansa hostitelská obrana proti salmonelestřevnísérovar Enteritidis.Appl. Environ. Microbiol. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura, T., Ikeda, T., Yasui, C., Saeki, S. & Nishikawa, Y. Mechanism under pro-longevity induced by bifidobacteria inCaenorhabditis elegans. Biogerontologie 14, 73–87 (2013).
10. Clark, LC & Hodgkin, J. Komenzálové, probiotika a patogeny vCae Caenorhabditis elegansModelka.Cell Microbiol. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro, F. & Gems, D. Červi také potřebují mikroby: mikrobiota, zdraví a stárnutí vCaenorhabditis elegans. EMBO Mol. Med. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim, Y. & Mylonakis, E.Caenorhabditis elegansImunitní úprava pomocí probiotických bakteriíLactobacillus acidophiluskmen NCFM zvyšuje grampozitivní imunitní reakce.Infikovat. Immun. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N. & Driscoll, M. In vivo spektrofluorimetrieodhaluje endogenní biomarkery, které uvádějí zdravotní rozsah a dietní omezeníCaenorhabditis elegans. Stárnoucí buňka 4, 127–137 (2005).
14. Coburn, C. a kol. antranilátfluorescenceoznačuje vápníkem šířenou nekrotickou vlnu, která podporuje smrt organismuC. elegans. PLoS Biol. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus, Z., Mazer, TC & Slack, FJ AutoFLFLuorescence jako míra stárnutí vC. elegans: pohled na červenou, ne modrou nebo zelenou.Stárnutí (Albany NY) 8, 889–898 (2016).
16. Šebeková, K. & Šebeková, KB Glykované proteiny ve výživě: přítel nebo nepřítel?Exp. Gerontol. 117, 76–90 (2019).
17. Giacco, F. & Brownlee, M. Oxidační stres a diabetické komplikace.Circulation Res. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth, V. a kol. Konečné produkty pokročilé glykace a jejich receptor RAGE u Alzheimerovy choroby's nemocí.Neurobiol. Stárnutí 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo, Q., Yang, W., Chen, JY & Wang, Y. Metabolický syndrom se setkává s osteoarritidou.Nat. Rev. Rheumatol. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou, P. & Bohm, M. Konečné produkty pokročilé glykace: klíčoví hráči ve stárnutí pleti?Dermatoendokrinol 4, 259–270 (2012).
21. Liu, J. a kol. Receptor pro pokročilou glykaci koncových produktů podporuje předčasnésenescence proximálních tubulárních epiteliálních buněk prostřednictvím aktivace endoplazmatickéhosignalizace p21 závislá na stresu retikula.Mobilní signál 26, 110–121 (2014).

22. Mendler, M., Schlotterer, A., Morcos, M. & Nawroth, PP Pochopení diabetické polyneuropatie a dlouhověkosti: co se můžeme naučit od háďátkaCae norhabditis elegans? Exp. Clin. Endocrinol. Cukrovka 120, 182–183 (2012).


Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950


























Mohlo by se Vám také líbit