Cesty závislé a nezávislé na arylových uhlovodíkových receptorech zprostředkovávají účinky kurkuminu proti stárnutí
Jun 28, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
Abstraktní:Aryl uhlovodíkový receptor (AhR) je ligandem aktivovaný transkripční faktor, jehož aktivita může být modulována polyfenoly, jako je kurkumin. AhR a kurkumin mají evolučně konzervované účinky na stárnutí. Zde jsme zkoumali, zda a jak AhR zprostředkovává účinky kurkuminu proti stárnutí napříč druhy. Pomocí kombinace in vivo, in vitro a in silico analýz jsme prokázali, že kurkumin má AhR-dependentní nebo nezávislé účinky v kontextu specifickým způsobem. Zjistili jsme, že u Caenorhabditis elegans zprostředkovává AhR prodloužení životnosti vyvolané kurkuminem, s největší pravděpodobností prostřednictvím inhibičního mechanismu nezávislého na ligandu souvisejícího s jeho antioxidační aktivitou. Kurkumin také prokázal anti-aging aktivity nezávislé na AhR, jako je ochrana proti proteinům náchylným k agregaci a oxidačnímu stresu u C.elegans a podpora migrační kapacity lidských primárních endoteliálních buněk. Tyto účinky nezávislé na AhR jsou z velké části zprostředkovány cestou Nrf2/SKN-1.
klíčová slova:arylový uhlovodíkový receptor; kurkumin; oxidační stres; Caenorhabditis elegans; myši; endoteliální buňky; in vivo; in vitro; in silico
1. Úvod
Arylhydrokarbonový receptor (AhR) je všudypřítomný ligandem aktivovaný transkripční faktor identifikovaný jako determinant toxikologické odpovědi na 23,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) u savců [1]. Signální dráhy AhR byly dobře popsány v savčích buňkách. Stručně řečeno, neligandovaný AhR je lokalizován v cytoplazmě a stabilizován různými kofaktory, jako je 90-kDa protein tepelného šoku (Hsp90), protein interagující s AHR (AIP) a chaperon p23. Vazba na exogenní (např. TCDD) nebo endogenní (např. kynurenin) ligandy podporuje translokaci tohoto komplexu do jádra, kde se AhR disociuje od svých kofaktorů a shromažďuje se v heterodimeru s jaderným translokátorem AHR (ARNT). Výsledný komplex AHR/ARNT se váže na xenobiotické responzivní elementy (XRE) baterie responzivních detoxikačních genů fáze I a II, což případně vede k degradaci ligandů [2]. Kromě své role v xenobiotické odpovědi funguje pro AhR v různých patofyziologických procesech, od imunity [3,4], zánětu [5,6], metabolismu lipidů a glukózy [7,8] až po kardiovaskulární, jaterní a onemocnění jiných orgánů [9-12], byly objeveny v posledních desetiletích. Rostoucí důkazy také poukazují na nesourodé a zdánlivě protichůdné role AhR v procesu stárnutí, které by nicméně mohly být sladěny s ohledem na tkáňové, dávkově a druhově specifické účinky [13].cistanche džingischánNegativní role AhR ve stárnutí a s věkem asociovaných rysů byla popsána napříč druhy [14,15]. Ve srovnání s divokým typem Caenorhabditis elegans má mutantní kmen AhR, ahr-1(ju145), prodlouženou životnost a délku zdraví; u myší nedostatek AhR zlepšuje funkci cév a zvyšuje aktivitu syntázy oxidu dusnatého a tím i biologickou dostupnost NO; a konečně byla nalezena pozitivní korelace mezi expresí AhR a tuhostí cév u lidských subjektů středního a staršího věku [14]. Kromě toho v epidemiologické studii na čínské populaci souvisela exprese AhR s výskytem onemocnění koronárních tepen [16].
Cistanche může proti stárnutí
Je třeba poznamenat, že mnoho sloučenin ovlivňujících stárnutí nebo nemoci související s věkem [17-19] může modulovat aktivitu AhR [20-22]. Zatímco aktivace AhR xenobiotiky vede k různým druhům rakoviny u savců [23,24], ukázalo se, že dietní a environmentální faktory mají opačné účinky na AhR závislé na zdraví C.elegans [25]. Mezi modulátory AhR v potravě byly z velké části studovány polyfenoly, jako je kurkumin, pro jejich příznivé účinky na zdraví. Kurkumin je žlutý pigment z Curcuma longa s četnými evolučně konzervovanými prospěšnými vlastnostmi, včetně antioxidačních, protizánětlivých a anti-aging aktivit [26]. Kurkumin zabraňuje agregaci proteinů a prodlužuje životnost u C.elegans a Drosophila prostřednictvím modulace proteinové homeostázy [27-29].cistanche prodloužení životnostiNavíc, když byl podáván modelu transgenních myší s Alzheimerovou chorobou, významně snížil celkovou zátěž amyloid-beta(A ) [30]. U starých myší kurkumin obnovil biologickou dostupnost NO, a tak snížil oxidační stres a zlepšil endoteliální dysfunkci a ztuhlost tepen hodnocenou rychlostí aortální pulzní vlny (PWV) – jedno z nejdůležitějších klinických měření nebo markerů tuhosti velkých elastických tepen [31]. Několik studií na lidech také prokázalo ochranný účinek kurkuminu na kardiovaskulární zdraví [32]. Mechanismus účinku kurkuminu je však stále do značné míry nejasný, a co je důležitější, nebylo zkoumáno, zda jsou jeho příznivé zdravotní účinky zprostředkovány AhR [33,34].
Modelové organismy, jako je hlístice C.elegans, byly nápomocné při identifikaci genetických a environmentálních determinantů stárnutí. Je to dáno jeho mnoha výhodnými vlastnostmi, mezi které patří snadná laboratorní manipulace, krátká životnost a produkce velkého množství potomků samooplozením. Genom C.elegans je kompletně sekvenován a většina jeho genů a drah je evolučně konzervovaná. Proteinová sekvence AhR je během evoluce zachována a u C.elegans jsou ortology AhR a ARNT kódovány asociovanými AhR (ahr-1) a ahr-1 (aha{{4 }})geny, respektive [35]. Odpovídající proteiny, AHR-1 a AHA-1, sdílejí asi 40 procent své sekvenční identity se savčími proteiny a tvoří heterodimer (také se savčími protějšky), který se může vázat na XRE cíle. genů in vitro [36].cistanche nzAHR-1 je většinou exprimován v typech neuronových buněk, jako jsou GABAergické neurony [37l, a hraje klíčovou roli v řízení vývoje neuronů [38]. Na rozdíl od AhR obratlovců AHR-1 neváže TCDD a další příbuzná xenobiotika [35,39], přesto má se savčím AhR společné rysy v regulaci neuronálních procesů, vývoje a plodnosti [37,38,{ {8}}], což nakonec naznačuje, že rodový AhR nebyl přímo zapojen do řízení genů pro degradaci toxických ligandů [44,45]. Rozpoznali jsme tedy C.elegans jako jedinečný a výkonný modelový systém pro identifikaci a studium funkcí předků AhR, které možná nesouvisejí s jeho xenobiotickou reakcí.
V této studii jsme zkoumali roli AhR v účincích kurkuminu proti stárnutí napříč druhy. Prostřednictvím kombinace in vivo, in vitro a in silico analýz jsme zjistili, že kurkumin vykazuje různé příznivé účinky proti stárnutí prostřednictvím nespojených ahr-1-závislých a nezávislých mechanismů. Zjistili jsme, že C.elegans ahr-1-vyčerpaná zvířata jsou dlouhověká, ale citlivější na oxidační stres. Zatímco kurkumin dále neprodloužil životnost mutantů C.elegans ahr-1, podpořil jejich odolnost vůči oxidativnímu stresu. Kurkumin také podporoval antioxidační odpověď a migrační kapacitu lidských primárních endoteliálních buněk (EC) nezávisle na AhR, což je účinek, který primárně závisel na Nrf2/SKN-1 napříč druhy. SKN-1 je ortolog C.elegans lidského redoxního transkripčního faktoru Nrt2 (nukleárního faktoru erytroidního 2-faktoru 2 souvisejícího s erytroidním faktorem), který hraje evolučně konzervovanou roli při homeostáze buněk a organismů a odpovědi na oxidační stres [ 46,47]Spojení výsledků z buněčného reportérového testu a in silico modelování AHR-1 ligand-binding domain (LBD) jsme pak ukázali, že kurkumin s největší pravděpodobností potlačuje AHR-1 aktivitu v ligand- způsobem nezávislým na vazbě. Je pozoruhodné, a v souladu s údaji v C.elegans a EC, kurkumin a prooxidanty vykazovaly opačné účinky na aktivitu AHR{21}}, což znamená, že kurkumin může modulovat aktivitu AHR-1 prostřednictvím své antioxidační kapacity buď přímo nebo nepřímo prostřednictvím regulace Nrf2/SKN-1 nebo jiných redoxních regulačních proteinů.
2. Materiály a metody
2.1. C.elegan1s
2.1.1. C. elegans Kmeny a kultivace
Použili jsme následující kmeny C.elegans: N2 [divoký typ], CZ2485 [ahr-1(jul45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (původní kmen AM141 [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (jul45)], NV42wt [unc-54p::alfasynuklein::YFPI (původní kmen NL5901 [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS](původní kmen CL2166). Z důvodu údržby byli červi synchronizováni snášením vajíček při 20 stupních na médiu pro růst háďátek (NGM) a krmené E.coli OP50, podle metod popsaných v [25]. Pro experimenty byli červi synchronizováni na destičkách doplněných E. coli HT115(DE3) na destičkách doplněných 1 mM IPTG (Fisher Scientific, Geel, Belgie).
2.1.2. Umlčení genů interferencí zprostředkovanou RNA (RNAi)
Umlčení genu bylo dosaženo napájením plasmidů exprimujících E. coli HT115(DE3) dsRNA proti specifickým genům [50]. Krmení RNAi bylo aplikováno nepřetržitě od narození do smrti. Pro test rezistence na juglon s bakteriemi HT115(skn{4}}) bylo aplikováno krmení RNAi z červů L4 po dobu 24 hodin před jejich přenesením na čerstvé juglonové plotny.
2.1.3. Kmeny a růst E.coli
Bakterie byly pěstovány v LB médiu při 37 stupních přes noc. Při použití vektorů nesoucích E.coli bylo médium LB doplněno 0.01 procentem ampicilinu a 0,0005 procenta tetracyklinu. E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{8} }), HT115(skn-1) a OP50 byly získány z knihovny RNAi Ahringer C. elegans [51].
2.1.4.Životnost
Analýza délky života byla zahájena ze synchronizované populace červů, která byla denně přenášena na čerstvé NGM plotny během plodného období. Po plodné fázi byla zvířata přemístěna každý druhý den. Během procesu přenosu byla hodnocena mrtvá, živá a cenzurovaná zvířata. Zvířata byla považována za mrtvá, když nevykazovala ani pohyb, ani reakci na manuální stimul platinovým drátem, ani aktivitu hltanového pumpování. Zvířata s vnitřním líhnutím (sáčky) a explodovanou vulvou nebo zvířata, která zemřela vysušená na stěně, byla cenzurována. Počet mrtvých a cenzurovaných zvířat byl použit pro analýzu přežití v OASIS[52] nebo OASIS 2[53]. Pro výpočet průměrné délky života a křivky přežití v OASIS a OASIS 2 byl použit Kaplan-Meierův odhad a p-hodnoty byly vypočteny pomocí log-rank testu mezi sdruženými populacemi zvířat.
2.1.5. Pohyb/Rozpětí zdraví
Pohyb byl nastaven jako parametr pro zdravé stárnutí a fáze aktivního pohybu se označuje jako rozpětí zdraví. Byl hodnocen v populacích použitých pro test životnosti. Zvířata, která lezla buď spontánně, nebo po manuálním podnětu, byla považována za pohybující se, zatímco mrtvá zvířata nebo zvířata bez chování při plazení byla považována za nehybná. Statistická analýza byla provedena tak, jak je popsáno pro životnost.
2.1.6. Kurkumin Léčba C. elegans
Kurkumin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo) byl rozpuštěn v DMSO (Carl Roth, Karlsruhe, Německo) v koncentraci 100 mM a dodán do NGM po autoklávování. Konečná koncentrace kurkuminu v médiu bylo 100 μM (0,1 procenta DMSO). Kontrolní destičky obsahovaly 0,1 procenta DMSO. Červi byli ošetřováni nepřetržitě počínaje vajíčky.
2.1.7. Kvantifikace agregátů PolyQ
Agregáty PolyQ40 byly vizualizovány fluorescenční mikroskopií (100x zvětšení) u 10-denních červů anestetizovaných 15 mM azidem sodným (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo). Pro posouzení počtu agregátů byly obrázky spojeny pomocí Fiji párového sešívacího pluginu [54] za účelem vytvoření celých červů a počet agregátů byl kvantifikován na Fidži [55] pomocí pluginu „Analyze Particles“.
2.1.8. Kvantifikace x-synukleinových agregátů
-synukleinové agregáty v hlavových svalech 7-denních červů byly vizualizovány fluorescenční mikroskopií (4{8}}0× zvětšení) u červů anestetizovaných 15 mM azidem sodným (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo, S2002 ). Obrázky byly segmentovány pomocí Plastik (verze 1.3.0) (Laboratoř Anny Kreshuk v European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Německo) (dostupné na https://www.ilastik.org/, přístupné 10. dubna 2018)[56] . Segmentované obrázky byly použity k analýze počtu agregátů na Fidži [55] pomocí pluginu "Analyze Particles".
2.1.9.Microarray a GO Term Analysis
Byly shromážděny vzorky z pěti nezávislých replikátů s přibližně {{0}}denními červy za podmínek a RNA byla extrahována a vložena na čip Affymetrix. Nezpracovaná mikročipová data ve formátu CEL byla analyzována pomocí softwaru R (verze 3.4.2) (R Foundation, Vídeň, Rakousko) a Bioconductor (The Bioconductor Project, Bioconductor je open source a otevřený vývoj) [57]. Korekce pozadí, normalizace a výpočet exprese byly provedeny pomocí balíčku oligo58] a metody RMA. Pro kontrolu kvality pole byl použit balíček arrayQualityMetrics 3.34.{16}} [59]. Z důvodu měření kvality byl vzorek ahr{11}}C5 vyloučen z další analýzy. Diferenciálně exprimované geny byly identifikovány pomocí balíčku limma a lineárního modelu a moderované t-statistiky pomocí FDR pro testování vícenásobných srovnání [6{{20}}]. Byla použita p-hodnota 0,1. Diferenciálně exprimované geny byly analyzovány pro obohacení termínu genové ontologie pomocí Cytoscape (verze 3.6.0) (The Cytoscape Consortium, nezávislá nezisková organizace)[61] s pluginem ClueGo (verze 2.5.0) (Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Paříž, Francie)[62]. K datům microarray lze přistupovat prostřednictvím Gene Expression Omnibus přístupové číslo. GSE195769.
2.1.10. Kvantifikace ROS
MtROS byly detekovány u živých wt a ahr{0}} mutantních červů pomocí MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Dreieich, Německo). Hlístice byly synchronizovány kladením vajíček na IPTG destičky s použitím bakterií HT115(L4440) jako potravy. Poté, o 48 hodin později, bylo 50 zvířat ve stádiu L4 přeneseno na čerstvě připravené 10μM mitoSOX Red destičky naočkované UV-zabitým HT115 (L4440). Červi byli inkubováni ve tmě při 20 stupních. Po 16 hodinách inkubace byly přemístěny na nové NGM plotny natřené živým HT115 (L4440) po dobu 1 hodiny, aby se odstranilo zbytkové barvivo ze střev. Pro zobrazování byly háďátka připevněna na 2% agarózová podložní sklíčka, anestetizována přidáním 10 mM levamisolu a fixována ProLongTM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Německo). Snímky byly pořízeny okamžitě mikroskopem Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Inc., Kolín nad Rýnem, Německo) s použitím objektivu 40x a filtru DsRed. Poté byla ručně vybrána oblast hlavy červa a pomocí zobrazovacího softwaru Fij 55 byla vypočtena integrovaná intenzita.
2.1.11. Tetramethylrhodamin Ethyl Ester (TMRE) test
Pro hodnocení potenciálu mitochondriální membrány byly háďátka synchronizována kladením vajíček na IPTG destičky naseté bakteriemi HT115(L4440). V den experimentu byl TMRE (Invitrogen, Eugene, OR, USA) rozpuštěn v DMSO na koncentraci 5 mM a poté zředěn na 30 uM tepelně inaktivovaným HT115（L4440）） (30 min, 65 stupňů）). Na jednu destičku bylo přidáno celkem 150 ul tohoto roztoku a nechalo se sušit ve tmě po dobu přibližně 30 minut. Šedesát dospělých synchronních červů v 1, 3 nebo 5 dnech dospělosti bylo nabráno na připravené TMRE destičky a ponecháno na barvení absorbovat po dobu 2 hodin ve tmě při 20 stupních. Po obarvení byli červi přeneseni na IPTG destičky naočkované teplem inaktivovaným HT115(L4440) a inkubovány po dobu 1 hodiny ve tmě při 20 stupních, aby se odstranilo zbytkové barvivo ze střev.velikost penisu cistanchePro zobrazování bylo 10 hlístic namontováno na 2% agarózová podložní sklíčka, anestetizována přidáním 10 mM levamisolu a fixována ProLongM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Německo). Pro každý experimentální běh bylo připraveno 5 preparátů na skupinu. Snímky byly pořízeny okamžitě mikroskopem Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Kolín nad Rýnem, Německo) s použitím 2,5× objektivu a filtru DsRed. Intenzita fluorescence byla vypočtena pomocí Fiji [55].
2.1.12. Test rychlosti čerpání hltanu a motility
Hlístice N2 a CZ2485 byly synchronizovány bělením [63] a vajíčka byla ponechána přes noc na orbitálním protřepání (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3). Larvy L1 byly naneseny na NGM doplněné 1 mM IPTG a obsahující 0,1 procenta DMSO nebo 100 uM kurkuminu. Bakterie HT115（L4440） byly použity jako potrava. Mladí dospělí červi byli shromážděni pufrem M9, odstředěni (300 g x 3 minuty) a dvakrát promyti, aby se odstranily bakterie. Červi byli inkubováni s 0-1 mM H, O, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Německo) (100 červů/100 μl) po dobu 2 hodin za orbitálního třepání. Kontrolní červi byli inkubováni pouze s pufrem M9. Po 2 hodinách byli červi přemístěni na NGM doplněné 1 mM IPTG a obsahující 0,1 procenta DMSO nebo 100 uM kurkuminu a naočkováno bakteriemi HT115(L4440) jako potravou. Rychlost pumpování hltanu, hodnocená počítáním, kolikrát se koncový bulbus hltanu stáhl během 1 minutového intervalu (pumpy/min), a test motility, hodnocený počítáním počtu ohnutí těla (ohnutí těla/min) v Pufr M9 v intervalu 1 minuty byly hodnoceny o 2 až 20 hodin později.
2.1.13. Test akutní citlivosti na juglon
Háďátka N2 a CZ2485 byla synchronizována kladením vajíček na destičky NGM buď s DMSO nebo 100 uM kurkuminu. Destičky byly doplněny 1 mM IPTG a naočkovány bakteriemi HT115(L4440) nebo HT115(ugt-45) jako potravou. K vyhodnocení účinku kožní-1 RNAi byli červi synchronizováni kladením vajíček na DMSO nebo kurkuminové misky naseté bakteriemi HT115(L4440). Když hlístice dosáhly larválního stadia L4, byly přeneseny na 24 hodin na DMSO nebo kurkuminové misky naseté bakteriemi HT115 (skin{16}}). Dospělí červi 1. dne (25 červů) byli přemístěni na čerstvé NGM misky obsahující 200 μM Juglone (Merck, Darmstadt, Německo) a naočkovány 25 μl 10× koncentrované kultury bakterií přes noc. Přežití červů při oxidativním stresu vyvolaném juglonem bylo kontrolováno pohybem vyvolaným dotykem každou hodinu, po dobu 6 hodin. Zvířata byla hodnocena jako mrtvá, když nereagovala na dotek trsátkem z platinového drátu. Hlístice vysušené na stěně byly cenzurovány. Byl hodnocen počet mrtvých a cenzurovaných zvířat a pro analýzu přežití byla použita online aplikace pro analýzu přežití OASIS2 [53].
2.1.14. Kvantifikace GST-4:Intenzita GFP
NV35wt a NV35a byly synchronizovány kladením vajíček na NGM destičky doplněné 1 mM IPTG a obsahující 0,1 procenta DMSO nebo 100 uM kurkuminu. Bakterie HT115（L4440）,HT115(ugt-45) a HT115(kůže-7) byly použity jako potrava. Pro vizualizaci fluorescence GFP byli dospělí červi 1. dne anestetizováni 10 mM roztokem hydrochloridu levamisolu a upevněni na 2% agarózové polštářky. Snímky byly okamžitě pořízeny mikroskopem Zeiss Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Kolín nad Rýnem, Německo), 2,5× zvětšení) a poté analyzovány pomocí softwaru CellProfiler (tým projektu CellProfiler, Cimini Lab na Broad Institute of MIT a Harvard, MA, USA). Stručně řečeno, snímky byly zpracovány pomocí potrubí k segmentování červů v každém snímku z mikroskopie ve světlém poli a jejich oddělení od pozadí. Poté byla měřena integrovaná intenzita GFP na červa.
2.1.15. Semikvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) u C. elegans
Byly odebrány vzorky ze 3 nezávislých replikátů s přibližně 1000 3-denními červy za podmínek a byla extrahována RNA. Po promytí a eluci byl obsah RNA kvantifikován spektrofotometrií a 1-2 ug RNA bylo použito pro syntézu cDNA (Omniscript RT Kit (Qiagen, Hilden, Německo).cistanche prášekPáry primerů jsou uvedeny v tabulce S1. Pro qPCR v reálném čase byla cDNA zředěna v poměru 1:2 0 v 10 mM TRIS (pH 8,0). Pro reakci byla použita sada qPCR Green Core kit (Jena Biosciences, Jena, Německo)) nebo sada GoTaq⑧ qPCR (Promega, Walldorf, Německo). Vzorky byly měřeny v cykléru MyiQ2 (BioRad, Feldkirchen, Německo) a exprese každého vzorku byla měřena duplicitně na stejné vícejamkové destičce. Exprese byla vypočtena relativně k referenčním genům act-1 a CDC-42 pomocí softwaru iO5. Všechna shromážděná data byla umožněna pro genovou studii podle uživatelských instrukcí BioRad a exprese byla vypočtena pomocí normalizované exprese (ddCr). Pro správnou kvantifikaci normalizované exprese byla přidána účinnost každé reakce páru primerů. Účinnost byla hodnocena s ředěním cDNA 1:20, 1:100, 1:500 a 1:2500. Z normalizovaných hodnot exprese se pro každý replikát vypočítal násobek změny ve srovnání s divokým typem.
2.2. Savčí buňky
2.2.1. Kultivace buněk Cos7
Buňky Cos7 (ATTC, #CRL-1651) byly kultivovány při 37 stupních a 5 procentech CO v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, Německo) s 1 procentem pyruvátu, 1 procentem Glutamaxu a 1 0 procent fetálního bovinního séra (FBS) (Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Německo） a další penicilin（10.000 jednotek/ml）/streptomycin （10.000 ug/ Jakmile buňky vytvořily splývající buněčný trávník, byly odděleny od základny pomocí 0,05 procenta trypsinu/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, Německo).
2.2.2. Transfekční plazmidy
Pro transfekci buněk Cos7 jsme použili následující plazmidy: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16,pcDNA3-AhA-1-VP16,pcDNA3-AhR -1(45. července)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. Plazmidy jsou popsány v Larigot et al. (předloženo spolu s touto studií). Plazmid p1A1-FL nese XRE-indukovatelnou luciferázu, Perl-TK nese luciferázu renilla a pcDNA3-Ahr-1-VP16 a pcDNA3-AhA{{24 }}VP16 nesou sekvence pro expresi C.elegans AHR-1 a AHA-1, v daném pořadí. Pro tuto studii jsme vytvořili pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16 místně cílenou mutagenezí plazmidu pcDNA3-Ahr-1-VP16 pomocí QuikChange II Site-Directed Souprava pro mutagenezi (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Následující pár primerů byl použit k vytvoření substituce L za A na L363 a substituce H za Q na H365 u AHR-1:LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3'andCGLBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCCTGCT}GALBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCCTGCT}GALBGGTCGTCTG4GCTGCC{101} Buňky '.Super-competent XL1-Blue byly transformovány získaným plazmidem pro amplifikaci. Plazmidová sekvence byla ověřena Sangerovým sekvenováním.
2.2.3. Přechodná transfekce buněk Cos7
24 hodin před transfekcí bylo 20,{2}} buněk/jamka nasazeno na 48-jamkovou destičku ve 400 ul DMEM (plus 10 procent FBS plus antibiotika) a inkubovány při 37 stupních. Buňky byly poté transfekovány následujícími koncentracemi plazmidu pomocí lipofektaminu 200 (Invitrogen, Eugene, OR, USA): p1A1-FL (244 ng/jamka), Phil-TK (36 ng/jamka), pcDNA3- AhA-1-VP16 (5 ng/jamka) a buď pcDNA3-VP16 (10 ng/jamka), pcDNA3-Ahr-1-VP16 (5 ng/jamka) nebo pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16 (5 ng/jamka), jak je popsáno v Larigot et al. (předloženo spolu s touto studií). Lipofetamin 2000 byl použit v koncentraci 1 ul/jamku a před použitím byl preinkubován s příslušnými plazmidy v DMEM po dobu 20 minut. Pro přechodnou transfekci byly buňky Cos7 inkubovány se směsí lipofectamine/plasmid for3hin DMEM (plus 10 procent FBS) bez antibiotik, aby se zabránilo toxicitě vyvolané antibiotiky. Poté bylo transfekční médium odstraněno a nahrazeno 400 ul/jamku DMEM（plus 10 procent FBS plus antibiotika）. Transfekované buňky byly inkubovány při 37 stupních. Na každé destičce nebyly 2 jamky buněk transfekovány a tak použity pro účely normalizace. 2.2.4.Ošetření buněk Cos7
Pro všechny sloučeniny byly připraveny zásobní roztoky v koncentracích 1000-krát vyšších, než je požadovaná koncentrace. Kurkumin (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo), benzo(a)pyren (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo), leflunomid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo) a lutein (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo) byly rozpuštěny v DMSO ( Carl Roth, Karlsruhe, Německo), zatímco resveratrol (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo) a rotenon (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Německo) byly rozpuštěny v ethanolu (Carl Roth, Karlsruhe, Německo). 24 hodin po transfekci bylo buněčné kultivační médium buněk nahrazeno buněčným kultivačním médiem obsahujícím příslušnou sloučeninu v ředění 1:100. Buňky byly ošetřeny po dobu 24 hodin před hodnocením aktivity luciferázy.
2.2.5. Luciferázový test (AhR aktivita)
Transkripční aktivita AhR byla hodnocena měřením aktivity luciferázy řízené XRE[64]. K tomu byl použit Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Wall Dorf, Německo). Po 24 hodinách působení byly buňky Cos7 dvakrát promyty PBS a poté lyžovány po dobu 15 minut při teplotě místnosti za použití pasivního lyzačního pufru obsaženého v soupravě Dual-Luciferase Reporter Assay. Celkem 20 μl lyžovaných buněk bylo umístěno do bílé 96-jamkové destičky a použito pro měření luminiscence. Substráty luciferin (LARII) a vanilka (Stop&cGlo) byly připraveny podle popisu výrobce. Vzorky byly naneseny na luminometr (EG&G Berthold microplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Německo) a substráty byly připojeny k systému hadiček luminometru. Nejprve bylo do každé jamky přidáno 65 ul LARII vzorku a byla změřena luminiscence produkovaná luciferázou světlušek, poté bylo přidáno 65 μl činidla Stop&clo a byla změřena luminiscence produkovaná luciferázou Renilla. Pro posouzení aktivity AhR z měření luminiscence jsme provedli následující následné zpracování kroky: Nejprve byla luminiscence netransfekovaných buněk odečtena od luminiscence každého vzorku pro korekci pozadí. V dalším kroku jsme normalizovali luminiscenci luciferázy na luminiscenci renilla stejného vzorku, abychom eliminovali rozdíly v rychlosti transfekce a buněk Další normalizační krok k buňkám transfekovaným pcDNA-VP16 byl proveden pro každou léčebnou skupinu, aby se odstranil AhR-indep. trvalé účinky na luciferázu řízenou XRE.
Tento článek je extrahován z Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants
